熟地黃的大麻素2型受體激動劑活性及對骨代謝的調控作用研究

胡思婧，練晨霞，張 奇，周 灝，史曉林，程 剛，張泉龍，趙琦明，張巧艷，趙 瑛，秦路平*

? 藥理與臨床 ?

熟地黃的大麻素2型受體激動劑活性及對骨代謝的調控作用研究

胡思婧1，練晨霞1，張 奇1，周 灝1，史曉林2，程 剛1，張泉龍1，趙琦明1，張巧艷1，趙 瑛3*，秦路平1*

1. 浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053 2. 浙江省新華醫院，浙江 杭州 310000 3. 咸陽市中心醫院，陜西 咸陽 712000

探究熟地黃的大麻素2型受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）激動活性及其對骨代謝的調控作用。采用雙熒光素酶報告基因建立CB2R調節劑篩選體系；分別給予熟地黃提取物或CB2R選擇性激動劑HU308或CB2R反向激動劑AM630處理，采用CCK-8法測定成骨細胞和破骨細胞的增殖活性；采用磷酸苯二鈉法測定成骨細胞堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）和破骨細胞抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）的活性；采用流式細胞儀測定成骨細胞的細胞周期；采用ALP染色觀察成骨細胞分化；采用茜素紅染色觀察成骨細胞骨礦化結節的形成；采用TRAP染色觀察破骨細胞數目；采用羅丹明-鬼筆環肽染色鏡觀察破骨細胞F-肌動蛋白（F-actin）環的結構和形態；采用Western blotting檢測CB2R及骨代謝相關蛋白的表達。500 μg/mL熟地黃顯著升高HEK293-CB2R細胞CB2R表達（＜0.001），抑制forskolin刺激的HEK293-CB2R細胞中環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）的產生，并且其對CB2R的激動活性可被AM630逆轉（＜0.001）。500 μg/mL熟地黃顯著促進成骨細胞增殖（＜0.001），升高ALP活性（＜0.001），促進骨礦化結節形成，上調CB2R及骨形成相關蛋白的表達（＜0.05、0.01、0.001），抑制p38的表達（＜0.05）；抑制破骨細胞形成分化，降低TRAP活性（＜0.001），抑制F-actin環的形成，下調CB2R、p-p38和骨吸收相關蛋白的表達（＜0.05、0.001）；熟地黃對成骨細胞和破骨細胞的作用可被AM630逆轉（＜0.05、0.01、0.001）。熟地黃具有特異性的CB2R激動活性，并可通過CB2R調控成骨細胞和破骨細胞的功能。

熟地黃；大麻素2型受體激動劑；雙熒光素酶報告基因；成骨細胞；破骨細胞；地黃苷D

大麻素2型受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）為G蛋白偶聯受體超家族成員，參與炎癥、纖維化、疼痛及骨代謝等多種生物活性的調節[1]。研究發現，CB2R激動劑如HU308及其對映體HU433參與成骨細胞和破骨細胞功能的調節，可減緩去卵巢誘導的大鼠骨丟失[2]；CB2R激動劑4-喹諾酮-3-羧酰胺（4-quinolone-3-carboxamides，4Q3C）可減緩膠原誘導關節炎（collagen induced arthritis，CIA）小鼠炎性細胞浸潤、破骨細胞數量及骨骼組織破壞，CB2R反向激動劑AM630可以逆轉4Q3C對CIA小鼠骨骼的保護作用。因此，CB2R激動劑具有潛在的調節骨代謝的作用，可用于骨丟失相關疾病的治療[3-5]。大麻中含有多種結構類型的CB2R激動劑，同時也對CB1R有激動作用，可導致精神樣不良反應[6]。因此，從大麻以外的藥用植物及中藥中發現無精神樣不良反應的CB2R調節劑，并研究其對骨代謝的調控作用，對于闡明植物藥及中藥抗骨質疏松的作用機制、發現結構新穎的抗骨質疏松先導化合物具有重要意義。

熟地黃為玄參科植物地黃(Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.的干燥根的炮制品，具有補血滋陰、益精填髓等功效，用于遺精、腰膝酸軟、消渴、淋證等的治療[7]。現代研究表明熟地黃含有環烯醚萜類、紫羅蘭酮類、苯乙醇苷類、三萜類、黃酮類及脂肪酸脂類等多種結構類型的化學成分，具有抗骨質疏松、抗氧化、抗腫瘤、調節免疫和降血糖等多種生物活性[8-11]。本課題組前期建立了雙熒光素酶標記的CB2R調節劑篩選模型，對熟地黃等16味中藥進行了篩選，發現熟地黃具有特異性的CB2R激動活性。因此，本研究在系統探索熟地黃提取物的CB2R激動劑活性的基礎上，觀察其基于CB2R激動活性的對成骨細胞和破骨細胞功能的調控作用，為熟地黃抗骨質疏松機制的深入研究及從中獲得以CB2R為靶點的抗骨質疏松先導化合物提供科學的依據。

1 材料

1.1 動物

SPF級3日齡Wistar大鼠，購自浙江中醫藥大學實驗動物研究中心，實驗動物許可證號SCXK（浙）2021-0361。動物飼養于室溫（25±2）℃、濕度45%～50%的環境中，自由進食飲水。動物實驗嚴格遵守浙江中醫藥大學倫理規定（批準號109653-143166）。

1.2 細胞

小鼠單核巨噬細胞RAW264.7（目錄號TCM13）、人類胚胎腎細胞HEK293（目錄號GNHu43）購自中國科學院上海生科院細胞資源中心。

1.3 藥材

熟地黃（批號200501）購自浙江中醫藥大學飲片有限公司，經浙江中醫藥大學藥學院秦路平教授鑒定為玄參科植物地黃(Gaetn.) Libosch. ex Fisch. et Mey.的干燥根的炮制品。

1.4 藥品與試劑

總RNA提取試劑盒（批號DP419）購自天根生化科技有限公司；NovoScript逆轉錄試劑盒（批號E047-01B）、Novo Start SYBR qPCR Super MixturecDNA擴增試劑盒（批號E096-01A）購自Novoprotein公司；pIRES2-EGFP、pGL4.29［luc2P/CRE/Hygro］、pRL-TK9由上海生工生物工程有限公司合成；DMEM高糖培養基（批號8117161）購自美國Gibco公司；α-MEM培養基（批號TBD41061）購自天津灝洋生物制品科技有限公司；Lipofectamine 3000轉染試劑（批號2369247）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；磷酸酶蛋白酶抑制劑（批號P1045）、Western及IP裂解液（批號P0013J）、5×上樣緩沖液（批號P0015）、脫脂奶粉（批號P0216）、Western一抗稀釋液（批號P0023A）、牛血清白蛋白（批號ST023）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010）、30%丙烯酰胺溶液（批號ST003）、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8，批號ST788）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8，批號ST768）、過硫酸銨（批號ST005）、TEMED（批號ST728）、DAPI染色液（批號061819191015）、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（批號121820210416）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）試劑盒（批號121820210416）購自上海碧云天生物技術有限公司；核因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL，批號0615612F1322）購自杭州聯科生物技術股份有限公司；Tris（批號A501492-0500）、甘氨酸（批號A502065-0500）購自上海生工生物科技有限公司；胎牛血清（批號10091-148）、腺苷酸環化酶激活劑forskolin（批號S1612）、CB2R反向激動劑AM630（批號GC10147）、青霉素-鏈霉素（批號15140-122）購自美國GLPBIO公司；人環磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）檢測試劑盒（批號MM-0006H1）購自酶免生物有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（批號SKK0946）購自日本Wako公司；ECL顯色液（批號1925901）購自美國Millipore公司；CCK-8增殖檢測試劑盒（批號ab228554）、CB2R選擇性激動劑HU308（批號ab254226）、成骨細胞特異基因Osterix兔多克隆抗體（批號ab22552）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）兔單克隆抗體（批號ab214050）、p38兔單克隆抗體（批號ab182453）、I型膠原蛋白（type I collagen，COL-1）兔單克隆抗體（批號ab138492）購自英國Abcam公司；基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）兔多克隆抗體（批號BA2202）購自武漢博士德生物工程有限公司；成骨特異性轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2）兔多克隆抗體（批號12556S）、活化T細胞核因子1（nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1，NFATc1）兔單克隆抗體（批號8032S）、c-Fos兔單克隆抗體（批號2250S）、p-p38兔單克隆抗體（批號4511S）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）兔多克隆抗體（批號AF7021）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號S0001）購自美國Affinity公司。

1.5 儀器

RE-2000A型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；XP105型電子天平（瑞士梅特勒-托利多儀器公司）；智能數顯多功能油水?。柫x市予華儀器有限責任公司）；ORW1.5S-5E型微波動態萃取設備（南京澳潤微波科技有限公司）；離心機、低溫高速離心機、二氧化碳培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）；雙垂直電泳儀、凝膠成像系統、熒光定量PCR儀器（美國Bio-Rad公司）；多功能酶標儀（美國Bio-Tec公司）；熒光相差倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 細胞培養

成骨細胞提取自1日齡Wistar大鼠的顱骨，用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的α-MEM培養基，HEK293細胞和RAW264.7細胞用含10%胎牛血清及1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養基，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，待細胞融合至80%左右進行傳代。

2.2 CB2R雙熒光素酶篩選體系的建立

使用Primer Express軟件（Application Biosystems）設計標志基因的引物對，以基因作為內參，合成Eco RI黏結端和Bam HI黏結端的單鏈ERE齊聚物，并對其進行退火處理，形成雙鏈分子。Eco RI和Bam HI雙酶切分離雙鏈寡聚體，用T4DNA連接酶連接，克隆到pIRES2-EGFP載體上熒光素酶編碼區的上游。

將5×105個HEK293細胞接種于60 mm培養皿中，培養12 h后，用PBS緩沖液洗滌細胞，然后用Lipofectamine 3000試劑進行轉染?；旌弦褐泻袡z測報告質粒、編碼熒光素酶的對照報告質粒和效應質粒，轉染質粒比例pIRES2-EGFP-CB2R∶pGL4.29 [luc2P/CRE/Hygro]∶pRL-TK＝2 μg∶10 μg∶1 μg。轉染24 h后，更換為含G418（800 μg/mL）和潮霉素（400 μg/mL）的培養基，3 d更換1次培養基，2周左右得到穩定轉染的細胞株。隨機選取96孔板中的60個孔，30個孔為一組，每孔接種5×103個HEK293細胞后，分別加入含有1 μmol/Lforskolin的培養基作為陽性對照，含0.1% DMSO空白培養液作為空白對照，孵育6 h后測量雙熒光素酶的發光值，以相對熒光素酶發光值即螢火蟲熒光素酶化學發光值/海腎熒光素酶化學發光值，表示細胞CB2R的表達水平。高通量篩選系統定量評價指標包括信號本地比、信號窗、信噪比、信號本底變異系數、Z’因子等，以確保其高效、準確地應用于高通量數據收集。

2.3 熟地黃提取物的制備及其對CB2R的激動活性分析

2.3.1 熟地黃提取物的制備 取5 g熟地黃粉末于250 mL圓底燒瓶中，加入50 mL純水，加熱回流1 h，傾出上層清液，再加入50 mL純水加熱回流1 h，合并煎液后，用布氏漏斗濾過，將濾液減壓濃縮定容至10 mL，得到生藥量為0.1 g/mL的水提取物。采用《中國藥典》2020版一部中熟地黃質量標準項下方法測定指標性成分含量，熟地黃提取物中地黃苷D質量分數為0.15%。

2.3.2 熟地黃提取物對CB2R的激動作用分析 將HEK293-CB2R細胞以5×104個/孔接種于6孔板，細胞貼壁后，饑餓培養24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物處理6 h，測定雙熒光素酶發光值。

2.3.3 對CB2R激動作用的特異性檢測 將HEK293-CB2R細胞以5×104個/孔接種于6孔板，細胞貼壁后，饑餓培養24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物，同時不加或者添加1 μmol/LCB2R反向激動劑AM630處理細胞6 h，測定雙熒光素酶化學發光值。

2.3.4 細胞內cAMP水平的測定 按“2.3.3”項下方法處理細胞，培養結束后，加入100 μL IP裂解液，裂解30 min，收集細胞上清，按照試劑盒說明書測定細胞內cAMP水平。

2.4 熟地黃提取物對成骨細胞的作用研究

2.4.1 CCK-8檢測細胞活性 將大鼠顱骨細胞以1×104個/孔接種于96孔板，37 ℃培養24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物和1 μmol/L HU308處理細胞；在考察CB2R依賴性時，用1 μmol/L CB2R反向激動劑AM630預處理30 min，再用500 μg/mL的熟地黃提取物或1 μmol/L HU308處理細胞。培養48 h后，加入10 μL CCK-8溶液培養30 min，測定450 nm處的吸光度（）值。

2.4.2 ALP活性測定和染色 大鼠顱骨細胞按“2.4.1”項下方法處理，培養7 d后，按照試劑盒說明書測定ALP活性。棄去培養液，用預冷的PBS沖洗細胞2次，加入ALP染色液，37 ℃染色30 min，棄去染液，蒸餾水沖洗3次，于顯微鏡下觀察拍照。

2.4.3 成骨細胞骨礦化結節的誘導及茜素紅ARS染色 大鼠顱骨細胞按“2.4.1”項下方法處理，培養14 d后，用預冷的PBS沖洗細胞2次，于3.7%甲醛中固定10 min，用含40 mmol/L茜素紅的ARS染料（pH 4.2）染色10 min，于光學顯微鏡下觀察成骨細胞骨礦化結節的形態和數目。

2.4.4 成骨細胞周期檢測 大鼠顱骨細胞按“2.4.1”項下方法處理，培養7 d后，藥物處理后的成骨細胞離心5 min，棄去上清液，用預冷的PBS洗滌細胞1次，將細胞重懸于1 mL細胞周期檢測試劑A和10 μL試劑B中，渦旋10 s，室溫孵育30 min，采用流式細胞儀測定細胞周期。

2.5 熟地黃提取物對破骨細胞的作用研究

2.5.1 CCK-8檢測細胞活性 將RAW264.7細胞以1×104個/孔接種于96孔板，37 ℃培養24 h，用500 μg/mL的熟地黃提取物和1 μmol/L HU308處理細胞；在考察CB2R依賴性時，用1 μmol/L CB2R反向激動劑AM630預處理30 min，再用500 μg/mL的熟地黃提取物和1 μmol/L HU308處理細胞。培養48 h后，按照CCK-8試劑盒說明書測定細胞活性。

2.5.2 TRAP活性測定和染色 將RAW264.7細胞以1×104個/孔接種于96孔板，細胞貼壁后，用25 ng/mL的RANKL誘導，使其分化為破骨細胞，按“2.5.1”項下方法處理細胞，培養3 d后，以硫代巴比妥鈉洗滌細胞2次，每孔加入10 μL 0.1% Triton X-100反應10 min，加入TRAP反應液100 μL，37 ℃孵育30 min，每孔加入100 μL 1 mol/L NaOH溶液終止反應，測定405 nm處的值。用PBS洗滌細胞，每孔加50 μL 4%多聚甲醛固定20 min，然后加入50 μL 0.2% Triton X-100透化5 min，按TRAP染色試劑盒說明書進行染色，于顯微鏡下觀察拍照。

2.5.3 破骨細胞F-肌動蛋白（F-actin）環的免疫熒光染色 將5×104個RAW264.7細胞接種于共聚焦培養皿（直徑 35 mm）中，培養24 h，按“2.5.1”項下方法處理5 d，用4%多聚甲醛固定30 min，用5 g/mL鬼筆環肽在37 ℃下染色40 min，用PBS洗滌，再用4′,6′-二氨基-2-苯基吲哚在室溫下染色10 min，于激光共聚焦顯微鏡下觀察破骨細胞的F-actin環結構。

2.6 Western blotting檢測CB2R、成骨相關蛋白和破骨相關蛋白表達

按“2.4.1”項和“2.5.1”項下方法處理后，提取成骨細胞或破骨細胞總蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后，分別加入CB2R抗體（1∶500）、GAPDH抗體（1∶1000）、成骨相關蛋白抗體（1∶1000）和破骨相關蛋白抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；加入相應二抗（1∶1000），37 ℃孵育1 h，用MONAD QuickChemi 5100化學發光成像系統分析條帶。

2.7 統計分析

3 結果

3.1 熟地黃提取物的CB2R激動活性分析

本研究建立了一種基于雙熒光素酶的高通量篩選模型來檢測CB2R和熟地黃提取物之間的相互作用。應用構建的HEK293-CB2R細胞體系評價其篩選CB2R調節劑的性能，發現信號本底值為4.8，信噪比為31.1，表明本底水平對高通量篩選的結果無顯著影響。forskolin陽性對照組和DMSO空白對照信號平均值和標準偏差分別為（63.3±4.4）%和（13.1±1.6）%，信號窗為50.2%，信號本底變異系數分別為7.0%和7.6%，Z’因子為0.64，表明本模型性能較好，具有較高的可行性和可靠性。

為了驗證該系統在篩選CB2R激動劑方面的可行性，檢測了CB2R激動劑HU308處理的HEK293-CB2R細胞的相對熒光素酶活性，如圖1-A所示，與只轉染空載體的HEK293細胞相比，HU308顯著增加了相對熒光素酶的活性（＜0.001），1 μmol/L HU308作用6 h后相對熒光素酶發光值最高。本課題組前期利用雙熒光素酶篩選模型對16種中藥提取物進行篩選后，發現熟地黃提取物的CB2R激動活性可能具有特異性。如圖1-B所示，100、250、500、750、1000 μg/mL熟地黃提取物作用于HEK293-CB2R細胞6 h后，以500 μg/mL熟地黃提取物作用效果最明顯。因此，后續研究中，用500 μg/mL熟地黃提取物觀察其CB2R激動活性及對骨代謝的調控作用。如圖1-C所示，1 μmol/L HU308和500 μg/mL熟地黃提取物均能顯著上調HEK293-CB2R細胞CB2R蛋白表達（＜0.001）。

A-HU308對HEK293-CB2R細胞雙熒光素酶活性分析 B-熟地黃提取物對HEK293-CB2R細胞CB2R雙熒光素酶活性的影響 C-熟地黃提取物對HEK293-CB2R細胞CB2R蛋白表達的影響 D-AM630對HU308和熟地黃提取物在HEK293-CB2R細胞中CB2R激動活性的逆轉作用 E-熟地黃提取物對HEK293-CB2R細胞cAMP的抑制作用 與對照組比較：###P＜0.001；與無AM630的同組比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

進一步用CB2R反向激動劑AM630確證熟地黃提取物CB2R激動活性的特異性，如圖1-D所示，用AM630預先處理HEK293-CB2R細胞30 min，可以逆轉HU308和熟地黃提取物對HEK293-CB2R細胞CB2R的激動作用（＜0.001），表明熟地黃具有特異性的CB2R激動活性。CB2R通過與G蛋白偶聯抑制細胞中腺苷酸環化酶（adenylate cyclase，AC）的活性，抑制細胞cAMP的產生。本研究用forskolin刺激HEK293- CB2R細胞，使細胞內cAMP含量增加，再用CB2R激動劑HU308或熟地黃提取物處理細胞，測定細胞內cAMP含量。如圖1-E所示，HU308和熟地黃提取物均能夠抑制forskolin刺激的HEK293-CB2R細胞中cAMP的產生，其半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）值分別為60.57 nmol/mL和（482.3±59.9）μg/mL。

3.2 熟地黃以CB2R為靶點促進成骨細胞的骨形成作用

如圖2所示，CB2R選擇性激動劑HU308和熟地黃提取物可促進成骨細胞的增殖、ALP活性和骨礦化結節的形成（＜0.001）。熟地黃提取物作用成骨細胞后，G1期細胞比例降低，S期及G2期細胞比例增加，表明熟地黃提取物可能通過驅動細胞周期從G1期過渡到S期及G2期來促進成骨細胞的增殖（圖2-D）。CB2R反向激動劑AM630能降低熟地黃提取物對成骨細胞骨形成的促進作用（＜0.01、0.001），逆轉熟地黃提取物對成骨細胞周期的調節作用，表明熟地黃提取物在一定程度上以CB2R相關的方式發揮增強成骨細胞的骨形成作用。

A-成骨細胞增殖 B-成骨細胞ALP活性 C-成骨細胞ALP染色 D-成骨細胞細胞周期分析 E-成骨細胞骨礦化結節的茜素紅染色 a-對照組 b-HU308組 c-HU308＋AM630組 d-熟地黃提取物組 e-熟地黃提取物＋AM630組 與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與無AM630的同組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 熟地黃提取物對成骨細胞CB2R及骨形成相關蛋白表達的影響

如圖3所示，熟地黃提取物和HU308顯著增加成骨細胞CB2R的表達（＜0.01、0.001），AM630預處理可以降低其對成骨細胞CB2R蛋白表達的促進作用（＜0.01、0.001）。熟地黃提取物和HU308可顯著上調成骨細胞骨形成關鍵蛋白COL-1、OPN、Runx2和Osterix的表達（＜0.05、0.01、0.001），AM630預處理能夠逆轉熟地黃提取物和HU308對成骨細胞關鍵蛋白表達的上調作用（＜0.05、0.01、0.001）。CB2R與p38/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路聯系密切，熟地黃提取物和HU308可顯著降低成骨細胞中p38的表達（＜0.05），AM630預處理后可以逆轉熟地黃提取物和HU308對成骨細胞p38表達的影響（＜0.05、0.01）。

圖3 熟地黃提取物對成骨細胞CB2R及骨形成相關蛋白表達的影響(, n = 3)

3.4 熟地黃提取物以CB2R為靶點抑制破骨細胞形成和分化的作用

如圖4-A～C所示，HU308和熟地黃提取物作用72 h對RAW264.7細胞的活性沒有顯著的影響，但可顯著抑制由RAW264.7細胞誘導的破骨細胞中TRAP酶的活性（＜0.001），減少TRAP染色陽性破骨細胞的數目。

F-actin環是破骨細胞中形成的微管和微絲結構，在骨礦物質基質的密封區形成和骨吸收中發揮關鍵作用。如圖4-D所示，HU308和熟地黃提取物處理RAW264.7細胞分化的破骨細胞5 d后，熒光顯微鏡下可見破骨細胞F-actin環的厚度變薄，結構不完整。CB2R反向激動劑AM630可顯著降低熟地黃對破骨細胞TRAP活性及其形成分化的抑制作用（＜0.001），逆轉其對破骨細胞F-actin環形成的抑制作用。

A-RAW264.7細胞的增殖 B-破骨細胞TRAP活性 C-破骨細胞TRAP酶染色（紅色箭頭表示成熟的破骨細胞） D-破骨細胞F-actin環染色（紅色箭頭表示破骨細胞的F-actin環）

3.5 熟地黃提取物對破骨細胞CB2R及骨吸收相關蛋白表達的影響

如圖5所示，熟地黃提取物可顯著增加破骨細胞CB2R的表達（＜0.05），AM630能夠逆轉其對破骨細胞CB2R表達的激動作用（＜0.001）。NFATc1和c-Fos是破骨細胞形成分化的關鍵轉錄因子，MMP9是破骨細胞分泌的降解骨基質的關鍵蛋白酶。熟地黃提取物顯著抑制破骨細胞MMP9、NFATc1和c-Fos的表達及p38的磷酸化水平（＜0.05、0.001），AM630能夠逆轉其對破骨細胞內NFATc1、MMP9、c-Fos及p-p38表達的抑制作用（＜0.05、0.01）。

圖5 熟地黃提取物對破骨細胞CB2R及骨吸收相關蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

本研究應用穩定、可靠的雙熒光素酶報告基因的CB2R調節劑篩選體系分析了熟地黃提取物對CB2R的特異性激動活性及其對成骨和破骨細胞功能的調節作用，發現熟地黃對CB2R具有特異的激動作用，可促進成骨細胞的增殖、ALP活性、骨礦化結節形成及骨形成關鍵蛋白的表達，抑制破骨細胞的形成分化、TRAP活性及骨吸收關鍵蛋白的表達，并且熟地黃對成骨細胞和破骨細胞功能的調節作用可被CB2R反向激動劑AM630逆轉，表明熟地黃可能以CB2R為靶點發揮調控骨代謝的作用。

本研究應用轉染CB2R的HEK293細胞篩選具有CB2R激動活性的中藥，并通過在僅轉染EGFP的HEK293細胞及應用CB2R反向激動劑明確熟地黃提取物對CB2R的激動活性的特異性。同時，考慮到激活CB2R可抑制AC活性導致細胞內cAMP的水平降低，通過觀察熟地黃提取物對轉染CB2R的HEK293細胞內cAMP水平的抑制作用，發現其抑制細胞內cAMP的IC50值為（482.3±59.9）μg/mL，進一步確證了熟地黃的CB2R激動活性。

成骨細胞是體內參與骨形成的功能細胞，可表達CB2R。CB2R選擇性激動劑如HU308等也表現出確切的調節成骨細胞功能的作用[12]。研究發現，CB2R激動劑β-石竹烯呈劑量相關性顯著增加骨髓細胞誘導的成骨細胞的礦化，抑制骨髓細胞向脂肪細胞的分化[13]。CB2R部分激動劑厚樸酚能夠保護MC3T3-E1成骨細胞免受抗霉素A的細胞毒作用，促進成骨細胞增殖、ALP活性及骨基質礦化[14]。本研究發現熟地黃提取物可通過激活CB2R調控成骨細胞CB2R/p38通路，調節細胞周期來促進成骨細胞的增殖、礦化及骨形成相關蛋白的表達，CB2R反向激動劑AM630可以逆轉熟地黃提取物對成骨細胞的作用，表明熟地黃提取物通過激活CB2R抑制p38信號通路促進成骨細胞的增殖與礦化和骨形成作用。

破骨細胞是唯一具有骨吸收活性的功能細胞，CB2R激動劑直接作用于破骨細胞，抑制其形成、分化和骨吸收作用。CB2R部分激動劑甲基厚樸酚可顯著抑制RANKL誘導的多核破骨細胞的形成和破骨細胞F-actin環的形成，抑制破骨細胞c-Fos、NFATc1及p38相關通路的激活[15]；CB2R激動劑樺木酸顯著抑制破骨細胞F-actin環的形成，進而抑制破骨細胞性骨吸收[16]。本研究發現熟地黃提取物能夠減少RANKL誘導的破骨細胞的數量、破骨細胞的分化及F-actin環的形成，降低破骨細胞特異性蛋白MMP9、NFATc1及c-Fos的表達，抑制破骨細胞CB2R的表達和p38的磷酸化，CB2R反向激動劑AM630可逆轉熟地黃提取物對破骨細胞的作用，表明熟地黃提取物通過激活CB2R，干預p38相關通路，降低p38的磷酸化水平，從而抑制破骨細胞的形成與分化和骨吸收活性。

熟地黃為抗骨質疏松中藥方劑中使用頻率最高的中藥，含有環烯醚萜苷、苯乙醇苷、紫羅蘭苷及脂肪酸類成分，對絕經后骨質疏松、糖尿病性骨質疏松、老年性骨質疏松及糖皮質激素誘導的骨質疏松癥均有良好的防治作用[17]。研究發現，熟地黃中環烯醚萜苷類成分梓醇通過蛋白酪氨酸激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導轉錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）途徑促進人骨髓間充質干細胞向成骨細胞分化，在顱骨缺損的去卵巢模型大鼠中可促進骨骼再生和血管形成[18-19]；苯丙素苷類成分毛蕊花糖苷能夠抑制RANKL誘導的RAW264.7細胞向破骨細胞分化，抑制成熟破骨細胞的骨吸收，并可以減輕去卵巢誘導的骨丟失[20]。本研究發現，熟地黃提取物可通過CB2R調控成骨細胞和破骨細胞的功能，表明熟地黃通過多成分、多靶點和多途徑發揮調控骨代謝的作用。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Agonistic activity ofon cannabinoid receptor 2 and its regulatory effects on bone metabolism

HU Si-jing1, LIAN Chen-xia1, ZHANG Qi1, ZHOU Hao1, SHI Xiao-lin2, CHENG Gang1, ZHANG Quan-long1, ZHAO Qi-ming1, ZHANG Qiao-yan1, ZHAO Ying3, QIN Lu-ping1

1. School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2. Zhejiang Xinhua Hospital, Hangzhou 310000, China 3. Xianyang Central Hospital, Xianyang 712000, China

To investigate the agonistic activity of Shudihuang (, RRP) on cannabinoid receptor 2 (CB2R) and its regulatory effects on bone metabolism.The CB2R regulator screening system was established by using double luciferase reporter gene. After treatment with RRP extract or CB2R selective agonist HU308 or CB2R inverse agonist AM630, the proliferation of osteoblasts and osteoclasts was detected by CCK-8. The activities of alkaline phosphatase (ALP) in osteoblasts and tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) in osteoclasts were determined by disodium phenylphosphate method. The cell cycle of osteoblasts was determined by flow cytometry. The osteoblastic differentiation was observed by ALP staining. Alizarin red staining was used to observe the formation of bone mineralized nodules in osteoblasts. The number of osteoclasts was observed by TRAP staining. The structure and morphology of F-actin ring in osteoclasts were stained with rhodamine-phalloidin and observed with laser confocal microscopy. The expressions of CB2R and related proteins with bone metabolism were detected by Western blotting.500 μg/mL RRP significantly increased CB2R expression in HEK293-CB2R cells (< 0.001), inhibited the production of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in HEK293-CB2R cells stimulated by forskolin, and its agonistic activity on CB2R could be reversed by AM630 (< 0.001). 500 μg/mL RRP significantly promoted the proliferation of osteoblasts (< 0.001), increased the activity of ALP (< 0.001), promoted the formation of bone mineralized nodules, and up-regulated the expressions of CB2R and bone formation-related proteins (< 0.05, 0.01, 0.001), inhibited the expression of p38 (< 0.05); 500 μg/mL RRP inhibited the formation and differentiation of osteoclasts, decreased TRAP activity (< 0.001), inhibited the formation of F-actin ring, down-regulated CB2R, p-p38 and bone resorption-related proteins expressions (< 0.05, 0.001); The effect of RRP on osteoblasts and osteoclasts could be reversed by AM630 (< 0.05, 0.01, 0.001).RRP has specific CB2R agonistic activity, and can regulate the functions of osteoblasts and osteoclasts through CB2R.

; cannabinoid receptor 2 agonist; double luciferase reporter gene; osteoblast; osteoclast; rehmannioside D

R285.5

A

0253 - 2670(2022)20 - 6481 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.020

2022-07-27

國家自然科學基金資助項目（81973534）

胡思婧，女，博士研究生，研究方向為中藥活性成分及其作用研究。E-mail: hsj960321@163.com

趙 瑛，主管護師，主要從事臨床護理工作。E-mail: zhao13892919525@163.com

秦路平，博士，教授，主要從事中藥資源及品質評價研究。E-mail: lpqin@zcmu.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]