甘草次酸修飾細(xì)菌纖維素包載紫杉醇口服膠束的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

耿宇婷，張曉雪，康荷笛，趙修華*

甘草次酸修飾細(xì)菌纖維素包載紫杉醇口服膠束的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

耿宇婷1, 2, 3, 4, 5，張曉雪1, 2, 3, 4, 5，康荷笛1, 2, 3, 4, 5，趙修華1, 2, 3, 4, 5*

1. 東北林業(yè)大學(xué) 森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 東北林業(yè)大學(xué)化學(xué)化工與資源利用學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 東北林業(yè)大學(xué)林業(yè)生物制劑教育部工程中心，黑龍江 哈爾濱 150040 4. 黑龍江省林源活性物質(zhì)生態(tài)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040 5. 東北林業(yè)大學(xué)生物資源生態(tài)利用國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040

構(gòu)建一種以肝靶向分子甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）修飾的細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）兩親性納米載體用于紫杉醇（paclitaxel，PTX）口服給藥。以丁二酸酐（succinic anhydride，SA）作為連接臂，將甘草次酸與BC進(jìn)行偶連，獲得GA-BC），采用紅外光譜法、核磁共振氫譜法對(duì)合成產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征。通過(guò)超聲法制備GA-BC- PTX載藥膠束，再通過(guò)粒徑、ζ電位、透射電子顯微鏡及臨界膠束濃度的測(cè)定進(jìn)行表征，采用穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、體外釋放實(shí)驗(yàn)、MTT、細(xì)胞攝取、小鼠活體成像實(shí)驗(yàn)及斑馬魚(yú)安全性實(shí)驗(yàn)對(duì)該載藥系統(tǒng)進(jìn)行評(píng)價(jià)。成功構(gòu)建GA-BC載體，經(jīng)過(guò)紅外光譜、核磁共振氫譜等檢測(cè)證明偶連成功，GA-BC-PTX載藥膠束平均粒徑為（292.4±3.7）nm，表面電位為（?16.8±0.9）mV，載藥量為（17.89±0.61）%，包封率為（59.81±0.73）%，臨界膠束質(zhì)量濃度為0.063 mg/mL，呈均一球形，制備的載體穩(wěn)定性較好，體外釋放實(shí)驗(yàn)表明該載體能在胃腸道環(huán)境穩(wěn)定存在，MTT實(shí)驗(yàn)表明GA-BC-PTX膠束對(duì)HepG2細(xì)胞存在明顯抑制作用，并通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察流式細(xì)胞儀分析證明HepG2細(xì)胞對(duì)GA-BC膠束載尼羅紅的攝取明顯高于游離的尼羅紅。通過(guò)對(duì)小鼠活體成像證明GA-BC聚合物膠束具有肝靶向作用。通過(guò)斑馬魚(yú)卵安全性檢測(cè)證明當(dāng)GA-BC載體質(zhì)量濃度小于2 mg/mL時(shí)，聚合物載體基本不具有生物毒性。GA-BC載體具有良好的生物安全性和肝靶向作用，制備GA-BC- PTX口服載藥膠束可以有效抑制肝腫瘤細(xì)胞HepG2的生長(zhǎng)，為肝癌的靶向治療提供新的思路。

細(xì)菌纖維素；甘草次酸；兩親性自組裝膠束；肝靶向；口服遞送；紫杉醇

癌癥一直是嚴(yán)重威脅人類生命健康，其中肝癌更是我國(guó)高發(fā)惡性腫瘤之一[1]，大多數(shù)抗腫瘤藥物如紫杉醇水溶性差（＜1 μg/mL），口服生物利用度較低（＜2%）[2-3]，在體內(nèi)易被肝臟及免疫系統(tǒng)下清除，不能有效到達(dá)病變部位而引發(fā)全身性毒性等副作用[4]。為解決這一難題，本課題組提出將藥物包載于載體內(nèi)進(jìn)行輸送，因此，開(kāi)發(fā)一種高效低毒同時(shí)具有靶向性的載體具有重要意義。

近年來(lái)，將大分子聚合物改性為兩親性聚合物作為藥物遞送系統(tǒng)受到極大的關(guān)注，兩親性聚合物在水中可自組裝形成具有親水外殼和疏水核心的納米膠束，疏水區(qū)可用于包裹疏水藥物，不僅提高了藥物的水溶性，同時(shí)可以保護(hù)核內(nèi)藥物在生物介質(zhì)中的活性[5-7]。細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）又稱β-1,4-葡聚糖，是一種天然高分子聚合物[8]。因其低毒、生物相容性高，制成的醫(yī)用植入物僅引起輕度的炎癥反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于傷口敷料、人工血管和組織再生等[9-13]，同時(shí)其獨(dú)特的載藥特性具有極大的開(kāi)發(fā)前景。

甘草次酸（glycyrrhetinic acid，GA）是從傳統(tǒng)中藥甘草中提取的一種五環(huán)三萜化合物，是臨床上常用的保肝藥物，甘草次酸具有抗炎、抗病毒、和抗腫瘤作用[14-17]。并且研究發(fā)現(xiàn)肝臟具有甘草次酸特異性結(jié)合位點(diǎn)[18]，因此，本研究以甘草次酸作為疏水端同時(shí)作為載體的靶向基團(tuán)，丁二酸酐（succinic anhydride，SA）作為連接臂與親水端BC進(jìn)行接枝，制成具有優(yōu)良肝靶向的兩親性聚合物載體GA-BC，并負(fù)載紫杉醇（paclitaxel）制成口服膠束（GA-BC-PTX），并考察載體的靶向性及GA-BC- PTX初步抗癌效果，為將來(lái)肝癌的治療提供重要的依據(jù)和方向。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Nexus 670型傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；Avance III HD 500 MHz型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker公司；LD-900型超聲波細(xì)胞破碎儀，常州零點(diǎn)設(shè)備有限公司；Waters 1525型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特世公司；Zeta PALS型激光粒度儀，美國(guó)布魯克海文儀器有限公司；JEM-2100型透射電子顯微鏡（TEM），日本電子株式會(huì)社；F-7000型熒光分光光度計(jì)，日立高新技術(shù)公司；Infinite 200 Pro型多功能酶標(biāo)儀，上海帝肯貿(mào)易有限公司；高內(nèi)涵細(xì)胞成像儀，美國(guó)BioTek儀器公司；MoFlo Astrios EQ型流式細(xì)胞儀，美國(guó)貝克曼公司；Scientz-10N型冷凍干燥器，寧波新芝生物科技股份有限公司；IVIS Lumina Series III型活體成像系統(tǒng)，珀金埃爾默企業(yè)管理（上海）有限公司。

1.2 試劑

細(xì)菌纖維素，北京美科美生物公司代理Cellulose Lab；甘草次酸（批號(hào)A08GS156949，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；丁二酸酐（批號(hào)20180404）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；四丁基醋酸銨（實(shí)驗(yàn)室自制）；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl，批號(hào)D2121158）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；4-二甲氨基吡啶（DMAP，批號(hào)E1923045）購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、無(wú)水乙醇，分析純，購(gòu)自天津市富宇精細(xì)化工有限公司；紫杉醇（批號(hào)NF-20170316，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）購(gòu)自西安天豐生物科技公司；尼羅紅（批號(hào)C12499771）購(gòu)自上海麥克林生物有限公司；DIR熒光探針（批號(hào)DD0413）購(gòu)自上海百賽生物技術(shù)股份有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT），批號(hào)EZ2811F374，購(gòu)自德國(guó)Biofroxx生物科技公司；色譜乙腈、色譜甲醇均購(gòu)自湖北弗頓科技技術(shù)有限公司。

1.3 動(dòng)物及細(xì)胞

2 方法與結(jié)果

2.1 GA-BC聚合物的合成

將1.62 g BC溶于100 mL含四丁基醋酸銨的DMSO溶液中，攪拌至BC完全溶解，制備成均一的BC溶液。稱取4.7 g甘草次酸與1 g 丁二酸酐加入到20 mL DMSO溶液中，于40 ℃下加熱攪拌24 h，加入與甘草次酸同等物質(zhì)的量的DMAP與EDC進(jìn)行活化，繼續(xù)攪拌1 h后將上述反應(yīng)液緩慢滴加入到BC溶液中，混合均勻于40 ℃下繼續(xù)加熱攪拌24 h，反應(yīng)結(jié)束。利用反溶劑沉淀法[19]將反應(yīng)溶液滴加到自身5倍體積比的無(wú)水乙醇中，離心除去上清，用無(wú)水乙醇洗滌3～4次，將沉淀溶于蒸餾水?dāng)嚢杈鶆蚝笤俅坞x心取上清，凍干，即得GA-BC聚合物。合成路線見(jiàn)圖1。

圖1 GA-BC合成路線

2.2 GA-BC表征及結(jié)果

2.2.1 紅外光譜（IR）檢測(cè)及結(jié)果 采用IR法分別將BC、甘草次酸、GA-BC聚合物進(jìn)行表征，IR結(jié)果如圖2所示。BC的IR中，3520～3200 cm?1出現(xiàn)寬峰歸屬于BC上的-OH伸縮振動(dòng)特征峰，2895 cm?1處的吸收峰為C-H的伸縮振動(dòng)峰，1651 cm?1處歸屬于BC半縮醛基（-C＝O）對(duì)稱伸縮振動(dòng)，1148～993 cm?1為環(huán)上C-O伸縮振動(dòng)，且C-O的面外彎曲振動(dòng)造成了893 cm?1處的吸收峰。在甘草次酸IR圖中，3447 cm?1處為-OH伸縮振動(dòng)特征峰，2936～2868 cm?1為C-H的伸縮振動(dòng)峰、1709 cm?1處-COOH以及1658 cm?1處C＝O均為甘草次酸的特征峰。與BC和甘草次酸相比，新合成的GA-BC聚合物在保留了BC在3 403.8 cm?1處-OH的特征峰但峰形明顯變窄，表明BC的-OH發(fā)生接枝反應(yīng)，同時(shí)破壞了BC分子內(nèi)氫鍵，在2875 cm?1處出現(xiàn)-CH2伸縮振動(dòng)吸收峰外，在1 734.2 cm?1處出現(xiàn)了屬于C＝O伸縮振動(dòng)峰，吸收峰增強(qiáng)，說(shuō)明新和成的載體化合物中屬于甘草次酸的-OH與作連接臂的丁二酸酐反應(yīng)生成了新的酯鍵，在1 161.8 cm?1處出現(xiàn)C-O-C的不對(duì)稱吸收峰，證明BC與甘草次酸偶聯(lián)成功。

2.2.2 核磁共振氫譜（1H-NMR）檢測(cè)及結(jié)果 使用CDCl3溶解甘草次酸，D2O溶解GA-BC聚合物載體，溶解后分別移至核磁管中進(jìn)行1H-NMR分析，圖3-A所示為甘草次酸的1H-NMR譜，0.68～1.35分別為甘草次酸的7個(gè)強(qiáng)甲基峰，2.33為H-9單峰特征峰，3.02為H-3的2個(gè)二重峰；5.40為H-12的烯氫信號(hào)，為單峰，4.31為H-18為β構(gòu)型，圖3-B為GA-BC聚合物的1H-NMR譜，通過(guò)對(duì)比，GA-BC聚合物在0.98～1.20處出現(xiàn)了甘草次酸的特征峰，2.63處出現(xiàn)新的吸收峰歸屬于連接臂丁二酸酐上的-CH2CH2-，3.2～4.5處為BC環(huán)狀結(jié)構(gòu)的特征峰證明膠束偶聯(lián)成功。

圖2 GA-BC (A)、BC (B) 和甘草次酸(C)的IR圖

圖3 GA (A) 和GA-BC (B) 的1H-NMR圖

2.3 GA-BC與GA-BC-PTX的制備及表征

2.3.1 GA-BC自組裝空白膠束的制備 GA-BC為兩親性聚合物，在水中可自組裝形成納米膠束，稱取定量的GA-BC凍干品溶于蒸餾水中，為了使納米顆粒分散均勻，使用探頭式超聲發(fā)生器在冰浴條件下超聲處理，超聲程序設(shè)置為工作4 s停2 s，超聲功率為180 W，每次處理2 min，超聲后過(guò)0.45 μm的濾膜，即得自組裝空白膠束。

2.3.2 載藥膠束GA-BC-PTX制備 取10 mg凍干的GA-BC聚合物溶于10 mL蒸餾水中制備成1 mg/mL的GA-BC膠束溶液，稱取2 mg PTX溶于1 mL無(wú)水乙醇中，冰浴下滴加到GA-BC膠束溶液中，采用探針型超聲裝置輔助GA-BC膠束對(duì)紫杉醇進(jìn)行包載，混合物在冰浴下超聲20 min后，移至室溫環(huán)境在磁力攪拌器攪拌24 h，揮發(fā)除去乙醇，離心機(jī)3000 r/min離心10 min，分離出上清溶液進(jìn)行冷凍干燥，即得GA-BC-PTX載藥膠束。

持這種理論的人，主要認(rèn)為應(yīng)區(qū)別對(duì)待“專門用于執(zhí)行專利方法的產(chǎn)品”、“專門用于制造專利商品的零部件或設(shè)備”和“專利產(chǎn)品”、“依據(jù)專利方法直接獲得的產(chǎn)品”。這些論者一般都認(rèn)可權(quán)利用盡規(guī)則適用于后兩者，而對(duì)于前兩者，最多適用默示許可規(guī)則。

2.3.3 膠束粒徑、ζ電位 采用激光粒度電位分析儀來(lái)測(cè)定的粒徑分布并測(cè)其ζ電位。具體為取適量?jī)龈珊蟮腉A-BC和GA-BC-PTX樣品加入蒸餾水中，配制成膠束溶液，進(jìn)行測(cè)試，每個(gè)樣品測(cè)試3次，結(jié)果（表1）顯示，GA-BC載體平均粒徑為（287.2±4.4）nm，表面電位為（?19.2±1.2）mV；GA-BC-PTX載藥膠束平均粒徑為（292.4±3.7）nm，表面電位為（?20.3±1.2）mV。

2.3.4 膠束形態(tài)觀察 將GA-BC與GA-BC-PTX膠束溶于蒸餾水中，適當(dāng)稀釋后滴至滴到碳涂層的200目銅網(wǎng)格上，晾干后用1%磷鎢酸溶液染色，染色2 min后吸取多余的溶液，自然晾干，通過(guò)透射電鏡觀察到載體呈球形或類球形，外觀圓整，粒徑分布均勻，見(jiàn)圖4。

2.3.5 穩(wěn)定性考察 取適量GA-BC和GA-BC-PTX用PBS溶解置于西林瓶中，在4 ℃條件下放置7 d進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)。分別在0、0.5、1、2、3、5、7 d時(shí)取樣測(cè)定其粒徑和ζ電位分布。結(jié)果如圖5所示，0～7 d的儲(chǔ)存時(shí)間段內(nèi)，GA-BC和GA-BC-PTX的粒徑和電位均無(wú)較大變化，說(shuō)明具有較好的穩(wěn)定性。

表1 GA-BC和GA-BC-PTX的粒徑與ζ電位(, n = 3)

Table 1 Particle size and ζ potential of GA-BC and GA-BC-PTX (, n = 3)

組別粒徑/nmζ電位/mV GA-BC287.2±4.4?19.2±1.2 GA-BC-PTX292.4±3.7?16.8±0.9

圖4 GA-BC (A) 及GA-BC-PTX (B) 的TEM圖

圖5 GA-BC和GA-BC-PTX在不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)的粒徑(A) 和ζ電位(B) (, n = 3)

2.3.6 臨界膠束濃度（CMC）測(cè)定 采用熒光探針技術(shù)對(duì)GA-BC聚合物的CMC進(jìn)行測(cè)定。首先將丙酮配制的芘溶液（0.1 mmol/L）加入試管中，通過(guò)氮?dú)飧稍锍ケ蟾骷尤氩煌w積的GA-BC母液，蒸餾水定容至10 mL。使所配制的溶液質(zhì)量濃度分別為3.75、7.50、15.00、20.00、31.25、62.50、100.00、125.00、250.00、500.00 μg/mL。室溫下超聲30 min后，將其在黑暗條件中37 ℃下平衡24 h。通過(guò)熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光強(qiáng)度。激發(fā)波長(zhǎng)為340 nm，發(fā)射波長(zhǎng)范圍是350～600 nm。芘會(huì)被膠束所包裹，環(huán)境的極性發(fā)生變化，第1波段（373 nm，1）和第3波段（391 nm，3）強(qiáng)度的比值也隨之變化，將1/3的值進(jìn)行擬合，2條切線的交點(diǎn)確定CMC值。經(jīng)檢測(cè)，GA-BC載體在水中的CMC為0.063 mg/mL（圖6），具備良好的抗體液稀釋能力。

2.4 載藥量和包封率的測(cè)定

精密稱取2 mg GA-BC-PTX載藥膠束用1 mL蒸餾水溶解，再加入甲醇定容至10 mL，離心機(jī)5000 r/min離心10 min，取上清，過(guò)0.22 μm有機(jī)濾膜，取10 μL進(jìn)樣高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，并按公式計(jì)算載藥量和包封率。

載藥量＝1/2

包封率＝1/3

1為測(cè)得GA-BC膠束中紫杉醇的含量，2為GA-BC-PTX的總質(zhì)量，3為紫杉醇的總投藥量

圖6 GA-BC的CMC圖

紫杉醇的含量測(cè)定色譜條件[20]：色譜柱為Diamonsil C18反相柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-乙腈-水（40∶30∶30）；體積流量1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。建立關(guān)于紫杉醇對(duì)照品質(zhì)量濃度（）和峰面積積分值（）線性回歸方程＝24 022＋6 677.3，2＝0.999 8，經(jīng)HPLC法測(cè)得GA-BC-PTX載藥膠束樣品的載藥量為（17.89±0.61）%，包封率為（59.81±0.73）%（＝3）。

2.5 體外釋放考察

采用透析袋法考察紫杉醇原藥和GA-BC-PTX膠束溶液的體外釋藥情況。采用pH 1.2，含0.5%聚山梨酯-80的鹽酸溶液的人工胃液，和pH 6.8含0.5%聚山梨酯-80的磷酸鹽緩沖液的人工腸液作為釋放介質(zhì)模擬胃腸道環(huán)境，分別將0.4 mg紫杉醇、GA-BC-PTX（含紫杉醇0.4 mg）置于透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量3500）中，浸入200 mL人工胃液（或腸液），在體系溫度為37 ℃的恒溫磁力攪拌器中攪拌，轉(zhuǎn)速為100 r/min，分別在5、10、15、20、25、30、60、120、240、360、480、720 min以及24 h時(shí)間點(diǎn)取樣1 mL，同時(shí)補(bǔ)充1 mL相同基質(zhì)的空白人工胃液（或腸液），取出的樣品經(jīng)離心后取上清液，用0.22 μm有機(jī)濾膜濾過(guò)后，采用高效液相色譜儀檢測(cè)紫杉醇的含量并計(jì)算藥物的累積釋放率，每組平行3次。

紫杉醇原藥和GA-BC-PTX載藥膠束在人工胃液及人工腸液中的釋放曲線如圖7所示。游離的紫杉醇原藥在0～6 h時(shí)間段內(nèi)累積釋放率隨著時(shí)間的增長(zhǎng)有明顯提高，6～24 h時(shí)間段內(nèi)累積釋放率的變化趨于平緩。GA-BC-PTX中紫杉醇的釋放率在0～2 h時(shí)間段內(nèi)隨著時(shí)間的增長(zhǎng)累積釋放率有明顯提高和紫杉醇原藥較為相似，而2～6 h表現(xiàn)為紫杉醇緩慢釋放，之后趨于平緩，紫杉醇原藥在人工胃液及人工腸液中至24 h的累積釋放率分別為20.81%和24.36%，釋放趨勢(shì)基本相同，在人工胃液累積釋放率稍高于人工腸液，GA-BC-PTX在人工胃液及人工腸液中至24 h的累積釋放率分別為11.81%和8.01%，載藥膠束的累積釋放率明顯低于紫杉醇原藥，表明載藥膠束（GA-BC-PTX）結(jié)構(gòu)穩(wěn)定能夠承受酸性條件和胃腸道的稀釋，可將藥物穩(wěn)定地包載在納米膠束的內(nèi)部，提高了紫杉醇經(jīng)胃腸道進(jìn)入人體的穩(wěn)定性。

圖7 紫杉醇與GA-BC-PTX在人工胃液及人工腸液中的累積釋放率(, n = 3)

2.6 MTT實(shí)驗(yàn)

通過(guò)MTT法評(píng)價(jià)GA-BC空白膠束及GA-BC- PTX載藥膠束的抗癌活性。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況良好后吸走孔內(nèi)培養(yǎng)基，將GA-BC空白膠束及GA- BC-PTX載藥膠束質(zhì)量濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0 μg/mL的溶液分別加入HepG2細(xì)胞系培養(yǎng)24 h。利用MTT法測(cè)量570 nm處的吸光度（）值，根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞抑制率。

細(xì)胞抑制率＝1－實(shí)驗(yàn)/對(duì)照

對(duì)照組為給藥為與膠束同等體積的純化水

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，游離紫杉醇的質(zhì)量濃度在1.0～10.0 μg/mL時(shí)，對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率隨著藥物質(zhì)量濃度的增大而呈現(xiàn)顯著增長(zhǎng)，而質(zhì)量濃度增長(zhǎng)到100.0 μg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制率并未隨著藥物質(zhì)量濃度的增加而顯著增長(zhǎng)，同時(shí)也未隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)而抑制效果增加。這可能由于紫杉醇為疏水性藥物，溶解度極差且粒徑較大不利于細(xì)胞的攝取，多數(shù)通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞。而實(shí)驗(yàn)組顯示出良好的腫瘤細(xì)胞抑制性，隨藥物質(zhì)量濃度的上升，抑制率也逐步增加，GA-BC-PTX負(fù)載的紫杉醇質(zhì)量濃度為100.0 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞24 h時(shí)的抑制率為79.7%，48 h時(shí)細(xì)胞抑制率為87.5%，抑制效果隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，可能由于GA-BC-PTX納米載藥膠束具有較小的粒徑有助于細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，實(shí)現(xiàn)藥物在細(xì)胞內(nèi)的累積，GA修飾后能存在對(duì)肝癌細(xì)胞的主動(dòng)靶向，很大程度的提高了紫杉醇的抗癌活性。

表2 不同質(zhì)量濃度的紫杉醇與GA-BC-PTX載藥膠束與HepG2細(xì)胞孵育24 h和48 h的細(xì)胞抑制率(, n = 3)

Table 2 Rate of cellular inhibition of different concentrations of PTX and GA-BC-PTX loaded micelles incubated with HepG2 cells for 24 h and 48 h (, n = 3)

紫杉醇質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)細(xì)胞抑制率/% 24 h48 h 紫杉醇GA-BC-PTX紫杉醇GA-BC-PTX 1.017.9947.7837.0955.88 2.537.8056.0648.5165.56 5.054.1864.7854.9870.92 10.060.5070.2861.8677.51 25.063.7473.8865.6780.38 50.064.6276.8766.9584.56 100.066.5779.7269.0287.55

2.7 細(xì)胞攝取

以尼羅紅（Nile Red，NR）作為疏水性熒光探針通過(guò)超聲將其負(fù)載入GA-BC聚合物中，游離尼羅紅作為陽(yáng)性對(duì)照組，PBS溶液為空白對(duì)照組。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞接種于24孔板中，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出培養(yǎng)板，顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況良好后吸走孔內(nèi)培養(yǎng)基，每孔加入200 μL載有尼羅紅的GA- BC-NR膠束溶液，以含有相同含量的尼羅紅溶液為對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。分別培養(yǎng)2、4 h后吸棄藥液，用PBS清洗2次，然后用DAPI將細(xì)胞核染色10 min，吸棄染液，PBS清洗2次，再加入4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，固定結(jié)束吸棄多聚甲醛再用PBS清洗2次，使用高內(nèi)涵細(xì)胞成像儀觀察細(xì)胞內(nèi)熒光分布情況，并通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞攝取熒光定量分析。

比較2組內(nèi)熒光強(qiáng)度結(jié)果如圖8所示，尼羅紅特有的紅色熒光顯示了藥物的位置，細(xì)胞核用DAPI染為藍(lán)色。孵育2 h后游離尼羅紅的紅色熒光在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中幾乎不可見(jiàn)。相比之下，GA-BC-NR在相同藥量的相同孵育條件下，細(xì)胞質(zhì)中觀察到清晰的紅色藥物熒光。

圖8 孵育2 h和4 h后HepG2細(xì)胞攝取游離尼羅紅和GA-BC-NR膠束的高內(nèi)涵細(xì)胞成像圖像(圖中標(biāo)尺為100 μm)

利用流式細(xì)胞儀和SPSS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行熒光定量分析結(jié)果如圖9所示，孵育2 h，GA-BC-NR的熒光攝取量是游離的尼羅紅的8.1倍；孵育4 h，游離的尼羅紅熒光強(qiáng)度幾乎未發(fā)生變化，而GA- BC-NR膠束熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，HepG2細(xì)胞對(duì)其的攝取量是游離的尼羅紅的16倍，遠(yuǎn)高于游離尼羅紅。結(jié)果表明GA-BC納米膠束有助于HepG2細(xì)胞對(duì)藥物的攝取，由于甘草次酸受體介導(dǎo)，明顯增強(qiáng)了GA-BC膠束對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞的靶向能力，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物在細(xì)胞內(nèi)的富集。

2.8 肝靶向效果評(píng)價(jià)

由于紫杉醇和載體本身不具有熒光性，因此將近紅外熒光染料DiR作為熒光探針載入GA-BC納米膠束中，通過(guò)IVIS Lumina Series III活體成像系統(tǒng)記錄小鼠口服給藥后2、4、6、8、12、24 h全身的熒光分布情況。24 h全身熒光觀察結(jié)束后，取出小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟用于體外的成像和定量分析。使用Living Image軟件進(jìn)行定量分析，測(cè)定熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖10-A所示，游離DiR主要集中在胃腸道進(jìn)行循環(huán)消化，在給藥6 h熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，此后開(kāi)始逐漸下降，24 h后幾乎不可見(jiàn)。相比之下，GA-BC-DiR納米膠束給藥2 h進(jìn)入胃腸道后逐漸被體內(nèi)吸收，4～6 h肝臟部位熒光信號(hào)變強(qiáng)，說(shuō)明GA-BC-DiR納米膠束可進(jìn)入肝臟，實(shí)現(xiàn)熒光積累。

與同組NR處理比較：**P＜0.01 ***P＜0.001

圖10 小鼠口服DiR和GA-BC-DiR納米膠束24 h內(nèi)的體內(nèi)熒光成像(A)及24 h后的離體器官的熒光成像(B1)和平均熒光強(qiáng)度(B2)(, n = 3)

實(shí)驗(yàn)結(jié)束進(jìn)一步解剖器官的體外熒光圖像及定量分析如圖10-B1、B2所示，在肝臟部位GA-BC- DiR組的熒光強(qiáng)度是游離DiR組的2.65倍，進(jìn)一步證實(shí)負(fù)載DiR的GA-BC納米膠束比游離DiR更容易在肝臟積累，表明GA修飾的GA-BC納米膠束對(duì)肝臟存在靶向作用，可用于肝臟靶向給藥。

2.9 GA-BC膠束安全性評(píng)價(jià)

2.9.1 斑馬魚(yú)胚胎的準(zhǔn)備 挑選健康的斑馬魚(yú)雌雄成魚(yú)進(jìn)行追尾交配自然受精，收集受精卵，在顯微鏡下觀察，剔除未受精或已經(jīng)死掉的魚(yú)卵，隨后將其放入（29±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱孵育2～4 h，選取受精后4 hpf（hours postfertilization）后胚胎發(fā)育階段相同的魚(yú)卵用于毒性暴露試驗(yàn)。

2.9.2 斑馬魚(yú)胚胎毒性實(shí)驗(yàn) 胚胎發(fā)育至4 hpf時(shí)開(kāi)始加藥處理，將同步發(fā)育的胚胎分選到24孔板內(nèi)，每孔5枚，小心吸出24孔板中置有斑馬魚(yú)胚胎的培養(yǎng)液，沿室壁緩慢輕柔地加入含有不同質(zhì)量濃度的待測(cè)藥物（載體質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、10.00 mg/mL）配制的胚胎培養(yǎng)液，輕輕分散胚胎，避免聚集，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3組相同質(zhì)量濃度進(jìn)行平行重復(fù)試驗(yàn)，以單純培養(yǎng)基為空白對(duì)照。置于恒溫培養(yǎng)箱中孵育。分別在受精后24、48、72、96 h時(shí)放置顯微鏡下觀察胚胎發(fā)育情況并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明如圖11所示，在受精24 h時(shí)，載體質(zhì)量濃度在0.01～2 mg/mL時(shí)受精卵發(fā)育狀態(tài)正常，48 h開(kāi)始孵化，通過(guò)顯微鏡可以清楚地觀察到受精卵內(nèi)斑馬魚(yú)的頭、腦、尾以及卵黃囊等發(fā)育正常，至72 h斑馬魚(yú)脫膜而出，成功孵化為小魚(yú)，此時(shí)載體質(zhì)量濃度在2 mg/mL的條件下存在少量魚(yú)卵發(fā)育遲緩未脫膜現(xiàn)象，其余均可正常生長(zhǎng)發(fā)育，由于10 mg/mL的藥物質(zhì)量濃度過(guò)高，藥液呈現(xiàn)粘稠膠狀，存在藥物毒性使胚胎不能發(fā)育成功，大多數(shù)受精卵中的卵黃囊消失，并且斑馬魚(yú)卵內(nèi)部無(wú)明顯的頭、腦和尾巴等特征出現(xiàn)，受精卵出現(xiàn)大量死亡情況并逐漸消融。因此，當(dāng)載體質(zhì)量濃度低于2 mg/mL時(shí)基本對(duì)斑馬魚(yú)卵的正常發(fā)育生長(zhǎng)無(wú)毒副作用，可作為安全的藥物遞送載體。

圖11 不同質(zhì)量濃度的GA-BC對(duì)斑馬魚(yú)胚胎整體發(fā)育的影響

3 討論

紫杉醇是近些年來(lái)經(jīng)臨床驗(yàn)證療效最為顯著的抗癌藥物之一，具有廣譜抗腫瘤活性[21-24]，然而由于紫杉醇本身水溶性低，口服生物利用度差并且在體內(nèi)非特異性分布會(huì)對(duì)正常細(xì)胞造成傷害等原因，使其本身能夠發(fā)揮的療效及臨床使用的安全性受到極大的挑戰(zhàn)。因此提高紫杉醇的療效及靶向性，減少藥物的不良反應(yīng)，最大限度地提高藥物局部作用仍是新藥開(kāi)發(fā)的重點(diǎn)方向[25-26]。

本研究選擇GA作為疏水端，對(duì)BC進(jìn)行化學(xué)修飾，獲得兩親性聚合物GA-BC。BC具有獨(dú)特的超細(xì)網(wǎng)狀纖維結(jié)構(gòu)，同時(shí)具有高含水率、高結(jié)晶度、多微孔性可以容納大量的藥物分子以及便于藥物的持續(xù)釋放等優(yōu)點(diǎn)[27-28]，可作為藥物載體進(jìn)行開(kāi)發(fā)。但關(guān)于BC用于制備兩親性聚合物鮮有報(bào)道，根本原因?yàn)殡m然BC本質(zhì)上為親水結(jié)構(gòu)，但其內(nèi)部強(qiáng)烈的氫鍵作用使其在水和多數(shù)有機(jī)溶劑中難以溶解，并且BC缺乏靶向性，這限制了BC在藥物遞送上的效率[29-30]。本研究首先通過(guò)離子液體四丁基醋酸銨溶液削弱BC分子間氫鍵作用，再通過(guò)接枝反應(yīng)改變BC結(jié)構(gòu)，改善BC的親水性能，同時(shí)使BC獲得GA的肝靶向作用，以GA-BC為載體制備負(fù)載PTX的口服納米膠束。制成的GA-BC載體臨界膠束質(zhì)量濃度為0.063 mg/mL，據(jù)報(bào)道較低的臨界膠束質(zhì)量濃度（＜0.135 mg/mL）和較小的粒徑（＜500 nm）可通過(guò)內(nèi)吞作用被腸上皮細(xì)胞吸收，能有效提高膠束在體液中的抗稀釋能力，增強(qiáng)藥物體內(nèi)的穩(wěn)定性[31-33]。

胃腸道的生理和物理屏障是阻礙藥物遞送系統(tǒng)吸收的一大難題，通常大多數(shù)藥物進(jìn)入胃腸道就會(huì)被分解釋放，難溶性藥物更不易被胃腸道吸收，因此藥物未到達(dá)病變部位就被體內(nèi)代謝和清除，導(dǎo)致血藥濃度無(wú)法滿足治療需要[34]。體外釋放實(shí)驗(yàn)分別考察它們?cè)谌斯の敢汉腿斯つc液2種模擬人工介質(zhì)中的釋放情況，結(jié)果顯示，GA-BC-PTX在人工胃液及人工腸液中在0～2 h內(nèi)紫杉醇累積釋放率有明顯提高外，2～6 h表現(xiàn)為紫杉醇緩慢釋放，之后膠束的幾乎不釋藥，至24 h的累積釋放率分別為11.81%和8.01%，明顯低于紫杉醇原藥，提示膠束可能以完整膠束形式被胃腸壁細(xì)胞攝取從而增強(qiáng)藥物吸收。

腫瘤化療所面臨的另一個(gè)挑戰(zhàn)是由于化療藥物體內(nèi)非特異性分布對(duì)正常細(xì)胞所造成的傷害[4]。為克服這個(gè)問(wèn)題，設(shè)計(jì)GA作為肝靶向配體構(gòu)建靶向膠束。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道GA具有肝靶向作用并且在肝癌細(xì)胞的表達(dá)是正常肝組織的1.5～5倍[35]，GA與該位點(diǎn)的結(jié)合呈可飽和性、高度特異性。已有研究將GA在多種耐藥癌細(xì)胞系以及多種動(dòng)物模型上進(jìn)行了測(cè)試，均表現(xiàn)出良好的靶向作用[36-39]。因此將GA作為肝靶向配體來(lái)進(jìn)行靶向治療可使藥物準(zhǔn)確作用于肝部病變部位，減少藥物對(duì)其他器官的損傷[40]。本研究采用細(xì)胞攝取和小鼠活體成像考察膠束的主動(dòng)靶向性，通過(guò)高內(nèi)涵細(xì)胞成像系統(tǒng)觀察到2 h HepG2細(xì)胞內(nèi)的GA-BC-NR熒光強(qiáng)度比游離的NR更強(qiáng)，隨著時(shí)間延長(zhǎng)至4 h，其熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)，表明更多的膠束進(jìn)入細(xì)胞。

通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光定量分析，結(jié)果顯示孵育4 h HepG2細(xì)胞對(duì)GA-BC-NR膠束攝取量是游離尼羅紅的16倍，由此證明GA介導(dǎo)的GA-BC膠束對(duì)HepG2肝癌細(xì)胞具有靶向能力，能夠?qū)崿F(xiàn)藥物在細(xì)胞內(nèi)的富集。MTT毒性實(shí)驗(yàn)同時(shí)也說(shuō)明了這一現(xiàn)象，與游離的紫杉醇原藥相比，GA-BC-PTX載藥膠束可以明顯抑制HepG2細(xì)胞的活性，初步評(píng)價(jià)了GA-BC-PTX載藥膠束的抗腫瘤效果。為了進(jìn)一步驗(yàn)證GA-BC膠束的靶向性，在小鼠口服給藥后，對(duì)其進(jìn)行活體成像，可以在不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)觀察藥物在體內(nèi)吸收分布，結(jié)果顯示2～12 h小鼠的腹部區(qū)域存在明顯的熒光，可能是由于GA-BC膠束對(duì)腸道表面具有較強(qiáng)的黏附性，增加了藥物在消化系統(tǒng)中的停留時(shí)間，12 h后小鼠腹部區(qū)域的熒光由于吸收或消除作用逐漸脫離胃腸系統(tǒng)。

小鼠離體器官熒光成像圖片對(duì)比全身熒光定位時(shí)可能存在少許誤差，這是由于熒光成像是平面的，體內(nèi)深層器官或組織被采集的信號(hào)將會(huì)衰減很多，所以在整體成像過(guò)程中不能很好地定位熒光的分布。因此實(shí)驗(yàn)再次對(duì)離體器官進(jìn)行熒光定位及定量分析，結(jié)果顯示，GA-BC-DiR載藥膠束已經(jīng)進(jìn)入肝臟和脾臟等一些組織或器官的可能在體內(nèi)停留的時(shí)間更長(zhǎng)，肝臟處GA-BC-DiR組的熒光強(qiáng)度是游離DiR組的2.65倍，進(jìn)一步證實(shí)了GA-BC聚合物膠束的肝靶向能力，更易使藥物在肝臟累積，提高藥物作用效果。

綜上所述，GA-BC膠束可用于紫杉醇口服遞藥系統(tǒng)的開(kāi)發(fā)，具有良好的肝臟靶向性和生物安全性可降低紫杉醇非特異性帶來(lái)的不良反應(yīng)，同時(shí)針對(duì)HepG2細(xì)胞，GA-BC-PTX載藥膠束表現(xiàn)出較好的抗腫瘤活性和入胞能力，為肝癌治療提供新思路，具有良好的應(yīng)用前景。此外，對(duì)于紫杉醇口服膠束的抗腫瘤效果仍需進(jìn)行更系統(tǒng)、深入地研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Construction and evaluation of loaded paclitaxel oral micelles by glycyrrhetinic acid-modified bacterial cellulose

GENG Yu-ting1, 2, 3, 4, 5, ZHANG Xiao-xue1, 2, 3, 4, 5, KANG He-di1, 2, 3, 4, 5, ZHAO Xiu-hua1, 2, 3, 4, 5

1. Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 2. College of Chemistry, Chemical Engineering and Resource Utilization, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China 3. Engineering Research Center of Forest Bio-preparation, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China 4. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of ecological utilization of Forestry-based active substances, Harbin 150040, China 5. National and Local Joint Engineering Laboratory for Ecological Utilization of Biological Resources, Northeast Forestry University, Harbin 150040,China

To establish a bacterial cellulose (BC) amphiphilic nanocarrier modified with the liver- targeted molecule glycyrrhetinic acid (GA) for oral administration of paclitaxel (PTX).Using succinic anhydride as a connecting arm, glycyrrhetinic acid is coupled with bacterial cellulose to obtain a glycyrrhizic acid modified bacterial cellulose carrier (GA-BC). The structure of the combination was detected by IR and1H-NMR. The GA-BC-PTX drug-loading micelle was prepared by ultrasonic method, and then characterized by particle size, ζ potential, transmission electron microscopy and critical micelle concentration determination. The drug carrier system was evaluated by stability experiment,release experiment, MTT, cell uptake,imaging experiment in mice and zebrafish safety experiment.In this experiment, the GA-BC carrier was successfully constructed, and the detection of infrared spectroscopy and nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy proved that the coupling was successful, the average particle size of the GA-BC-PTX drug-loading micelle was (292.4 ± 3.7) nm, the surface potential was (?16.8 ± 0.9) mV, the drug load was (17.89 ± 0.61)%, the encapsulation rate was (59.81 ± 0.73) %, and the critical micelle concentration was 0.063 mg/mL, which was uniformly spherical, and the prepared carrier stability was good.release showed that the carrier could be stable in the gastrointestinal environment, MTT experiments showed that GA-BC-PTX micelles had a significant inhibitory effect on HepG2 cells, and the uptake of GA-BC-NR micellar by confocal microscopy was shown to be significantly higher than that of free NR. GA-BC polymer mice are shown to have a hepatic targeting effect by imaging mice. Zebrafish safety testing proved that when the GA-BC carrier concentration is less than 2 mg/mL, the polymer carrier is basically not biologically toxic.GA-BC carrier has good biosafety and liver targeting effect, and prepared GA-BC-PTX oral loading micelles can effectively inhibit the growth of hepatic tumor cells HepG2, providing new ideas for targeted therapy of liver cancer.

bacterial cellulose; glycyrrhetinic acid; amphiphilic self-assembly micelles; liver-targeting; oral delivery; paclitaxel

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6451 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.017

2022-04-17

黑龍江省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2022C001）；黑龍江頭雁創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目和111計(jì)劃（B20088）

耿宇婷（1994—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榱衷椿钚晕镔|(zhì)生態(tài)利用。E-mail: 1071122169@qq.com

趙修華（1979—），男，博士，教授，研究方向?yàn)橹参锔咧祷?。E-mail: xiuhuazhao@nefu.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]