基于AHP-熵權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選嶺南特色飲片制枳殼的發(fā)酵工藝及發(fā)酵前后成分對比研究

楊 婷，黃瑩瑩，方楊冰，龍江玲，李沁如，徐啟鍵，黃愛華，張 英，夏 荃

基于AHP-熵權(quán)法結(jié)合正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選嶺南特色飲片制枳殼的發(fā)酵工藝及發(fā)酵前后成分對比研究

楊 婷，黃瑩瑩，方楊冰，龍江玲，李沁如，徐啟鍵，黃愛華，張 英，夏 荃*

廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006

建立枳殼發(fā)酵品中多個(gè)成分的含量測定方法，優(yōu)化嶺南特色飲片制枳殼的發(fā)酵工藝，并比較枳殼發(fā)酵前后的成分變化。通過UHPLC測定枳殼發(fā)酵品中特征成分含量，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)法考察發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵濕度等影響因素，以枳殼發(fā)酵品中的10種特征黃酮類成分（包括黃酮苷及苷元）的含量和發(fā)酵品的外觀性狀作為指標(biāo)，采用層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）結(jié)合熵權(quán)法對這些指標(biāo)設(shè)置不同的權(quán)重，并計(jì)算復(fù)合評分來優(yōu)選其發(fā)酵工藝。枳殼的最佳發(fā)酵工藝為浸泡時(shí)間4 h，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵濕度90%；枳殼發(fā)酵后，黃酮苷類成分的含量下降，黃酮單糖苷和苷元類成分的含量均大幅度增加。建立的UHPLC多成分含量測定方法操作簡單、準(zhǔn)確，優(yōu)選的枳殼發(fā)酵工藝簡便、穩(wěn)定可行，可規(guī)范枳殼的發(fā)酵工藝，為制枳殼的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

枳殼；制枳殼；中藥發(fā)酵；工藝優(yōu)化；圣草次苷；新北美圣草苷；蕓香柚皮苷；柚皮苷；橙皮苷；新橙皮苷；橙皮素-7--葡萄糖苷；枸橘苷；柚皮素；橙皮素

枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙L.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，性微寒，味苦、辛、酸，具有理氣寬中、行滯消脹之功效，主治胸脅氣滯、脹滿疼痛、食積不化、痰飲內(nèi)停等癥[1]。枳殼生品作用峻烈，易傷正氣，體虛者不宜長期服用[2-3]，因此臨床上多以炮制品入藥，以達(dá)到緩和藥性的目的[4-5]。麩炒枳殼是使用最多的炮制品種，并被《中國藥典》2020年版[1]所收載。但在廣東、香港等嶺南地區(qū)，制枳殼為常用的地方特色炮制品種，因可緩和生枳殼峻烈之性，具有較好的行滯消脹作用，較麩炒枳殼的臨床應(yīng)用更為廣泛。

制枳殼的炮制工藝依據(jù)現(xiàn)行的《廣東省中藥炮制規(guī)范》[6]來執(zhí)行，包括發(fā)酵、蒸制、悶制等多個(gè)工藝步驟。其中，發(fā)酵是制枳殼炮制過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對產(chǎn)品質(zhì)量影響較大。目前，在生產(chǎn)中，枳殼的發(fā)酵采用自然發(fā)酵的方式，但是，發(fā)酵工藝較為粗放，生產(chǎn)過程受季節(jié)與環(huán)境因素以及人為經(jīng)驗(yàn)的影響較大。由于溫度、濕度等條件均不可控，導(dǎo)致生產(chǎn)周期不一，發(fā)酵程度不均勻，發(fā)酵品的質(zhì)量亦不穩(wěn)定。因此，對枳殼發(fā)酵的規(guī)范化工藝研究十分必要。

目前，對枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量控制僅憑借外觀性狀等進(jìn)行評判，經(jīng)驗(yàn)性判別方法存在一定的主觀性，造成市場流通的制枳殼飲片質(zhì)量參差不齊。而關(guān)于枳殼發(fā)酵工藝及其成分變化的研究較少，依據(jù)《中國藥典》2020年版的含量測定方法，僅以柚皮苷、新橙皮苷含量等少數(shù)指標(biāo)作為枳殼及其炮制品的質(zhì)量控制指標(biāo)，忽略了炮制過程中化學(xué)成分的變化。另外，工藝優(yōu)化的研究僅以主觀評價(jià)方法計(jì)算評分也不盡合理。因此，本實(shí)驗(yàn)基于前期研究結(jié)果[7-9]，選擇發(fā)酵前后變化較大及與制枳殼行滯消脹功效密切相關(guān)的10種黃酮類成分（圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素）作為枳殼發(fā)酵品的特征性成分，以特征成分的含量和發(fā)酵品的外觀性狀作為枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，在單因素基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并借助主、客觀評價(jià)方法層次分析法（analytic hierarchy process，AHP）-熵權(quán)法對枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量進(jìn)行綜合打分，全面評判枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量，進(jìn)而優(yōu)選枳殼的自然發(fā)酵工藝，為進(jìn)一步的制枳殼炮制規(guī)范化的工藝研究提供依據(jù)。同時(shí)對枳殼發(fā)酵后的7種黃酮雙糖苷類成分、1種單糖苷類成分及2種黃酮苷元類成分的含量進(jìn)行對比分析，以期獲得枳殼發(fā)酵前后成分變化的規(guī)律，為制枳殼嶺南特色炮制機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-30AD型超高效液相色譜儀，日本島津科技公司；AUY120型萬分之一天平，廣州湘儀機(jī)電設(shè)備有限公司；BT125D型電子分析天平，德國賽多利斯公司；LHS-150HC-II型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 材料

枳殼原藥材（批號190701）購自廣州至信藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室張丹雁教授鑒定，確認(rèn)來源為蕓香科柑橘屬酸橙L.的干燥未成熟果實(shí)。枳殼發(fā)酵品為由同一批號的枳殼原藥材在相應(yīng)發(fā)酵條件下制備而成的樣品。

對照品柚皮苷（批號YJ77D9F001）、橙皮苷（批號P06D9F77001）、新橙皮苷（批號C05F4Y2）、柚皮素（批號YJ0603HA13）、橙皮素（批號C03F6Y1）均購自上海源葉有限公司；對照品蕓香柚皮苷（批號PS011543）、圣草次苷（批號PS010198）、新北美圣草苷（批號PS010420）、橙皮素-7--葡萄糖苷（批號PS020721）、枸橘苷（批號PS010580）均購自成都普思生物科技有限公司；以上對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%；乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 枳殼發(fā)酵品質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素對照品6.36、5.16、16.44、30.00、17.46、30.01、16.08、16.68、14.10、15.24 mg，精密稱定，分別加甲醇適量定容至刻度，制得質(zhì)量濃度分別為0.318、0.258、0.822、1.500、0.873、1.500、0.804、0.834、0.705、0.762 mg/mL的單一對照品儲(chǔ)備液；分別精密吸取上述10個(gè)對照品儲(chǔ)備液適量，混合，加入甲醇制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為5.3、4.3、13.7、75、14.55、75、13.4、13.9、11.75、12.68 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取各樣品粗粉約0.5 g，精密稱定，置于圓底燒瓶中，加甲醇45 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密移取續(xù)濾液0.1 mL，置于2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，過0.22 μm微孔濾膜，即得相應(yīng)供試品溶液。

2.1.3 色譜條件 Waters UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～2 min，5% 乙腈；2～26 min，5%～55%乙腈；26～28 min，55%～20%乙腈；28～30 min，20%～5%乙腈；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長283 nm；進(jìn)樣量2 μL；PDA檢測器。

2.1.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 在“2.1.3”項(xiàng)色譜條件下，供試品溶液中圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素與其他成分均達(dá)到基線分離，分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不低于5000。色譜圖見圖1。

2.1.5 線性關(guān)系的考察 依次量取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0 mL于5 mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。精密移取不同體積“2.1.1”項(xiàng)下的混合對照品溶液，置于量瓶中，加甲醇定容至刻度，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程，結(jié)果分別為圣草次苷＝137 686－10 600，＝0.999 6，線性范圍0.11～5.30 μg/mL；新北美圣草次苷＝176 065－8 349.3，＝0.999 7，線性范圍0.09～4.30 μg/mL；蕓香柚皮苷＝110 887－ 10 177，＝0.999 6，線性范圍0.27～13.70 μg/mL；柚皮苷＝437 696＋121 634，＝0.999 6，線性范圍1.00～75.00 μg/mL；橙皮苷＝240 958－ 25 845，＝0.999 7，線性范圍0.29～14.55 μg/mL；新橙皮苷＝339 758－302 411，＝0.999 6，線性范圍1.00～75.00 μg/mL；橙皮苷-7--葡萄糖苷＝161 389－12 967，＝0.999 7，線性范圍0.27～13.40 μg/mL；枸橘苷＝123 841－6 892.8，＝0.999 7，線性范圍0.28～13.90 μg/mL；柚皮素＝245 796－916.81，＝0.999 7，線性范圍0.24～11.75 μg/mL；橙皮素＝212 382＋8 594.4，＝0.999 8，線性范圍0.25～12.68 μg/mL；表明10個(gè)對照品在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1-圣草次苷 2-新北美圣草苷 3-蕓香柚皮苷 4-柚皮苷 5-橙皮苷 6-新橙皮苷 7-橙皮素-7-O-葡萄糖苷 8-枸橘苷 9-柚皮素 10-橙皮素

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對照品2 μL，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得到混合對照品溶液中圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素峰面積的RSD值分別為0.21%、0.11%、0.14%、0.19%、0.26%、0.28%、0.33%、0.53%、0.29%、0.38%，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取枳殼發(fā)酵品（正交試驗(yàn)4號樣品）樣品6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算得到供試品溶液中圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.23%、0.15%、0.43%、1.79%、0.24%、3.25%、0.42%、0.26%、0.18%、0.16%，各成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.22%、1.27%、1.17%、2.11%、1.97%、1.03%、0.98%、1.42%、1.38%、1.25%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取枳殼發(fā)酵品（正交試驗(yàn)4號樣品），按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件，分別在0、4、8、12、16、20、24 h時(shí)進(jìn)樣測定，計(jì)算得到供試品溶液中圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素峰面積的RSD值分別為0.73%、0.82%、0.90%、1.55%、1.26%、2.23%、1.71%、1.86%、1.19%、1.04%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取枳殼發(fā)酵品（正交試驗(yàn)4號樣品）6份，每份0.25 g，分別精密加入與樣品中各成分等量的各對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件測定含量，計(jì)算各成分的加樣回收率，圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素的平均加樣回收率分別為101.60%、100.62%、101.01%、103.30%、101.63%、100.71%、101.65%、102.95%、103.47%、100.19%，RSD分別為1.64%、1.46%、0.06%、0.05%、1.66%、0.81%、1.71%、0.73%、0.48%、1.55%，表明加樣回收率符合要求。

2.1.10 樣品含量測定 按照“2.1.2”項(xiàng)下制備供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣2 μL，根據(jù)峰面積與對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各成分含量。

2.1.11 外觀性狀評分表的確定 枳殼發(fā)酵品的外觀性狀評分依據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)判別標(biāo)準(zhǔn)，通過直接觀察樣品霉變性狀進(jìn)行判斷，以樣品全部布滿白色菌絲為最高分，再按發(fā)酵程度設(shè)定分值，具體評分見表1。

2.2 枳殼發(fā)酵品評價(jià)指標(biāo)的確立

2.2.1 熵權(quán)法確定權(quán)重 熵權(quán)法根據(jù)各指標(biāo)離散程度來衡量綜合指標(biāo)的影響程度，屬于客觀賦權(quán)法。信息量越大，熵越小[10]，表明對評價(jià)的貢獻(xiàn)越大，權(quán)重就越大。各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化、歸一化（Y）、信息熵（S）計(jì)算，最終計(jì)算得到指標(biāo)權(quán)重（W）[11-12]。圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、外觀性狀的權(quán)重分別為0.107、0.174、0.077、0.048、0.068、0.046、0.110、0.049、0.082、0.094、0.145。

表1 枳殼發(fā)酵品外觀性狀評分

Table 1 Scoring table of appearance properties of fermented Aurantii Fructus

外觀性狀分值 表面未見霉斑和菌絲或藥材腐敗變質(zhì)0 表面長霉斑或菌絲的部分少于1/32.5 表面長霉斑或菌絲的部位為1/25.0 表面長霉斑或菌絲的部分大于2/37.5 表面均勻地布滿白色菌絲10.0

指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化值＝(實(shí)測值－最小值)/(最大值－最小值)

W＝(1－S)/(－ΣS)（為指標(biāo)個(gè)數(shù)）

2.2.2 AHP確定權(quán)重 層次分析法根據(jù)指標(biāo)間的重要程度按一定標(biāo)度構(gòu)建條理分明的層次關(guān)系，并據(jù)此求得指標(biāo)賦權(quán)值[10]，屬于主觀賦權(quán)法。根據(jù)文獻(xiàn)研究，將各指標(biāo)進(jìn)行重要性排序，建立的層次順序?yàn)殍制ぼ眨叫鲁绕ぼ眨捐制に兀匠绕に兀匠绕ぼ?7--葡萄糖苷＞圣草次苷＝新北美圣草苷＝蕓香柚皮苷＝橙皮苷＝外觀性狀，采用和積法[13-14]計(jì)算得到圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、外觀性狀的權(quán)重分別為0.050、0.050、0.050、0.200、0.050、0.200、0.100、0.050、0.100、0.100、0.050。一致性比值為0（＜0.1），表明矩陣合理有效，權(quán)重系數(shù)可靠[13]，一致性比值越大，表明矩陣一致性越差，一致性比值為0表明矩陣具有完全一致性。

r＝1/(a/a)，a/a為矩陣各列的歸一化值a為判斷矩陣中因素與因素的重要性之比

2.2.3 AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合評分

（1）AHP-熵權(quán)法權(quán)重系數(shù)確定：熵值表現(xiàn)了指標(biāo)的離散程度，離散程度大的指標(biāo)具有較大的權(quán)重，因而僅憑借熵權(quán)法賦權(quán)可能使重要指標(biāo)因離散程度小而權(quán)重較小；AHP法能夠體現(xiàn)專家對不同指標(biāo)重要性的經(jīng)驗(yàn)，熵值法可以反映指標(biāo)的信息特征，2者結(jié)合不僅可以減少AHP法賦權(quán)的主觀性，也可減少數(shù)據(jù)變化導(dǎo)致的權(quán)重波動(dòng)。按下式計(jì)算熵權(quán)法- AHP復(fù)合權(quán)重[12]，w和r分別為熵權(quán)法及AHP法所得權(quán)重系數(shù)。圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮苷-7--葡萄糖苷、枸橘苷、柚皮素、橙皮素、外觀性狀的復(fù)合權(quán)重分別為0.07、0.11、0.05、0.12、0.04、0.12、0.14、0.03、0.10、0.12、0.09。

（2）復(fù)合評分計(jì)算：按下式計(jì)算AHP-熵權(quán)法復(fù)合評分（）[12]。

＝0.07×100×(圣草次苷含量/圣草次苷含量最大值)＋0.11×100×(新北美圣草苷含量/新北美圣草苷含量最大值)＋0.05×100×(蕓香柚皮苷含量/蕓香柚皮苷含量最大值)＋0.12×100×(柚皮苷含量/柚皮苷含量最大值)＋0.04×100×(橙皮苷含量/橙皮苷含量最大值)＋0.12×100×(新橙皮苷含量/新橙皮苷含量最大值)＋0.14×100×(橙皮素-7--葡萄糖苷含量/橙皮素-7--葡萄糖苷含量最大值)＋0.03×100×(枸橘苷含量/枸橘苷含量最大值)＋0.10×100×(柚皮素含量/柚皮素含量最大值)＋0.12×100×(橙皮素含量/橙皮素含量最大值)＋0.09×100×(外觀性狀/外觀性狀最大值)

2.2.4 AHP-熵權(quán)法的可行性驗(yàn)證 將AHP、熵權(quán)法2種評分方法的指標(biāo)賦權(quán)值導(dǎo)入SPSS 26.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，其中＝0.102（＞0.05），表明采取AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合評分的方法不具有相似性；將2種方法所得權(quán)重系數(shù)計(jì)算各自的復(fù)合評分，并將其按從大到小順序排序，再進(jìn)行Speraman等級相關(guān)性分析，結(jié)果顯示AHP和熵權(quán)法呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.950，值為 0.000 088（＜0.001），表明2種方法可以相互借鑒，所得結(jié)果大體一致。

綜上所述，AHP-熵權(quán)法運(yùn)用于發(fā)酵枳殼綜合質(zhì)量評價(jià)具有良好的可行性。

2.3 枳殼發(fā)酵工藝的優(yōu)選

取枳殼凈藥材，稱定質(zhì)量，約40 g，每個(gè)條件下平行2份，加水浸泡一定時(shí)間，將泡濕的枳殼裝入透氣漏水的容器，置恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，在設(shè)定的溫度、濕度下發(fā)酵一定時(shí)間，清洗干凈，切薄片、干燥，即得相應(yīng)的枳殼發(fā)酵品。選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度、浸泡時(shí)間為考察因素，以發(fā)酵中間品中10個(gè)特征成分的含量及發(fā)酵終點(diǎn)的外觀性狀為指標(biāo)，采用AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合評分，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上、通過正交試驗(yàn)優(yōu)選枳殼的自然發(fā)酵工藝。

由單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可知，當(dāng)發(fā)酵溫度較低（22 ℃）或較高（42 ℃）、發(fā)酵濕度較低（50%，60%）時(shí)，枳殼藥材表面菌絲極少，發(fā)酵情況不明顯，說明溫度過高或過低及濕度過低時(shí)可能會(huì)抑制微生物的生長，導(dǎo)致枳殼發(fā)酵程度低。在發(fā)酵濕度較高（濕度大于90%）、浸泡時(shí)間過長（超過6 h）、發(fā)酵時(shí)間過長（超過6 d）的環(huán)境下，均會(huì)出現(xiàn)藥材腐敗軟爛甚至變質(zhì)的情況；根據(jù)含量測定的結(jié)果可知，發(fā)酵濕度在70%～90%時(shí)，藥材表面發(fā)酵程度明顯，10個(gè)特征成分的總含量較高；另外，浸泡時(shí)間過長有效成分容易流失，導(dǎo)致含量較低；發(fā)酵時(shí)間超過4 d，藥材中的有效成分會(huì)被微生物過度利用，導(dǎo)致總體含量下降，影響枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量。

2.3.1 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中不同枳殼發(fā)酵品的外觀性狀篩選出部分適宜條件，發(fā)酵溫度（A）取27、32、37 ℃3個(gè)水平，發(fā)酵濕度（B）取70%、80%、90% 3個(gè)水平，發(fā)酵時(shí)間（C）取48、72、96 h 3個(gè)水平，浸泡時(shí)間（D）取3、4、5 h 3個(gè)水平，進(jìn)行4因素3水平的L9(34)正交試驗(yàn)。

根據(jù)表2試驗(yàn)安排，取同一批次的枳殼藥材，按“2.2”項(xiàng)下方法制備正交試驗(yàn)樣品。按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各成分的含量測定按照“2.1.3”項(xiàng)下條件測定，試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2、3。

由表2正交試驗(yàn)結(jié)果可知，選出的最佳工藝為A3B3C2D1，且表3中方差分析結(jié)果表明，A因素對復(fù)合評分有顯著性影響，且各因素影響程度依次為A＞B＞D＞C（即發(fā)酵溫度＞發(fā)酵濕度＞發(fā)酵時(shí) 間＞浸泡時(shí)間），綜合直觀分析與方差分析，最終確定最優(yōu)的工藝為A3B3C2D1，即浸泡時(shí)間4 h，發(fā)酵溫度37 ℃，發(fā)酵時(shí)間48 h，發(fā)酵濕度90%。

表2 枳殼發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及復(fù)合評分

Table 2 Orthogonal test results and comprehensive scores of Aurantii Fructus fermentation process

序號A/℃B/%C/hD/hAHP-熵權(quán)復(fù)合評分 127 (1)70 (1)3 (1)48 (1)37.35 227 (1)80 (2)4 (2)72 (2)48.76 327 (1)90 (3)5 (3)96 (3)54.45 432 (2)70 (1)4 (2)96 (3)58.01 532 (2)80 (2)5 (3)48 (1)56.31 632 (2)90 (3)3 (1)72 (2)60.12 737 (3)70 (1)5 (3)72 (2)59.44 837 (3)80 (2)3 (1)96 (3)65.12 937 (3)90 (3)4 (2)48 (1)84.03 K146.85351.60054.19759.230 K258.14756.73063.60056.107 K369.53066.20056.73359.193 R22.67714.6009.4033.123

表3 枳殼發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)方差分析

Table 3 Analysis of variance of orthogonal test on Aurantii Fructus fermentation process

誤差來源偏差平方和自由度F值顯著性 A771.351240.000P＜0.05 B329.158217.069 C142.00827.364 D19.28421.000 誤差19.2842

0.05(2, 2)＝19.000.01(2, 2)＝99.00

2.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn) 對“2.3.1”中選出的最優(yōu)工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測得復(fù)合評分分別為83.74、84.22、84.35，RSD小于3%，試驗(yàn)接近預(yù)測值，進(jìn)一步說明優(yōu)化工藝的穩(wěn)定、可行。

2.4 枳殼發(fā)酵前后成分變化

選取枳殼及上述最優(yōu)工藝下炮制的枳殼發(fā)酵品各3份，每份0.5 g，精密稱定，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.3”項(xiàng)條件下測定2次，計(jì)算各成分含量。在本研究中，通過對照品指認(rèn)了枳殼發(fā)酵前后的10種特征黃酮類成分，其中包括黃酮雙糖苷、單糖苷及苷元類成分，并發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后這些成分的含量會(huì)發(fā)生變化，因此分別探究這些成分的變化規(guī)律，來初步闡明枳殼發(fā)酵的化學(xué)機(jī)制。

通過對照品指認(rèn)出10種黃酮類成分，其中包括7種黃酮苷（圣草次苷、新北美圣草苷、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷和枸橘苷），1種黃酮類單糖苷（橙皮素-7--葡萄糖苷），2種黃酮苷元（柚皮素和橙皮素），分別計(jì)算發(fā)酵前后這10種黃酮類成分的含量，結(jié)果見表4。枳殼發(fā)酵后，7種黃酮雙糖苷的含量均有不同程度的下降，而單糖苷（橙皮素-7--葡萄糖苷）和2種黃酮苷元的含量大幅度增加，提示發(fā)酵這一過程可能會(huì)導(dǎo)致成分的轉(zhuǎn)化。

表4 發(fā)酵前后10種黃酮類成分含量的變化

Table 4 Changes of contents of ten flavonoids before and after fermentation

樣品圣草次苷/%新北美圣草苷/%蕓香柚皮苷/%柚皮苷/%橙皮苷/%新橙皮苷/%枸橘苷/%橙皮素-7-O-葡萄糖苷/%柚皮素/%橙皮素/% 枳殼0.47±0.010.17±0.010.56±0.015.16±0.100.48±0.034.86±0.020.48±0.01??? 枳殼發(fā)酵品0.40±0.010.12±0.010.50±0.002.78±0.010.33±0.014.57±0.000.32±0.001.35±0.010.38±0.000.35±0.00 含量變化/%?14.88?21.43?11.81?47.06?34.77?6.19?34.50

“?”表示化學(xué)成分含量極低，未檢測出

“?”means that the content of chemical components is extremely low and not detected

黃酮類化合物是枳實(shí)、枳殼及其炮制品的主要活性成分[15]。在枳殼發(fā)酵的過程中，一些微生物可分泌胞內(nèi)胞外酶（如柚皮苷酶和橙皮苷酶）使一些黃酮苷類成分降解為相應(yīng)的苷元或單糖苷，實(shí)現(xiàn)在體外對黃酮苷類物質(zhì)進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，枳殼發(fā)酵后，柚皮苷等7種黃酮苷的含量減少，柚皮素、橙皮素和橙皮素-7--葡萄糖苷的平均含量增加。與黃酮苷類相比，單糖苷或苷元成分生物利用度較高，易入血吸收[18-19]，也說明了這種炮制的有效性。

結(jié)合含量測定結(jié)果推測枳殼發(fā)酵過程中柚皮苷、橙皮苷等黃酮苷類成分有大致類似的轉(zhuǎn)化規(guī)律，都可能是在相應(yīng)酶的作用下，使7-鼠李糖苷鍵水解，生成鼠李糖和相應(yīng)單糖苷，然后繼續(xù)進(jìn)行反應(yīng)生成相應(yīng)的苷元和葡萄糖，具體的轉(zhuǎn)化規(guī)律如圖2所示（因新橙皮苷與橙皮苷互為同分異構(gòu)體，柚皮苷與蕓香柚皮苷互為同分異構(gòu)體，故其轉(zhuǎn)化過程大致相同）。由表5可知，幾個(gè)正交試驗(yàn)樣品的單糖苷及苷元含量的變化趨勢大致相似，提示其轉(zhuǎn)化過程可能同時(shí)進(jìn)行。單糖苷及苷元的含量會(huì)隨著發(fā)酵溫度的上升而增加，在37 ℃時(shí)（樣品正交7～9）這些成分的含量較高；在此溫度條件下，當(dāng)發(fā)酵濕度為90%時(shí)，可能會(huì)達(dá)到一個(gè)加速發(fā)酵進(jìn)程的效果，柚皮苷酶等生物酶有較強(qiáng)活力，單糖苷及苷元的含量明顯升高。

綜上所述，發(fā)酵溫度、濕度等條件會(huì)對枳殼發(fā)酵品中的單糖苷和苷元的含量產(chǎn)生影響，在最佳的發(fā)酵條件下，產(chǎn)生的單糖苷和苷元的含量較高，發(fā)酵程度較高，同時(shí)可以縮短發(fā)酵的時(shí)間。

3 討論

中藥炮制是中醫(yī)的用藥特點(diǎn)，中藥飲片的質(zhì)量直接影響臨床療效。科學(xué)、規(guī)范的炮制工藝是中藥飲片質(zhì)量的重要保證。嶺南地區(qū)有許多獨(dú)特的炮制工藝和獨(dú)具特色的飲片，但相關(guān)的炮制研究較少。很多炮制工藝較為傳統(tǒng)、粗放，往往缺乏科學(xué)合理的技術(shù)參數(shù)，炮制火候標(biāo)準(zhǔn)亦多憑借人為經(jīng)驗(yàn)判別，常常導(dǎo)致飲片質(zhì)量的不穩(wěn)定。因此，借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)和手段，對炮制工藝進(jìn)行不斷改進(jìn)與創(chuàng)新，促進(jìn)科學(xué)、規(guī)范化的炮制工藝建立至關(guān)重要。

圖2 枳殼發(fā)酵過程中主要成分的轉(zhuǎn)化

表5 枳殼發(fā)酵正交試驗(yàn)樣品中黃酮類單糖苷及苷元的含量

Table 5 Contents of flavonoid monoglycosides and aglycones in orthogonal test samples of Aurantii Fructus fermentation

正交試驗(yàn)樣品黃酮單糖苷/%黃酮苷元/% 正交10.13±0.000.13±0.00 正交20.40±0.000.18±0.00 正交30.47±0.010.23±0.01 正交40.47±0.010.28±0.01 正交50.50±0.010.29±0.01 正交60.58±0.020.32±0.00 正交70.59±0.010.34±0.00 正交80.68±0.020.36±0.01 正交91.35±0.010.54±0.01

制枳殼為一嶺南特色飲片，采用了先發(fā)酵后蒸制的獨(dú)特炮制工藝，有較好的行滯消脹作用，在粵港澳地區(qū)被廣泛使用。發(fā)酵是其炮制工藝中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但在生產(chǎn)中缺乏規(guī)范化的炮制工藝參數(shù)，生產(chǎn)時(shí)間與產(chǎn)品質(zhì)量受自然氣候條件影響較大。另外，目前制枳殼的發(fā)酵中間品與成品的質(zhì)量控制方法極為簡單，僅憑借外觀性狀、色澤等經(jīng)驗(yàn)鑒別手段來評判。因外觀性狀比較類似，一些生產(chǎn)企業(yè)擅自減少工藝流程，不發(fā)酵只蒸制，以清蒸枳殼代替發(fā)酵蒸制枳殼在市場流通，出現(xiàn)了產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的亂象[20]。因此，質(zhì)量控制中的含量測定是必不可少的。黃酮類成分為枳殼及其炮制品中的主要活性成分，炮制后也發(fā)生了較大的變化[21-22]，故在本研究中，選擇了發(fā)酵后變化較大且與制枳殼行滯消脹功效密切相關(guān)[8-9]的10種黃酮類成分進(jìn)行含量測定。

在工藝研究中的綜合評分方法有層次分析法、G1法、熵權(quán)法、主成分分析法等，其中，前兩者屬于主觀評價(jià)法，后兩者屬于客觀評價(jià)法，而主觀與客觀的組合評價(jià)方法更符合中藥炮制工藝研究的特點(diǎn)[23]。因此，本研究利用UHPLC法同時(shí)測定枳殼發(fā)酵品中的多種黃酮類成分，以柚皮苷、柚皮素等10種黃酮苷及苷元類特征性成分的含量和發(fā)酵品的外觀性狀作為枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)，通過AHP-熵權(quán)法計(jì)算復(fù)合評分，對浸泡時(shí)間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵濕度及發(fā)酵時(shí)間等發(fā)酵工藝中的關(guān)鍵因素進(jìn)行優(yōu)選，確定了枳殼的最佳發(fā)酵工藝，為嶺南特色飲片制枳殼的規(guī)范化炮制工藝研究及工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)對枳殼發(fā)酵前后的10種黃酮類成分含量變化的規(guī)律進(jìn)行初步探討，為制枳殼炮制機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

盡管本研究對枳殼的發(fā)酵工藝環(huán)節(jié)進(jìn)行了優(yōu)化研究，但是依然存在發(fā)酵菌種不穩(wěn)定、混雜有無效菌株等問題，影響枳殼發(fā)酵品的質(zhì)量穩(wěn)定。后續(xù)研究中可考慮采用更純凈、精準(zhǔn)的定向發(fā)酵方式[24-27]，篩選枳殼發(fā)酵的關(guān)鍵微生物菌群菌種，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定菌種組合的混合固體發(fā)酵工藝。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Optimization of fermentation process of processedfrom Lingnan characteristic decoction pieces based on AHP-entropy weight method and orthogonal experimental design and comparison of components before and after fermentation

YANG Ting, HUANG Ying-ying, FANG Yang-bing, LONG Jiang-ling, LI Qin-ru, XU Qi-jian, HUANG Ai-hua, ZHANG Ying, XIA Quan

School of Pharmaceutical science, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China

The content determination method of multiple characteristic peaks in fermentedwas established. The fermentation technological conditions of the characteristic processing product ofin Lingnan region were optimized, and the changes of components before and after fermentation were compared.The contents of characteristic peaks in the fermentedwere determined by UHPLC. Based on the single-factor test, the influencing factors such as fermentation temperature, fermentation time, and fermentation humidity were investigated by orthogonal test. The appearance properties of the fermentedand the contents of 10 characteristic flavonoids (including flavonoid glycosides and aglycones) in the fermentedwere used as evaluation indexes. The analytic hierarchy process (AHP) and entropy weight method were used to set different weights for these indexes, and the compound scores were calculated to optimize the fermentation process.The optimum fermentation technological conditions ofwere determined as follows: soaking time 4 h, fermentation time 48 h, fermentation temperature 37 ℃, fermentation humidity 90%; Fermentation considerably reduced the contents of flavonoid glycosides, while increasing hesperidin-7--glucoside and flavonoid aglycones.The established UHPLC multi-component content determination method is simple, accurate, reproducible, and reliable. The optimized fermentation process ofis simple, stable, and feasible. It standardizes the fermentation process ofand can provide experimental data for the industrial production of processed.

; processed; fermentation of traditional Chinese medicine; optimization of fermentation process; eriocitrin; neoeriocitrin; narirutin; naringin; hesperidin; neohesperidin; hesperidin-7--glucoside; poncirin; naringenin; hesperetin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6443 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.016

2022-04-25

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81873003）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2017A020213012）；國家中醫(yī)藥管理局中藥炮制技術(shù)傳承基地項(xiàng)目（粵中醫(yī)辦函[2022]52號）

楊 婷（1998—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幣谥乒に嚰芭谥茩C(jī)制研究。Tel: 13687446034 E-mail: 1832603053@qq.com

夏 荃（1971—），女，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事中藥炮制機(jī)制研究。Tel: (020)39358257 E-mail: xia@gzucm.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]