關節腔注射劑青藤堿納米晶自穩定Pickering乳液的制備及藥效學研究

張筠昊，梁 霄，白皓天，李婭蘭，孫淑慧，張倩倩，楊 婧，王 銳, 3*

·藥劑與工藝·

關節腔注射劑青藤堿納米晶自穩定Pickering乳液的制備及藥效學研究

張筠昊1，梁 霄1，白皓天1，李婭蘭1，孫淑慧1，張倩倩1，楊 婧2，王 銳1, 3*

1. 黑龍江中醫藥大學藥學院，黑龍江 哈爾濱 150040 2. 黑龍江中醫藥大學基礎醫學院，黑龍江 哈爾濱 150040 3. 教育部北藥基礎與應用研究重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040

通過制備青藤堿納米晶自穩定Pickering乳液（sinomenine nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions，Sin- NSSPE）關節腔注射劑，在關節腔內形成藥物貯庫，緩慢釋放以提高生物利用度，降低藥物毒副作用，以青藤堿納米晶（sinomenine nanocrystal，Sin-NCs）自身為穩定劑制備Sin-NSSPE關節腔注射劑，用藥效學實驗考察其對類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）的治療效果。通過藥物質量濃度、油水相比例和水相pH值等因素對Sin-NSSPE進行優化，運用福氏佐劑關節炎方法建立RA大鼠模型，以關節腫脹度、關節炎指數、脾指數、酶聯接免疫吸附劑測定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）、組織病理學檢查、Western blotting法作為指標進行檢測。結果顯示Sin-NSSPE的粒徑均勻，載藥量良好，Sin-NCs的平均粒徑為（121.49±18.26）nm、Sin-NSSPE的粒徑為（1 159.60±160.15）nm、載藥量4.92 mg/mL；藥效學實驗結果顯示，與青藤堿ig組相比，Sin-NSSPE關節腔注射組能有效降低關節腫脹度和炎癥指數，改善滑膜組織的病變、抑制關節炎癥。青藤堿關節腔注射組和Sin-NSSPE關節腔注射組均能明顯改善大鼠關節腫脹，降低滑膜組織中炎癥因子白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達（＜0.05、0.01），且Sin-NSSPE關節腔注射組治療效果優于青藤堿關節注射組，同時劑型穩定性提高并形成藥物貯庫，使藥效更加平穩。制備的Sin-NSSPE性質穩定，Sin-NSSPE關節腔注射對大鼠RA有良好的療效。

青藤堿；納米晶自穩定Pickering乳液；關節腔注射；類風濕性關節炎；貯庫效應；巨噬細胞釋藥

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、侵襲性自身免疫疾病，以對稱性、破壞性的關節滑膜病變為主要特征，病理性改變表現為滑膜炎，急性期滑膜腫脹、滲出、中性粒細胞浸潤[1]，慢性期滑膜增生肥厚，形成血管翳，同時會導致關節變形、關節破壞和功能性障礙，RA的發生是由很多因素導致[2-3]，包括免疫因素、遺傳因素、環境因素等，并且對疾病機制還在不斷地發展和研究之中。現階段非甾體抗炎藥是治療RA的一線藥物，例如阿司匹林腸溶劑、吲哚美辛栓劑等，但具有復雜的體內代謝過程，使藥物無法直接到達RA局部，降低了藥物治療效果，因此可直達病變部位、快速起效、毒副作用小、生物利用度高的劑型是RA藥物研究的新方向。青藤堿是從防己科防己屬植物青藤(Thunb.) Rehd. et Wils.中提取出的生物堿單體，具有抗炎、鎮痛、抗腫瘤、免疫調節等藥理作用[4]，被廣泛應用于臨床治療RA和神經痛，研究表明[5-6]，青藤堿對運動系統炎癥、消化系統炎癥、神經系統炎癥等疾病具有明確的治療作用。其主要以口服和注射制劑應用于臨床，但存在著藥物溶解度低、生物半衰期較短和生物利用度低等問題[5]，且服用劑量大，易引起胃腸道不良反應、肝腎損傷和嚴重的心臟毒性，所以臨床用藥對給藥劑量小、包封率和載藥量高、生物半衰期長的制劑有著迫切的需求。

Pickering乳液是以二氧化硅、纖維素納米晶等固體顆粒作為穩定劑，固體顆粒在油-水相之間的乳化層形成乳化膜來穩定乳滴，進而阻止乳滴的聚集，而藥物納米晶自穩定Pickering乳液（nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions，NSSPE）則是以難溶藥物固體顆粒自身作為穩定劑的乳液。NSSPE藥物輸送系統優點具有小粒徑、分散均勻度高、藥物分散度高，可提高腸胃膜的通透性，促進藥物吸收，提高其生物利用度、延長生物半衰期、降低不良反應和毒性反應[7-9]，同時藥物固體顆粒作為穩定劑，以油、水和藥物為3相，從而避免表面活性劑和異相穩定劑的藥物毒性，降低Pickering乳液的不良反應，同時難溶性藥物即溶解于油相，也被乳化層所吸附，發揮藥物貯庫效應提高載藥量。NSSPE自身可通過注射、透皮吸收等多種途徑給藥的獨特優勢，使其在臨床應用中有著廣闊的前景。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ASP200S型石蠟包埋機、RM2235型切片機、HI1220型烤片臺、HI1220型水浴缸、G1150 H型加熱石蠟包埋系統、DM3000型顯微鏡，德國Leica公司；Nano-ZS90型粒徑分析儀，馬爾文儀器有限公司；IID型超聲細胞破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；FA30D型小型高速剪切機，上海弗魯克科技發展有限公司；APV-1000型高壓均質儀，北京漢默泰克流體技術有限公司；DF-101Z型磁力攪拌器，鄭州長城科工貿有限公司；Waters H-Class e2695型超高效液相色譜儀，沃特世科技（上海）有限公司；TD5型離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；SPARK 10M型酶標儀，TECAN公司；DYCZ-2DN型電泳儀、WD-9405F型脫色搖床、WD-9423B型化學發光分析儀，北京六一生物科技有限公司。

1.2 藥品和試劑

青藤堿原料藥（批號DT0110522A，質量分數98%），購自陜西大田生物科技有限公司；泊洛沙姆（批號C13279022）、氧化鋯（批號C13665082）購自上海麥克林生化科技有限公司；中鏈脂肪酸甘油三酯（批號G107437）、聚乙二醇硬脂酸酯（批號P139716）、聚乙二醇400（批號P103735），購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；普朗尼克F127（F127，批號P822479）購自上海麥克林生化科技有限公司；青藤堿對照品（批號B20995，質量分數98%）、油酸聚乙二醇甘油酯（Labrafil M1944 CS，批號S23148）購自上海源葉生物科技有限公司；弗氏完全佐劑（批號SLCC73365），購自美國Sigma公司；滅活卡介苗佐劑（批號R19017）購自上海瑞楚生物科技有限公司；蘇木精-伊紅染料（批號ZM52036），購自上海紫銘試劑廠；白細胞介素-1（interleukin-1，IL-1，批號SP10178）ELISA試劑盒、IL-6（批號SP10234）ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α，批號SP240246）ELISA試劑盒，武漢賽培生物科技有限公司；ECL超敏化學發光液試劑盒，批號GC10AA0055，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；BCA試劑盒（批號20220415），購自Bio-Swamp Life Science Lab；β-actin抗體（批號F200050）、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG二抗（批號F300508）購自Abways Technology公司；IL-1β抗體（批號#85m5763）、IL-6抗體（批號#86m6953）、TNF-α抗體（批號#84g4358）購自Affinity BiOSciences公司。

1.3 動物

SPF級雄性SD大鼠，平均體質量205.40 g，6周齡，購自黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，許可證號SYXK（黑）2022-006，經黑龍江中醫藥大學實驗動物管理和使用委員會批準，編號為2022032701。

2 方法和結果

2.1 青藤堿納米晶（sinomenine nanocrystal，Sin-NCs）和Sin-NSSPE的制備

2.1.1 Sin-NCs 采用介質研磨法[10-11]制備Sin- NCs，經預實驗考察得到制備方法如下：稱取青藤堿原料藥0.2 g及穩定劑F127 40 mg，置于100 mL燒杯中，加入50 mL超純水、磁力轉子及氧化鋯（粒徑在0.4～0.6 mm），置于磁力攪拌器研磨24 h，濾過除去氧化鋯，將溶液在超聲波細胞破碎儀中超聲（1200 W，工作5 s，間歇5 s）30 min，即得Sin-NCs混懸液。

2.1.2 Sin-NSSPE 將按照“2.1.1”項下方法制備的Sin-NCs混懸液與10 mL中鏈脂肪酸甘油三酯混合，加入1.0 mL Labrafil M1944 CS和100 mL純水，使用高壓剪切機15 000 r/min剪切3 min，100 MPa下循環均質10次，超聲細胞破碎儀在油水相界面處探頭超聲10 min，即得Sin-NSSPE。

2.1.3 空白NSSPE 在“2.1.2”項方法下，不加入Sin-NCs制備NSSPE，即得到空白NSSPE。

2.2 青藤堿含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為乙腈-水-乙二胺（30∶70∶0.25）；體積流量1.0 mL/min；檢測波長262 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。

2.2.2 對照品溶液的配制 精密稱取減壓干燥至恒定質量的青藤堿對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，振搖得到質量濃度為100 μg/mL對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的配制 精密移取Sin-NSSPE 100 μL，甲醇定容至10 mL量瓶，得到供試品溶液。

2.2.4 陰性對照溶液的配制 將空白NSSPE經過“2.2.3”項方法處理，得到陰性對照溶液。

2.2.5 專屬性考察 取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，在“2.2.1”項色譜條件下各進樣10 μL，記錄色譜圖（圖1），結果表明此色譜條件下，陰性對照溶液在青藤堿的保留時間內未出現色譜峰，表明其他成分對青藤堿的檢測無干擾。

圖1 青藤堿對照品溶液(A)、Sin-NSSPE供試品溶液(B)和陰性對照溶液(C)的HPLC圖

2.2.6 線性關系考察 取一定量的青藤堿對照品，使用甲醇稀釋為質量濃度5.2、2.6、1.04、0.52、0.104、0.052、0.031 2 μg/mL的系列對照品溶液，進樣并記錄色譜圖。以峰面積值為縱坐標（），以進樣質量濃度為橫坐標（）進行線性回歸，求得回歸方程＝7 897.1＋2 033.3，2＝0.999 9，結果表明，青藤堿在0.031 2～5.20 μg/mL與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.7 精密度試驗 取“2.2.6”項下高、中、低質量濃度（0.031 2、0.520 0、5.20 μg/mL）的對照品溶液，分別連續進樣5次，記錄峰面積。計算得高、中、低質量濃度的對照品溶液中青藤堿峰面積的RSD依次為1.14%、2.072%、2.52%，表明儀器精密度良好。

2.2.8 重復性試驗 按照“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，分別進行測定，記錄峰面積，計算得Sin-NSSPE中青風藤質量濃度的RSD為1.42%，表明該方法重復性較好。

2.2.9 穩定性試驗 按照“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，分別在制備后0、2、4、6、8、10、12、14 h進樣分析，計算得青藤堿峰面積的RSD為1.98%，結果表明供試品溶液在14 h內穩定性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 精密吸取Sin-NSSPE和對照品溶液各0.5 mL，混勻，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，按照“2.2.1”項色譜條件進行測定，計算青藤堿加樣回收率，結果得到青藤堿的平均加樣回收率為99.17%，RSD為1.17%。

2.3 Sin-NSSPE乳化指數和粒徑分布測定

將新配制的Sin-NSSPE在30 ℃條件下靜置，分別于0、14 d觀察乳液的絮凝、分層等不穩定狀態，記錄乳液層高度，測得0 d樣品總高度（0）和放置h后乳液層高度（H），計算乳化指數（creaming index，CI）。當乳液明顯出現絮凝、分層、沉淀等現象時，乳化指數為0。

CI＝H/0

在試管中加入2 mL新配置的Sin-NSSPE，并加入到40 mL純化水中（稀釋20倍），用激光粒度測定儀檢測Sin-NSSPE粒徑和粒徑分布。

2.4 Sin-NSSPE處方工藝的單因素考察

2.4.1 不同油相種類對青藤堿溶解度的影響 取肉豆蔻酸異丙酯、單油酸甘油酯、辛酸/葵酸甘油一酯二酯、油酸乙酯、中鏈脂肪酸甘油三酯各3 mL，加入過量青藤堿原料藥，超聲處理2 h，離心（轉速4000 r/min，離心半徑為6.3 cm）30 min，取上清液置于10 mL量瓶中，定容。以聚乙二醇硬脂酸酯和聚乙二醇400作為乳化劑和助乳化劑，并按照1∶1比例得到混合乳劑。設定油相和混合乳劑1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1的比例進行混合，在磁力攪拌（溫度37 ℃）的條件下緩慢滴加蒸餾水，觀察各體系溶液狀態（顏色、澄清度等）的變化。記錄溶液由澄清-渾濁-澄清所需的蒸餾水體積，繪制混合乳化劑-油相-水的偽三元相圖和3D圖，結果見圖2、3，可見青藤堿在中鏈脂肪酸甘油三酯中具有良好的溶解度，以中鏈脂肪酸甘油三酯為油相制備Sin-NSSPE。

圖2 不同油相比例的偽三元相圖

圖3 不同油相比例的3D映射圖

2.4.2 水相pH值對Sin-NSSPE的影響 調節青藤堿粗混懸液pH值分別為4.0、5.0、6.0、7.0，制得不同pH值的Sin-NCs。在不同pH值的Sin-NCs中加入中鏈脂肪酸甘油三酯制備Sin-NSSPE，測定粒徑分布和ζ電位。當pH值為4時，Sin-NSSPE粒徑為1 159.60 nm，ζ電位為?32.36 mV，且隨著pH值的升高，粒徑不斷增大，ζ電位絕對值減小。原因可能是隨著pH值的增加，青藤堿之間相互聚集增加，導致粒徑增大。因此選擇水相pH值為4，粒徑最小且均勻。結果見表1。

2.4.3 青藤堿質量分數對Sin-NSSPE的影響 稱取適量的青藤堿原料藥，設定青藤堿粗混懸液的質量分數為0.1%～2.0%，制備Sin-NCs（pH 4），并加入5.5 mL中鏈脂肪酸三酰甘油，按照“2.1.2”項下方法制得不同青藤堿質量分數的Sin-NSSPE，以CI進行評價。結果如圖4所示，青藤堿質量分數在0.1%～0.5%時，粒徑下降趨勢明顯，質量分數在0.5%～2.0%時，粒徑并無明顯的變化，放置后出現藥物沉淀，是因為此時油水相載藥層已達到飽和，導致藥物析出降低了載藥量。當青藤堿質量分數為0.1%～0.5%時，CI出現明顯下降，而青藤堿質量分數為0.5%時，CI無明顯變化。因此選擇青藤堿質量分數為0.5%時，該質量濃度下粒徑適宜，乳液穩定性最好，并且可以避免藥物飽和析出提高載藥量。

表1 不同pH值條件下Sin-NSSPE的粒徑和ζ電位(, n = 3)

Table 1 Particle size and ζ potential of Sin-NSSPE under different pH conditions(, n = 3)

pH值粒徑/nmζ電位/mV 41 159.60±160.15?32.36±1.08 51 316.93±98.46?30.72±1.39 61 549.26±183.61?28.13±1.26 71 873.52±106.72?26.23±0.74

2.4.4 油相比例對Sin-NSSPE構建的影響 以油相占總體積的比例為考察因素進行單因素考察，稱取青藤堿原料藥制備Sin-NCs（pH 4），加入不同比例的甘油三酯，使油相占比分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5，參照“2.1.2”項下方法制備Sin-NSSPE（含藥量0.5%），通過CI進行評價。

圖4 青藤堿不同質量分數時Sin-NSSPE粒徑變化(A)和CI時間變化(B)

結果（圖5）表明，測得不同油相比例Sin-NSSPE的CI分別為19.72%、38.67%、44.39%、52.16%、62.75%，放置30 min后分別為5.12%、9.17%、32.55%、40.16%、17.25%。CI隨著放置時間的增加呈現降低趨勢，當油相比例為0.4時，CI變化平穩，乳液狀態最穩定，說明油相比例過高時，破壞了乳液的整體穩定性，因此制備Sin-NSSPE油相比例為0.4時最佳。

2.5 最佳工藝確定和驗證

期望以青藤堿溶解度處于最大值，Sin-NSSPE的粒徑和ζ電位處于最小值，乳液穩定性良好為優化指標，最終確定Sin-NSSPE最佳的工藝條件是選擇中鏈脂肪酸甘油三酯為油相，水和中鏈脂肪酸甘油三酯的質量比為6∶4，同時設定水相pH值4和藥物質量分數為0.5%。在該條件下青藤堿在中鏈脂肪酸甘油三酯中溶解性能最佳，粒徑為1 159.6 nm，ζ電位為?26.2 mV，乳液穩定性良好，說明單因素考察工藝優化是合理的。

圖5 不同油相比例的CI隨時間變化(A) 和3D曲面映射圖(B)

對最佳工藝進行驗證，進行3次重復測定，平均粒徑為（1 086.70±66.30）nm（＝3），ζ電位為（?25.4±0.3）mV（＝3），表明所得結果合理。

2.6 Sin-NCs和Sin-NSSPE質量評價

2.6.1 Sin-NCs粒徑和多分散指數（polydispersity index，PDI） 制備3批不同批次的Sin-NCs，分別取Sin-NSs適量，加水稀釋50倍，采用激光粒度儀測定粒徑和PDI，取平均值，結果見圖6。粒徑為（121.49±18.26）nm，PDI為0.154±0.016（＝3），表明SIN-NSs粒徑均一，穩定性良好。

2.6.2 Sin-NSSPE與青藤堿普通乳液穩定性比較 稱取0.2 g的青藤堿原料藥加入5 mL中鏈脂肪酸甘油三酯，1.0 mL Labrafil M1944 CS，0.5 mL聚山梨酯-80，加入50 mL純化水攪拌，使用高壓剪切機15 000 r/min剪切3 min，100 MPa下循環均質3 min，即得青藤堿普通乳液。

圖6 SIN-NCs粒徑分布

將新制備的Sin-NSSPE和青藤堿普通乳液在常溫常壓下密封保存，靜置30 d。分別于0、15、30 d取出，測定乳液CI。結果（表2）表明，Sin-NSSPE以乳劑形態存在時間更長，穩定性良好。

表2 Sin-NSSPE和青藤堿普通乳液的CI比較(, n = 3)

Table 2 Comparison of CI of Sin-NSSPE and sinomenine ordinary milk (, n = 3)

放置時間/dCI/% Sin-NSSPE青藤堿普通乳液 065.15±2.5459.15±1.87 1562.49±1.2551.49±2.15 3060.12±2.3648.72±1.13

2.6.3 Sin-NSSPE初步穩定性考察 將Sin-NSSPE室溫靜置30 d，分別于0、15、30 d取出，加入甲醇超聲破乳并稀釋定容后離心，吸取上清液加甲醇稀釋得到樣品溶液，0.22 μm濾膜濾過，測定青藤堿質量濃度。通過粒徑等指標的變化，初步考察Sin-NSSPE的常溫放置穩定性。粒徑、青藤堿質量濃度和ζ電位與0 d相比，差異不具有統計學意義，結果（表3）表明，30 d內Sin-NSSPE常溫常壓下穩定性良好。

2.7 Sin-NSSPE藥效實驗

2.7.1 佐劑性關節炎大鼠模型的建立 SD健康大鼠25只，隨機選取5只大鼠于右后足底sc 0.1 mL生理鹽水，剩余大鼠通過弗氏佐劑（complete Freund’s adjuvant，CFA，10 mg/mL）誘導法建立RA模型。當大鼠足部出現急性炎癥腫脹，全身性多發性的關節炎，表現為前肢或對側肢體甚至耳、尾部紅腫或炎性結節出現，表明造模成功。

表3 Sin-NSSPE室溫靜置后的粒徑、藥物質量濃度、ζ電位(, n = 3)

Table 3 Particle size, drug concentration and ζ potential of Sin-NSSPE after standing at room temperature (, n = 3)

放置時間/d粒徑/μm青藤堿質量濃度/(mg·mL?1)ζ電位/mV 01.58±0.314.92±0.31?29.60±2.21 152.21±0.194.84±0.42?27.79±1.76 302.45±0.254.68±0.26?26.42±1.83

2.7.2 實驗動物分組及給藥方案 注射生理鹽水的SD大鼠設為對照組，而注射CFA的大鼠分為4組，即模型組、青藤堿混懸液ig組、青藤堿混懸液關節腔注射組和Sin-NSSPE關節腔注射組。模型組在造膜后不給藥；ig組在造膜3 d后ig青藤堿混懸液，給藥劑量為18 mg/kg，連續給藥28 d；青藤堿混懸液關節腔注射組和Sin-NSSPE關節腔注射組，于造膜3 d后在大鼠右后踝關節腔分別注射50 μL青藤堿混懸液和Sin-NSSPPE，給藥劑量為1.2 mg/只，每周給藥1次，連續4周。

2.7.3 Sin-NSSPE對大鼠體質量及關節腫脹度的影響 將造膜當天定為第1天，每隔7 d測量大鼠體質量。結果（表4）表明，各組大鼠體質量之間并無顯著性差異。

參考文獻方法[12]每隔7 d對大鼠的足容積進行測定，按照公式計算關節腫脹度。結果（表5）表明，與對照組比較，模型組關節腫脹度持續升高，關節活動嚴重受限，具有RA患者相似的病理學特征，表明造模成功。給藥組均可顯著降低大鼠關節腫脹度（＜0.01）。7 d后，Sin-NSSPE關節腔注射組大鼠關節腫脹度低于青藤堿混懸液ig組和青藤堿混懸液關節腔注射組，表明Sin-NSSPE關節腔注射組治療RA具有更顯著的效果。

表4 Sin-NSSPE對大鼠體質量的影響(, n = 5)

Table 4 Effects of Sin-NSSPE on body weight of rats (, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)體質量/g 1 d7 d14 d21 d28 d 對照0205.15±5.31218.35±8.69225.69±7.15232.39±5.16236.23±6.79 模型0202.39±6.02215.49±9.15219.42±7.65238.51±6.21246.15±5.15 青藤堿混懸液ig3.8208.59±6.23217.56±7.19227.83±8.61234.86±4.54241.37±3.39 青藤堿混懸液關節腔注射1.2201.32±5.72213.55±8.53225.45±6.39239.12±5.34249.43±5.79 Sin-NSSPE關節腔注射1.2209.54±4.95221.41±9.23232.72±6.47239.72±3.92247.78±6.24

表5 Sin-NSSPE對SD大鼠關節腫脹度的影響(, n = 5)

Table 5 Effect of Sin-NSSPE on joint swelling of SD rats(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)關節腫脹度/% 1 d7 d14 d21 d28 d 對照01.59±1.202.14±1.141.86±1.392.35±1.552.08±1.99 模型01.83±1.6756.18±6.71**62.52±8.61**65.42±7.13**58.71±7.90** 青藤堿混懸液ig3.81.64±1.1652.57±7.75##46.59±8.34##48.16±9.25##42.55±6.06## 青藤堿混懸液關節腔注射1.22.15±1.3650.72±7.96##42.28±5.32##41.26±6.59##32.13±7.81## Sin-NSSPE關節腔注射1.22.61±1.1048.29±6.56##37.67±7.35##35.74±7.34##22.59±7.61##

與對照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01；下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group; same as below tables

關節腫脹度＝(造模后每周足容積－初始足容積)/初始足容積

2.7.4 Sin-NSSPE對關節炎癥指數（arthritis index，AI）評分的影響 根據參考文獻方法[13]，采用關節炎評分及計數標準（表6）對大鼠進行AI評分（右后足）。結果如表7所示，與對照組相比，模型組AI評分顯著增高（＜0.01），表明模型成功；與模型組相比，各實驗組大鼠AI評分呈現下降趨勢（＜0.05、0.01），其中Sin-NSSPE關節腔注射組可更顯著降低AI評分（＜0.01），并抑制RA病情的進一步發展。

2.7.5 Sin-NSSPE對大鼠脾指數的影響 ip水合氯醛（7%，5 mL/kg）麻醉大鼠，立即取出脾臟洗凈后，濾紙吸干，稱定脾的質量，計算大鼠的脾指數，結果見表8。與對照組比較，造模會刺激大鼠體內免疫系統，使免疫細胞大量增殖，導致脾質量增加和脾損傷（＜0.01），而青藤堿混懸液ig組和青藤堿混懸液關節腔注射組可顯著改善脾組織損傷程度（＜0.01）。而Sin-NSSPE關節腔注射組的脾損傷程度最輕，趨近于對照組，表明Sin-NSSPE治療作用良好且可顯著改善大鼠脾損傷。

表6 AI評分評價

Table 6 AI index evaluation

評分癥狀 0關節正常，無腫脹 1足趾關節或踝關節輕度腫脹 2踝關節至跖關節或掌關節輕度腫脹 3踝關節至跖關節或掌關節中度腫脹 4全足嚴重腫脹，關節僵直變形

表7 Sin-NSSPE對SD大鼠關節炎癥的影響(, n = 5)

Table 7 Effect of Sin-NSSPE on joint inflammation in SD rats(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)AI評分 1 d7 d14 d21 d28 d 對照000000 模型002.45±0.57**2.85±0.26**3.45±0.56**3.65±0.43** 青藤堿混懸液ig3.802.35±0.71#2.57±0.42#2.52±0.32##2.32±0.25## 青藤堿混懸液關節腔注射1.202.31±0.44#2.16±0.33#2.19±0.65##1.87±0.37## Sin-NSSPE關節腔注射1.202.32±0.55#2.05±0.28##2.08±0.41##1.46±0.29##

表8 Sin-NSSPE對SD大鼠脾指數以及血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的影響(, n = 5)

Table 8 Effect of Sin-NSSPE on spleen index, and IL-1β, IL-6 and TNF-α in serum of SD rats(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)脾指數/(mg·g?1)血清細胞因子水平/(ng·L?1) IL-1βIL-6TNF-α 對照02.13±0.6713.95±2.1614.52±3.6295.82±11.62 模型03.57±0.54**28.16±3.63**19.97±5.43**231.90±10.59** 青藤堿混懸液ig3.8 3.06±0.23##21.35±2.56##17.56±4.21##152.73±15.99## 青藤堿混懸液關節腔注射1.2 2.68±0.52##19.53±2.50##16.43±5.12##141.09±9.65## Sin-NSSPE關節腔注射1.2 2.46±0.38##16.36±3.32##15.19±3.55##113.67±14.83##

2.7.6 大鼠血清中指標檢測 取大鼠血清，依照ELISA試劑盒說明書，檢測大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-α表達水平，結果如表8所示。與對照組相比，模型組IL-1、IL-6和TNF-α的表達水平顯著升高 （＜0.01），表明造模成功；與模型組相比，實驗組中IL-1、IL-6和TNF-α表達水平明顯下降（＜0.01），而Sin-NSSPE關節腔注射組大鼠血清中IL-1、IL-6和TNF-α含量更趨近于對照組。

2.7.7 踝關節滑膜組織病理形態學觀察 取各組大鼠膝關節滑膜組織，在4%中性多聚甲醛中固定24 h，石蠟包埋后切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡下觀察組織病理變化。如圖7所示，對照組滑膜組織形態完整，未見滑膜組織水腫及炎癥細胞浸潤，而模型組滑膜組織明顯增生，且滑膜細胞發生病理性改變，淋巴細胞發生浸潤并伴隨著血管翳的生成。與ig組和青藤堿關節腔注射組相比，Sin- NSSPE注射組能降低組織水腫及炎癥，抑制炎癥細胞的浸潤和血管翳的生成，與對照組水平相近。表明關節腔注射Sin-NSSPE對RA具有顯著療效，可使大鼠關節恢復正常的活動功能。

圖7 Sin-NSSPE治療28 d后SD大鼠關節滑膜的組織學分析

2.7.8 Western blotting檢測滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達 加入RIPA裂解液后，將滑膜組織進行研磨，冰上裂解30 min，10 000 r/min離心（離心半徑為6.3 cm）30 min提取總蛋白，用BCA法檢測蛋白含量。蛋白變性后上樣，進行SDS-PAGE電泳（電壓80～110 V）2 h，轉膜（電流320 mA）3 h，用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入TNF-α、IL-1β和IL-6一抗，4 ℃下培養12 h，TBST洗膜3次，加入二抗（辣根過氧化物酶標記）室溫下孵育2 h，TBST洗膜后在ECL顯影液中成像，Image J軟件獲得實驗結果。

如圖8和表9所示，將內參蛋白的表達量設為1，與模型組相比，Sin-NSSPE關節腔注射組顯著降低IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達（＜0.05、0.01），表明關節腔注射Sin-NSSPE可通過下調標志性蛋白的表達從而抑制RA。

圖8 滑膜組織中TNF-α、IL-1β、IL-6和β-actin蛋白表達水平

表9 Sin-NSSPE對滑膜組織中TNF-α、IL-1β和IL-6表達分析(, n = 5)

Table 9 Analysis of expression of TNF-α, IL-1β and IL-6 in synovial tissue by Sin-NSSPE(, n = 5)

組別劑量/(mg·只?1)蛋白相對表達量 TNF-αIL-1βIL-6β-actin 對照00.78±0.020.63±0.040.65±0.011.00 模型01.31±0.03**1.14±0.01**1.22±0.03**1.00 青藤堿混懸液ig3.8 1.25±0.051.09±0.041.26±0.051.00 青藤堿混懸液關節腔注射1.2 1.08±0.02#0.87±0.01#1.18±0.041.00 Sin-NSSPE關節腔注射1.2 0.96±0.06##0.71±0.02##1.02±0.04#1.00

3 討論

從青藤中提取出的青藤堿具有多種藥理作用，它對RA、腫瘤、心血管系統疾病等均具有較好的療效[14-15]。但青藤堿口服給藥方式具有藥物利用度低、口服劑量大、不良反應增加等缺點，這限制了其對局部RA的治療效果。而關節腔注射給藥是指在關節腔直接給藥，使藥物積蓄在關節內，以恒定、接近恒定或需要的速度釋藥，在局部或者是全身維持藥物有效濃度從而產生治療效果，能避免口服給藥引起的血藥濃度峰谷和半衰期短等問題。本研究改變了傳統給藥方式，通過關節腔注射給藥的方式，使藥物迅速、高效的富集在病灶部位，從而提高了青藤堿的用藥安全性，達到減毒增效的治療目的。

本研究成功制備新的青藤堿劑型，Sin-NSSPE劑型使藥物利用度得到增加，究其原因，相比于青藤堿原料藥，藥物在Sin-NCs和Sin-NSSPE中以納米形態存在，更有利于藥物的吸收，從而增加了藥物利用度，同時相較于Sin-NCs，藥物溶解于Sin- NSSPE油相中形成藥物貯庫效應，有更高的載藥量的同時緩慢釋放藥物，提高了藥物利用率。而相比于傳統口服給藥方式，關節注射給藥使藥物在關節腔內緩慢釋放并增加駐留時間，獲得了藥物利用度和治療效果的提高。而粒徑是影響駐留時間的關鍵因素，同時研究表明，關節腔內藥物粒徑小于250 nm，藥物會直接在關節腔內逃逸，而過大的粒徑會在關節腔內摩擦病理組織，導致關節腔內炎癥進一步惡化[16-17]，而粒徑在1～4 μm時會被關節內的巨噬細胞所吞噬，藥物可通過巨噬細胞系統的控制釋放達到持續釋放的目的。所以在巨噬細胞釋藥和貯庫效應的雙重作用下，Sin-NSSPE可提高治療效果，因此，在劑型制備過程中，對油相比例、水相pH值和青藤堿質量濃度進行單因素考察，以期實現最小粒徑和藥物貯庫效應，最佳工藝確定在水相pH值為4時粒徑最小且均勻，中鏈脂肪酸甘油三酯比例為0.5和青藤堿質量分數為0.5%時，乳液穩定性和載藥量最好。

本研究通過SD大鼠進行CFA造膜，評價和比較Sin-NSSPE注射組和其他給藥組的抗炎效果，實驗結果證明，與青藤堿的ig組和關節腔注射組相比，Sin-NSSPE關節腔注射組藥效指標存在顯著性差異，Sin-NSSPE注射組可顯著降低大鼠關節腫脹度和AI水平，并改善脾組織損傷程度，顯著性下調大鼠滑膜組織中IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白的表達，同時有效緩解大鼠關節的組織水腫、關節炎癥和滑膜組織增生，控制了新血管的生成和炎癥細胞的浸潤，表明關節腔注射Sin-NSSPE可有效改善RA的病癥，提高治療效果，但對于注射Sin-NSSPE的安全性和體內藥物代謝仍需進一步的研究。

Sin-NSSPE的制備驗證新劑型的可行性，推動青藤堿新劑型的發展，為臨床用藥提供更多選擇，與其他納米乳劑相比，Pickering乳液劑避免了異種顆粒作為穩定劑從而降低了不良反應，同時在關節腔內形成藥物貯庫效應，緩慢釋放藥物以提高了藥物療效，因此對于青藤堿來說，NSSPE是一種潛在的給藥系統。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and pharmacodynamics of sinomenine nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions injected into articular cavity

ZHANG Jun-hao1, LIANG Xiao1, BAI Hao-tian1, LI Ya-lan1, SUN Shu-hui1, ZHANG Qian-qian1, YANG Jing2, WANG Rui1, 3

1. School of Pharmacy, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 2. College of Basic Medicine, Heilongjiang University of Traditional Chinese Medicine, Harbin 150040, China 3. Key Laboratory of Basic and Applied Research of Northern Medicine, Ministry of Education, Harbin 150040, China

Sinomenine nanocrystals self-stabilized Pickering emulsions (Sin-NSSPE) injection was prepared for joint cavity, and a drug depot was formed in the joint cavity, which was slowly released to improve the bioavailability and reduce the toxic and side effects of the drug. Sin-NSSPE injection was prepared with sinomenine nanocrystalline (Sin-NCs) itself as a stabilizer, and the therapeutic effect on rheumatoid arthritis (RA) was investigated by pharmacodynamic experiments.Sin-NSSPE was optimized by factors such as drug concentration, oil-water ratio and pH of water phase, and RA model was established in SD rats with Freund’s adjuvant arthritis method. Toe swelling, arthritis index, spleen index, histopathological examination and Western blotting method were used as indicators for detection.The results showed that Pickering emulsion had uniform particle size and good drug loading, the average particle size of Sin-NCs was (121.49 ± 18.26) nm, the particle size of Sin-NSSPE was (1 159.60 ± 160.15) nm, and the drug loading was 4.92 mg/mL. Pharmacodynamics experiments showed that, compared with the intragastric administration of sinomenine, Sin-NSSSPE joint cavity injection group can effectively reduce joint swelling and inflammation index, improve synovial tissue lesions and inhibit joint inflammation. Both the sinomenine intra-articular injection group and the Sin- NSSPE intra-articular injection group could significantly improve the toe swelling of rats, reduce the expression of inflammatory factors and relieve the RA condition. However, the experimental results showed that Sin-NSSPE had a better therapeutic effect, and the stability of the dosage form was improved, which formed a drug reservoir, making the drug effect more stable.The above results indicated that the prepared Sin-NSSPE had stable properties, and intra-articular injection of Sin-NSSPE had a good therapeutic effect on RA in rats.

sinomenine; submicron Pickering nanoemulsion; joint cavity injection; rheumatoid arthritis; reservoir effect; macrophage drug release

R283.6

A

0253 - 2670(2022)20 - 6412 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.20.013

2022-05-13

國家自然科學基金資助項目（82074271）；國家自然科學基金資助項目（81603418）；黑龍江省屬本科高校中央支持地方高校改革發展項目（2020YQ05）

張筠昊，碩士研究生，研究方向為新藥及新劑型研究。Tel: 17745127916 E-mail: 1175389015@qq.com

王 銳，教授，碩士生導師，博士，研究方向為新藥及新劑型研究。Tel: (0451)87266893 E-mail: wrdx@sina.com

[責任編輯 鄭禮勝]