病毒哪里藏
——核酸檢測金標準

高耿欣，陳建成

1南京大學新生書院安邦書院，南京 210023

2南京大學化學化工學院，南京 210023

2022年春，新冠疫情在國內卷土重來。大學生小何通過與同學和醫護人員的交流，逐步了解了核酸檢測的原理，明白了核酸檢測被稱為新冠病毒檢測“金標準”的原因。

1 全民核酸

“小何，排隊的人好多呀，還要等多長時間才輪到我們采樣呀？”同學小智不停地向小何抱怨著。

小何往前看去，核酸檢測點前，人們排著長長的隊伍，緩慢地前進。

來勢洶洶的疫情又一次爆發在小何所在的城市。為了應對突然爆發的疫情，所有人被緊急通知前來接受核酸檢測。

“今天好熱，排隊等待核酸檢測真難受啊！難道核酸檢測的過程非常復雜嗎？不然為什么隊伍前進的速度這么慢！”小何很是疑惑。

“整個檢測過程確實很復雜，不過我們參與完成的其實只是檢測最簡單的第一部分，麻煩的是實驗室檢測過程。”小智解釋道。

“啊，我不太了解呢。”小何撓撓頭，雖然接受過很多次核酸檢測，但是它的原理是什么，小何并不知道。

還沒來得及向小智請教，隊伍前面一陣熙熙攘攘的聲音引起了小何的注意。

“小伙子啊，我這個確實不會用，不能做核酸檢測嗎？”排在前面的一個老人著急地向醫護人員問道。

“老人家，核酸檢測得提前預約啊，您找人幫您預約一下，再來檢測，好嗎？”

原來是一位老人家不會使用智能手機，沒有提前在網上進行預約，所以被醫護人員攔了下來。

“小何你看，在網上提前預約，再到采樣點進行采樣，這樣的流程對我們而言很簡單，但是對于那些不會上網的老人家來說，是非常不方便的。”小智感嘆道。

“為什么不上門檢測？就是醫護人員到家里來采樣？這樣我們就不用冒著這么熱的天來參加了。”

“沒有你想的那么簡單。我們的城市有這么多人口，而醫護人員和志愿者的數量是十分有限的，都采取上門采樣不現實。更何況，在這次緊急的疫情中，時間就是生命，上門檢測效率太低，沒法達到時效性。”

“可是你看我們在這里排隊，等待時間長不說，人員也非常聚集，萬一有病毒感染者，不是非常危險嗎？”小何問道。

“這確實是避免不了的問題，大規模的集中核酸檢測效率高，但是難免導致人員聚集，帶來感染的風險，所以我們必須戴好口罩，站在‘一米線’外，盡量做好防護！”

“好了，到我們了，先采樣吧。”

2 核酸檢測——金標準

“搞定！明天應該可以在手機上查詢到檢測的結果。”

“剛剛你說了，疫情中時間就是生命，那這段時間的等待在疫情中其實還蠻長的！”小何感嘆道。

完成了核酸采樣，回寢室的路上，回想剛剛接受核酸采樣的經歷，小何做了許多思考。核酸檢測其實有許多不便之處：網上預約不方便；排隊非常消耗時間；集中采樣有較高的感染風險；得到結果的時間較長。但人們都說，核酸檢測是檢測新冠病毒的“金標準”。

除了小智說的集中大規模采樣效率高，核酸檢測還有哪些特點，使其成為了病毒檢測的“金標準”？

“小智，你能給我講講核酸檢測的原理嗎？”

“好呀！其實我們參與的只是核酸檢測的第一步：采樣。

醫護人員用咽拭子在我們喉嚨里擦拭，其實是在采取呼吸道上皮細胞樣本。這是因為新冠病毒可以存活在我們的呼吸道細胞中。還有一種拭子是從鼻咽取樣，叫作鼻拭子。”

“可是那一點點的樣品怎么能檢測出有沒有感染病毒呢？”小何想到醫護人員只采了那么一點點樣品，不禁擔心道。

“不用擔心，要想解釋這個問題，就必須提到樣品檢測的具體過程。目前檢測新冠病毒常用的是一種名為RT-PCR實時熒光法的基因檢測方法。

大體上來說，這是一種嘗試精確復制基因并判斷目的基因是否存在的技術。醫護人員采集到的樣品首先需要在實驗室中純化提取，得到核酸。如果被測樣品含有病毒，那么病毒的核酸就可以被擴增并通過實時熒光法檢測到。

了解這個方法的具體操作之前，我們得先知道RT，PCR和實時熒光分別是什么。

RT是Reverse Transcription的簡稱，即反轉錄。由于新冠病毒是RNA單鏈病毒，想要大量擴增其核酸，首先需要在反轉錄酶的作用下反轉錄產生雙鏈結構的cDNA。cDNA的兩條單鏈符合核苷酸的堿基互補配對原則，在氫鍵的連接下形成雙螺旋結構。

PCR是Polymerase Chain Reaction的簡稱，即DNA聚合酶鏈式反應，是擴增基因的主要過程。在反應體系中，核苷酸原料在聚合酶的催化和引物的引導下，利用堿基互補配對原則與模板基因配對產生大量副本。如果把某段基因的擴增比作復印一本書中的某一部分內容，PCR反應就是在復印機上復印的過程。需要擴增的目的基因序列就是一本書；DNA聚合酶就像是復印機的打印噴頭，復印得到的內容從聚合酶產出；游離的各種核苷酸像是復印所需要的各種顏色的墨水，是這個擴增反應的原料；根據特定目的基因序列設計出的正向引物和反向引物就像是用來標記復印起點和終點的書簽，限制著復印的范圍。

熒光探針，本質上是一小段可以和目的基因互補配對結合的基因序列，它應位于正向引物和反向引物之間。在這一小段的基因序列兩端，分別含有一個熒光信號源和信號淬滅劑。在特定光照下，熒光信號源會發出相應的熒光信號；而如果它的附近有信號淬滅劑，那么熒光就會被吸收。這種熒光淬滅機制使得這個探針在保持完整的時候是不會發出熒光信號的。一旦熒光信號源處于游離狀態，它發出的熒光就可以被檢測到[3]。”

聽過小智的簡單介紹，小何似乎更加困惑了。

“那我們不妨用具體的反應過程來說明，”小智看出了小何的困惑。

“假設被測的樣品是含有病毒的。

首先是反轉錄過程。在反轉錄酶的作用下，樣品中的病毒RNA轉化成為雙鏈的cDNA。

然后是PCR反應過程。PCR總共分為三個步驟[1,2]。

第一步，變性。被送入PCR反應體系的cDNA在95 °C的高溫下斷開成為兩條單鏈，使得核酸的堿基可以暴露出來。

第二步，退火。這個過程中，溫度降低到55 °C左右。針對目的基因設計的引物可以連接到病毒的單鏈DNA上。與此同時，“探針書簽”——熒光探針也會結合到目標基因序列的相應互補位置上。引物就像是一個書簽，標記了在PCR過程中目的基因的位置，確定了復制的范圍。病毒核酸的復制過程在正向引物結合的地方正向開始，在反向引物結合的地方反向開始，于是復制被限制在這兩端引物之間。這樣復制出的部分就是我們需要的目的基因片段。

可能你會疑惑，我們為什么要設計引物來限制復制的片段呢？直接把整條核酸全部復制下來不可以嗎？其實設計引物的目的有以下兩點：第一，引物是DNA聚合酶結合的位置，所以沒有引物反應是沒法發生的；第二，正向反向兩種引物的限制可以節約反應原料。

第三步，延伸。反應溫度再次被升高到72 °C左右，激活體系中的DNA聚合酶。聚合酶分別從正向引物和反向引物處開始不斷接入核苷酸，延伸新的核酸鏈。而在延伸的過程中，觸碰到兩個引物之間的熒光探針，導致熒光信號源游離出來，淬滅機制被破壞，使得熒光可以顯現。

PCR不斷重復變性、退火、延伸的過程。本來極少量的病毒核酸會在一次一次的循環中以指數形式實現數量的增長。這個過程正如圖1所示。”

圖1 PCR反應原理圖

“哦，我明白了！原來PCR反應中，病毒核酸的數量是指數爆炸式的增長啊！那么只需要一點點樣本，就可以反應得到很多很多的一模一樣的核酸了！”小何恍然大悟。

“你說的沒錯，也正是因為核酸在數量上呈現指數增長，我們才可以通過熒光強度的增長來判斷是否含有目的基因。

如果被檢測的樣本是含有病毒核酸的，每經歷一次循環，被檢測的目的基因就會擴增一倍，接入目的基因的熒光探針和釋放的熒光源也會增加一倍，直到反應結束。當然，隨著原料的消耗，反應也會趨于停止，所以目的基因的數量和熒光強度會呈現S型增長。那么如果檢測到了熒光也就代表檢測到了病毒基因，所以結果就稱為陽性。

如果被檢測的樣本不含病毒核酸，那么在PCR反應過程中就沒有目的基因被擴增，熒光探針也無法結合，其淬滅機制仍然存在，就不會檢測到熒光。”小智進一步解釋道。

“那我們檢測的目的基因到底有哪些呀？”

“目前我們檢測的主要是新冠病毒特殊的N基因和ORF (open reading frame) 1ab基因，引物和熒光探針也是根據這兩個基因的序列設計的。中國最早發布的冠狀病毒全基因組序列幫助科學家們迅速確認了兩種目的基因。”

“精確的病毒遺傳信息，巧妙的復制過程，可靠的熒光檢測法，這些都保證了核酸檢測的準確性，難怪我們稱核酸檢測為金標準！”

3 單采，混采和混檢

過了幾天，疫情形勢依然嚴峻，按照學校要求，小何和小智參與了第二輪核酸篩查。

一樣的網上預約，一樣的排隊。

每一次篩查的范圍都是全民的，那么要采集的樣本數量也是巨大的。如果對每一個樣品都要單獨進行擴增的話，那豈不是要很多很多的PCR儀器？小何一邊排著隊，一邊思考著。

采樣時，小何注意到了一個奇怪的現象：醫護人員并沒有單獨存放每一個人采樣的咽拭子，而是把多個咽拭子放在一個試管里。為什么這么做[1,2]？

“護士姐姐您好，請問為什么把不同人的咽拭子放在一個試管里呀？這樣不會互相污染嗎？”

“同學你好，這是因為我們采用的是混合采樣呀。”

“混合采樣？就是把好幾個人的樣品混合到一起嗎？可是這樣，結果的準確性還能保證嗎？”小何坐不住了。

“你的懷疑是有道理的，我來給你解釋吧。”小智一把拉過做完采樣的小何。

“其實混合采樣是充分權衡準確性和檢測效率的結果，這其中蘊含著非常巧妙的數學原理。混合采樣并不是把隨意數量的樣本放在一起拿去檢測。”

“我們要檢測的樣本那么多，如果每個人都用一個試管收集樣本，每個樣本都需要單獨檢測，那得需要多少檢測設備和時間啊！

你想一想，其實接受檢測的大部分人都沒有感染新冠病毒，所以大部分人的檢測結果其實都是陰性。這就為混合采樣提供了可能。”小智向小何解釋道。

“哦！所以把多人的樣品放在一起，如果這個試管的樣品都沒有檢測出陽性，就可以說明這些人都是未感染的！畢竟在感染率較低的地區，即使樣品混合在一起，最終的檢測結果為陰性才是大概率事件！”小何恍然大悟。

“是這樣的，用混采的方式采集樣本，不僅節約了大量的試管，也節約了時間，尤其對于這樣的大范圍篩查。我們必須要考慮到效率和成本啊！此外，混合采樣不僅方便了采樣過程，也極大地方便了實驗室的檢測過程。”小智說道。

“可是如果發現陽性了呢？我們沒法確定混合樣品的提供者中，到底誰是感染者。”小何細細一想，又發現了問題。

“如果這個混采樣品的反應結果是陽性，那么混合采樣的這一組人都有可能是病毒感染者，所以必須再次單獨地對這幾個人進行檢測，最后確定病毒的感染者。”

“那么確定混合的人數就顯得非常重要！如果混合比例過高，極容易因為一個陽性就要讓許多人都要再檢測一次，反而浪費時間和原料。”小何發現了混采的關鍵。

“你說的沒錯，混合的比例和多個因素相關。簡單來說，如果被檢測的人群中感染率很高，那我們就應該適當降低混合比例；如果感染率不高，就可以提高混合的比例。事實上，我們有一套完整的數學模型來計算混合的比例。”小智詳細地向小何解釋道。

“全民的核酸篩查是大規模、大范圍的檢測，如何保證高效率同時盡可能節約人力物力檢測，確實是一門學問啊！”小何感嘆道。

4 抗原試劑盒

嚴峻的疫情形勢下，小何的大學進行了封校封樓的疫情管控措施。聚集采樣確實會帶來不小的感染風險。那有沒有不用核酸采樣，一個人在隔離期間可以自行完成的檢測方法呢？

學校為同學們提供了一種更加方便快速的檢測方法——抗原試劑盒。

“小智，你覺得抗原試劑盒可以做到核酸檢測那樣準確嗎？”小何看著手中的試劑盒問道。

“你知道，病毒是由外層的蛋白質外殼和內層的核酸遺傳物質組成的，如果說核酸檢測中檢測的是病毒的內核，那么抗原檢測就是檢測病毒的外衣。

抗原自測的原理是抗原和抗體的結合。抗原和抗體就像是一個榫頭一個卯。抗原是病毒的外衣，有特定的化學結構。抗原檢測中，鼻拭子上會被放置一些專門的抗體，如果被檢測的樣本是帶有病毒的，那病毒的抗原就會和拭子上的抗體結合，發生反應，從而被我們觀察到。

但是，蛋白質沒法像核酸那樣通過PCR技術擴增，所以如果病毒量不大，抗原檢測就很難準確檢測。所以，抗原檢測是肯定不能代替核酸檢測的[2]！”

“但是抗原檢測確實非常方便快捷，自己在家就可以完成測試，雖然不像核酸檢測那么準確，但是也有它發揮用處的地方，比如我們這些封樓隔離的人，等待結果的時間也大大縮短了。”說著，小何和小智都笑了。

然而，抗原自測的準確性和個人操作的規范性是否達標有很大關系。倘若自測人員的操作不夠規范，也會影響到采集到的樣品和檢測結果的準確性。

5 結語

總之，無論核酸檢測還是抗原檢測，都是利用現有方法檢測新冠病毒的特異性成分。不同之處在于，檢測核酸的過程中，我們可以利用生物化學的方法把采集到的少量樣本，通過擴增反應得到大量副本，從而提高檢測精度；而對于抗原自測，當病毒量較少以及自測操作不夠準確規范時，其可靠性會大大下降。

新冠疫情來勢洶洶，對于新冠病毒的檢測我們目前有多種可行的方法，可以在不同的需求和情境下，各取所長。但是，核酸檢測依然是新冠病毒檢測的金標準。