白來航雞半乳糖凝集素-1基因克隆、生物信息學及組織表達特性分析

2022-10-20 08:27:32夏宇欣王立強侯少陽溫海燕葛仕豪周宛蓉姜莉莉樊兆斌

中國畜牧獸醫 2022年10期

張凱,夏宇欣,王立強，侯少陽,溫海燕,葛仕豪,周宛蓉,姜莉莉，樊兆斌

(菏澤學院藥學院，菏澤 274015)

半乳糖凝集素(galectin)是一種典型的動物半乳糖結合蛋白，在多種動物體內廣泛分布，對β-半乳糖苷具有較強的親和力，在細胞黏附、細胞凋亡、炎癥反應、腫瘤轉移等許多生理和病理過程中發揮重要作用[1-2]。半乳糖凝集素-1(Gal-1)是第一個被報道的哺乳動物半乳糖凝集素[3]，作為可溶性多功能蛋白，可通過結合多種病毒表面的聚糖從而介導宿主與病原體的相互作用[4]。Gal-1能夠與流感病毒[5]和Nipha病毒[6]的囊膜糖蛋白結合，抑制二者的感染；通過與人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)殼膜蛋白gp120和宿主受體蛋白CD4上的多糖結合，促進HIV-1的吸附和感染[7]。新城疫病毒(NDV)等禽類呼吸道病毒可以誘導雞Gal-1基因在主要靶器官中的表達上調。雞Gal-1基因通過與新城疫病毒(NDV)血凝素-神經氨酸酶(HN)糖蛋白上的G-四鏈體(G4)N-聚糖結合發揮抗NDV作用；對HN糖基化突變的NDV在Gal-1基因敲除和過表達細胞中的復制研究表明，NDV的復制與Gal-1基因的表達存在特定的糖依賴方式[8]。Gal-1基因參與機體在病毒感染早期的抗病毒固有免疫反應，可誘導鴨瘟病毒感染鴨的免疫應答和抗病毒能力，顯著抑制感染早期鴨瘟病毒的復制[9]。

目前針對哺乳動物Gal-1基因的研究較為廣泛和深入[3-6]，但對于家禽Gal-1基因的研究報道相對較少。本研究通過對白來航雞Gal-1基因進行克隆、測序及序列分析，利用在線軟件對該基因編碼蛋白進行生物信息學分析，并檢測不同組織中Gal-1基因的表達，以期為Gal-1基因編碼蛋白的抗病毒功能的深入研究提供有價值的參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 3只3周齡健康的白來航雞購自菏澤市某養殖場。屠宰后，采集每只白來航雞的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、十二指腸、空腸、盲腸、直腸、腺胃、肌胃、胸肌和腿肌組織，置于1.5 mL RNase/DNase Free離心管中，―70 ℃保存備用。

1.1.2 主要試劑動物組織總RNA提取試劑盒、FastKing cDNA第一鏈合成試劑盒、2×TaqPCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、質粒小提試劑盒、pGM-T載體、大腸桿菌DH5α感受態細胞、T4 DNA連接酶等均購自天根生化科技(北京)有限公司；限制性內切酶BamH Ⅰ與NotⅠ購均自寶日醫學生物技術(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及合成根據GenBank中原雞Gal-1基因序列(登錄號：NM_205495.2)，利用Primer Premier 5.0設計Gal-1基因擴增引物及實時熒光定量PCR引物，以GAPDH為內參基因，引物信息見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.2Gal-1基因克隆及測序按照RNA提取試劑盒說明書提取雞各組織總RNA并反轉錄合成cDNA。以合成的脾臟cDNA為模板，進行雞Gal-1基因PCR擴增。PCR反應體系50 μL:2×TaqPCR MasterMix 25 μL,cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經膠回收試劑盒回收，與pGM-T載體16 ℃過夜連接，產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，接種于LB(Amp+)平板，37 ℃過夜培養，挑取單個圓滑白色菌落，PCR驗證正確后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。用NCBI中BLAST程序對測序結果進行相似性比對。

1.2.3 相似性比對及系統進化樹構建利用DNAStar中的MegAlign軟件將白來航雞(White Leghorn chicken)與綠頭鴨(Anasplatyrhynchos，XM_005015962.4)、火雞(Meleagrisgallopavo，XM_003202240.3)、珍珠鳥(Taeniopygiaguttata，XM_012569200.1)、馬(Equuscaballus，XM_001501032.5)、藏羚羊(Pantholopshodgsonii，XM_005955615.1)、羊駝(Vicugnapacos，XM_006207063.2)、人(Homo，CR456511.1)、小鼠(Musmusculus，NM_008495.2)、大鼠(Rattusnorvegicus，NM_019904.1)的Gal-1基因核苷酸序列進行相似性比對，利用Mega 5.0軟件構建系統進化樹。

1.2.4 生物信息學分析用ProtParam在線軟件(https:∥web.expasy.org/protparam/)分析Gal-1蛋白的理化性質；用ProtScale在線軟件(https:∥web.expasy.org/protscale/)分析蛋白親/疏水性；用TMHMM 2.0在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)對蛋白跨膜結構進行預測分析；用NetPhos 3.1 Server(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetPhos-3.1)、NetOGlyc 4.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)和NetNGlyc 1.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)在線軟件進行潛在磷酸化位點及O-糖基化位點、N-糖基化位點預測；用SignalP 5.0在線軟件(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預測蛋白信號肽；用SMART在線軟件(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)預測蛋白結構域；用SOPMA在線軟件(http:∥npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白二級結構；通過SWISS-MODEL在線軟件(http:∥swissmodel.expasy.org/)預測蛋白三級結構。

1.2.5Gal-1基因組織表達特性檢測以雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌、十二指腸、空腸、盲腸和直腸cDNA為模板，以GAPDH為內參基因，采用實時熒光定量PCR檢測Gal-1基因在不同組織中的相對表達量。PCR反應體系10 μL:SYBR Premix ExTaq(2×) 5 μL，上、下游引物各0.3 μL,cDNA 0.5 μL，ddH2O 3.9 μL。PCR反應程序:95 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共45個循環；熔解程序:95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。每個組織樣品設3個重復，利用2-ΔΔCt法計算Gal-1基因在雞不同組織中的表達情況。

1.3 數據統計及分析

所有試驗都重復至少3次。使用SPSS 28.0軟件進行單因素方差分析，采用LSD和鄧肯氏法進行多重比較，結果表示為平均值±標準差。P<0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 Gal-1基因CDS區克隆及序列分析

PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，擴增片段大小約為432 bp(圖1)，與預期大小一致。應用DNAMAN軟件分析測序結果顯示，Gal-1基因CDS區全長為408 bp，與NCBI上發表的雞Gal-1基因(登錄號：NM_205495.2)序列相似性為99.9%，共編碼135個氨基酸，堿基組成分別為A(24.02%)、C(28.19%)、G(24.51%)、T(23.28%)，GC含量為52.7%，高于AT含量，說明Gal-1基因編碼區的DNA雙鏈較穩定。

2.2 Gal-1基因核苷酸序列相似性比對及系統進化樹構建

利用DNAStar中的MegAlign軟件對不同物種Gal-1基因序列進行相似性比對，結果顯示，白來航雞Gal-1基因與火雞、綠頭鴨和珍珠鳥的相似性分別為97.1%、88.4%和82.2%，與其他物種的相似性較低(圖2)。系統進化樹分析結果表明，白來航雞與火雞親緣關系最近，與綠頭鴨的親緣關系相對較近，形成一個分支；與其他物種親緣關系較遠，人、小鼠、馬等哺乳動物形成另外一個分支(圖3)。

圖2 不同物種間Gal-1基因核苷酸序列相似性比對Fig.2 Similarity alignment of nucleotide sequences of Gal-1 gene in different species

圖3 Gal-1基因系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Gal-1 gene

2.3 生物信息學分析

2.3.1 理化性質預測利用ExPASy在線工具ProtParam對Gal-1基因編碼蛋白的理化性質預測結果表明，Gal-1蛋白分子式為C677H1034N184O195S6，理論分子質量為15.06 ku，理論等電點為6.57，編碼135個氨基酸，其中甘氨酸(Gly)和亮氨酸(Leu)含量最多，所占比例均為8.9%，含量最低的氨基酸是色氨酸(Tyr)，所占比例為0.7%。Gal-1蛋白的不穩定系數為36.05，低于閾值40，表明該蛋白比較穩定。在哺乳動物網織紅細胞內的半衰期為30 h，脂肪系數為74.30。

表2 白來航雞Gal-1蛋白的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.3.2 親/疏水性預測利用ProtScale工具分析Gal-1蛋白的親/疏水性，結果見圖4。由圖4可知，在72位氨基酸處親水性最強，在23位氨基酸處疏水性最強,整個多肽鏈有2個明顯的親水區，綜合平均親水指數為-0.259。說明Gal-1蛋白為親水性蛋白。

2.3.3 跨膜區、信號肽和保守結構域預測利用TMHMM 2.0在線軟件分析Gal-1蛋白跨膜區，結果表明該蛋白不存在跨膜區(圖5)。利用SignalP 5.0 Server工具預測Gal-1蛋白信號肽，結果表明該蛋白不含信號肽(圖6)，說明該蛋白不是分泌型蛋白。利用EMB的SMART程序對Gal-1蛋白保守結構域預測結果表明，該蛋白具有GLECT家族典型的同源結構域(圖7)。

圖4 白來航雞Gal-1蛋白親/疏水性預測Fig.4 Hydrophilic and hydrophobic prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖5 白來航雞Gal-1蛋白跨膜結構域預測Fig.5 Transmembrane domain prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖6 白來航雞Gal-1蛋白信號肽預測Fig.6 Signal peptide prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖7 白來航雞Gal-1蛋白保守結構域預測Fig.7 Conserved structure domain prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.3.4 磷酸化位點與糖基化位點預測蛋白修飾結構預測結果表明，該蛋白有6個絲氨酸(Ser)磷酸化位點、6個蘇氨酸(Thr)磷酸化位點和1個酪氨酸(Tyr)磷酸化位點(圖8)；不存在O-糖基化位點，在第94位天冬酰胺殘基的酰胺氮原子處存在1個N-糖基化修飾位點(圖9)，其概率為0.5062。

圖8 白來航雞Gal-1蛋白磷酸化位點預測Fig.8 Phosphorylation site prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖9 白來航雞Gal-1蛋白N-糖基化位點預測Fig.9 N-glycosylation site prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.3.5 二級結構與三級結構預測利用SOPMA在線軟件預測Gal-1蛋白二級結構，結果顯示，該蛋白由α-螺旋、β-折疊、延伸鏈及無規則卷曲組成，所占比例分別為2.22%、10.37%、41.48%和45.93%(圖10)；利用SWISS-MODEL預測該蛋白的三級結構，結果顯示，三級結構主要由無規卷曲及延伸鏈構成(圖11)，與二級結構預測結果一致。

①h，α-螺旋；t，β-轉角；c，無規則卷曲；e，延伸鏈。②線條從長到短依次代表α-螺旋、延伸鏈、β-轉角和無規則卷曲 ①h,Alpha helix;t,Beta turn;c,Random coil;e,Extended chain.②The lines by the length represent alpha helix,extended chain,beta turn and random coil,respectively圖10 白來航雞Gal-1蛋白二級結構預測Fig.10 Secondary structure prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

圖11 白來航雞Gal-1蛋白三級結構預測Fig.11 Tertiary structure prediction of Gal-1 protein in White Leghorn chickens

2.4 Gal-1基因在雞各組織中的表達

由圖12可知，Gal-1基因在肺臟中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，在腦中表達量最低。在不同組織中的表達排序為：肺臟>盲腸>脾臟>直腸>空腸>肌胃>腺胃>十二指腸>腿肌>肝臟>腎臟>胸肌>心>腦。

肩標不同字母表示差異顯著(P<0.05)；肩標相同字母表示差異不顯著(P>0.05) Values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05);While with the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)圖12 Gal-1基因在白來航雞不同組織中的相對表達量Fig.12 Relative expression of Gal-1 gene in different tissues of White Leghorn chickens

3 討論

半乳糖凝集素是一類多功能凝集素,在病原體黏附宿主細胞和激活宿主固有免疫和適應性免疫中發揮關鍵作用，其不僅可以作為模式識別受體，還可以作為效應因子，通過促進吞噬、自噬等方式調節機體反應[10]。Gal-1是一種結合β-半乳糖苷的哺乳動物凝集素，可表達于多種類型的細胞，通過調節細胞與細胞、細胞與基質的黏附，在誘導凋亡、影響細胞間信號轉導等方面發揮作用[11-12]。Gal-1可通過與囊膜病毒表面的糖蛋白結合，介導宿主與病原體之間的相互作用[13-15]，已有研究結果表明，Gal-1與豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)膜蛋白 E相互作用抑制病毒的復制，此外，Gal-1可抑制豬瘟病毒、偽狂犬病病毒、馬動脈炎病毒、日本腦炎病毒和豬流行性腹瀉病毒等多種病毒復制[16]。本研究結果表明，Gal-1基因CDS區長度為408 bp，編碼135個氨基酸，編碼蛋白無跨膜區、不含信號肽，這與Han等[9]和趙志峰等[17]對櫻桃谷鴨和梅花鹿的Gal-1基因研究結果一致。本研究對Gal-1基因編碼蛋白跨膜結構及信號肽預測結果提示該蛋白可能在細胞內發揮生物學功能，與Camby等[18]研究發現Gal-1基因主要分布于細胞質，可能通過與細胞質蛋白和細胞核中的核糖核蛋白結合，在轉錄調節、mRNA前體剪切和轉運過程中發揮功能的預測結果一致。本研究對白來航雞Gal-1基因編碼蛋白潛在磷酸化位點和糖基化位點預測分析結果顯示，該編碼蛋白共有13個潛在磷酸化位點和1個N-糖基化位點，提示這些位點作為Gal-1蛋白翻譯后修飾的關鍵位點可能在其發揮信號轉導、免疫等生物學功能中起到一定作用。本研究通過預測分析雞Gal-1基因編碼蛋白的結構及功能，可為Gal-1蛋白的抗病毒功能的深入研究提供參考依據。

Han等[9]對櫻桃谷鴨Gal-1基因組織表達特性研究發現，Gal-1在健康櫻桃谷鴨心臟、肺臟、脾臟、腎臟、食管、氣管等不同組織中均有不同程度的表達。本試驗利用實時熒光定量PCR對白來航雞Gal-1基因分析顯示，該基因在白來航雞心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、腦、十二指腸、空腸、盲腸、直腸、腺胃、肌胃、胸肌、腿肌組織中均有表達，其中在肺臟中表達量最高，在腦中表達量最低，提示Gal-1基因廣泛分布于宿主的先天免疫系統中，且其表達量具有組織特異性。Gal-1一般可參與腫瘤細胞的各個發展階段，在腫瘤的發展和轉移中發揮重要作用[19-20]。高波波等[21]研究表明，肺癌組織中Gal-1基因陽性表達率較高，張卉等[22]研究證實Gal-1基因在結腸腺癌組織中高表達，且與結腸腺癌的發生、發展密切相關。此外，研究發現Gal-1基因在多種腫瘤如黑色素瘤、星形細胞瘤、前列腺癌、甲狀腺腫瘤等中的表達均增高[23]。因此，抑制Gal-1被認為是潛在的治療癌癥的方法之一[24]。Gal-1還能夠與CD4細胞特異性結合，被認為是開發抗艾滋病藥物的有效分子靶點[25]。本試驗通過對白來航雞Gal-1基因編碼蛋白進行生物信息學分析預測及組織表達特性分析，為后續研究Gal-1基因在先天免疫系統中的作用提供數據支撐，并為Gal-1編碼蛋白功能的深入研究奠定基礎。