源于中高溫大曲的米根霉制備米曲工藝優化及應用

黃科屹 鄧 杰，2 衛春會，2 黃治國，2 石選超，2 任志強，2

(1. 四川輕化工大學釀酒生物技術及應用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000；2. 中國輕工業釀酒生物技術及智能制造重點實驗室，四川 宜賓 644000)

濃香型白酒是近幾個世紀以來最受歡迎的酒精飲料之一，是采用中高溫大曲作為糖化發酵劑進行泥窖固態發酵、固態蒸餾、陳釀、勾調而成的[1-2]。糖化發酵是中高溫大曲發酵生產濃香型白酒的一道重要工序，即淀粉水解為葡萄糖。其關鍵為中高溫大曲中豐富多樣的微生物(如霉菌、細菌等)分泌的糖化酶、淀粉酶、液化酶等各類水解酶系的相互作用[3-4]。糖化酶是發酵過程中淀粉轉化為葡萄糖的重要酶系之一，通常分布在米曲霉、根霉、黑曲霉等霉菌微生物中[5-7]。張杰等[8]從中溫大曲中篩選出一株高產糖化酶的霉菌Mxzd-001并制備成霉菌麩曲，優化麩曲工藝后麩曲糖化酶活力為1 032 U/g；將該麩曲應用至濃香型白酒釀造生產中，平均可提高出酒率4.9%左右。宋克偉等[9]從清香型大曲中篩選出一株高產糖化酶的米根霉9#，并添加至牛欄山清香大曲白酒的釀造環境中，提高了優質酒的出酒率。大曲白酒相較于小曲白酒具有醇香濃郁、回味悠長的特點[10-11]，但也存在出酒率低、成本高的缺陷，這與大曲白酒體系中的糖化酶活力較小曲白酒體系低下具有一定的相關性。因此以添加高產糖化酶的微生物強化劑為試驗組，探究高產糖化酶的微生物強化劑對大曲白酒出酒率的影響，對大曲白酒的出酒率提升具有重要意義。

研究擬從中高溫大曲中分離出10株根霉并選出產糖化酶活力最高的一株，通過形態學鑒定方法以及分子生物學鑒定方法確定該根霉至種水平。將該根霉制作成米曲，從制曲原料、培養時間、加水量、干燥溫度4個條件優化根霉米曲的糖化酶活力，并將優化后的米曲作為微生物強化劑添加至中高溫大曲的釀造環境中，以期提高大曲白酒的出酒率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

中高溫大曲：取自川南某濃香型酒廠，4 ℃冰箱貯藏用于篩選根霉菌；

蛋白酶K、DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒：日本Takara公司；

可溶性淀粉培養基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基：廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器和設備

顯微鏡：DM3000型，德國Leica公司；

高速冷凍離心機：5430R型，德國Eppendorf公司；

PCR儀：C1000Touch型，美國Bio-Rad公司；

酒精度測試儀：Super Alcoma型，德國Julabo公司。

1.3 菌株的篩選及鑒定

1.3.1 霉菌的分離純化 稱取10 g大曲樣品，經研缽研磨后(無菌條件下)加90 mL蒸餾水，150 r/min振蕩30 min，取上清液，得到10-1的稀釋液，依次稀釋至10-2～10-6，使用PDA固體培養基進行平板涂布培養，挑取少量各霉菌孢子點接入PDA斜面培養基，低溫保存[12]。

1.3.2 形態學鑒定 將純化菌株點植入選擇培養基，30 ℃ 恒溫培養72 h后，滴入3 mL碘液并使碘液均勻鋪滿整個平板。檢測透明圈直徑D，菌落直徑d，計算D/d值，選擇D/d值最大的菌株作為出發菌株；將純化菌株點植入PDA固體培養基，28 ℃恒溫培養72 h，觀察菌落形態，挑取菌絲，染色后于顯微鏡下觀察菌株形態特征，對菌株進行形態學鑒定[13]。

1.3.3 分子生物學鑒定 采用真菌基因組DNA試劑盒提取M-1菌株的DNA，以ITS1:5′-TCCGTAG-GTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTTATT-GATATGC-3′為引物擴增ITS序列。PCR反應體系：引物ITS1、ITS4各1 μL；模板(基因組)0.5 μL；Taq PCR Master Mix 25 μL；超純水22.5 μL；PCR反應條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸45 s；循環30次；72 ℃總延伸10 min。用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收擴增出的糖化酶基因產物并送至上海生物工程公司測序，測序結果于NCBI數據庫比較分析，利用MEGA7.0軟件構建發育樹。

1.3.4 酒精度、糖化酶活力測定方法

(1) 霉菌米曲糖化酶活力：參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

(2) 酒精度：參照QB/T 4257—2011《釀酒大曲通用分析方法》。

1.4 米曲的制作及應用

1.4.1 米曲制作工藝

(1) 純種霉菌麩曲的制作：稱取50.0 g麩皮加入50 mL 去離子水，充分攪拌，121 ℃滅菌20 min，冷卻。向無菌麩皮接種5×106的孢子懸浮液(用無菌水將試管斜面上的霉菌孢子洗下，150 r/min振蕩10 min，25×16型血球計數板計數)，28 ℃培養5 d。控溫烘干，貯藏，制得霉菌的一級擴大培養產物——霉菌麩曲。

(2) 霉菌的二級擴大培養產物——純種霉菌米曲的制作：工藝流程見圖1[14]。以糖化酶活力為指標，考察m麩皮∶m米粉、培養時間、米曲含水量和干燥溫度對米曲糖化酶活力的影響。

圖1 純種霉菌米曲工藝流程圖

1.4.2 米曲在大曲白酒釀造中的應用 將米曲應用至中高溫大曲釀造中，以添加米曲為試驗組，等質量的米粉、麩皮的混合物為對照組(見表1)，探究米曲對固態釀造出酒率的影響[15]。

表1 釀造用曲配比表(100 g糧食計)

綜合考慮生產成本、出酒率來選定釀造用曲，隨后擴大釀造規模進行驗證實驗。如圖2所示，以100 kg粳高粱為原料，M-1米曲2 kg，大曲20 kg，放入發酵罐中發酵60 d，待發酵完成后取出糟醅蒸酒，測定出酒率。

圖2 固態發酵釀造工藝圖

1.5 數據處理

試驗數據用“平均值±標準差”表示，運用SPSS 16.0軟件對試驗結果進行多重比較和顯著性分析，每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 菌株篩選及鑒定

由表1可知，從中高溫大曲中共篩選出10株根霉，將D/d最高的菌株M-1作為米曲的出發菌株[16]。

表2 高產糖化酶菌株篩選結果

將菌株M-1接入PDA固體培養基中，發現菌落呈白色，孢子多為黑色，菌絲密集，呈網狀，生長迅速。鏡檢下觀察到菌落孢子梗不分枝，從假根處長出。由圖3可知菌株M-1的rDNA-ITS序列基因片段全長約850 bp，其序列與RhizopusoryzaestrainFSU 6160的同源性達99.75%，與米根霉菌株(Rhizopusoryzae)(序列號EU484234.1)相似度為100%。

綜合形態學鑒定和分子生物學結果，將M-1菌株鑒定為接合菌綱(Zygomycetes)、毛霉目(Mucorales)、毛霉科(Mucoraceae)、根霉屬(Rhizopus)、米根霉(Rhizopusoryzae)。Xiang等[16]將印度毛霉(MucorindicusXH025)與米根霉(RhizopusoryzaeXH028)應用至米酒釀造中，獲得的米酒相較于工業規模生產的米酒香氣更濃郁、口感更和諧[17]；米根霉能產生2-甲基-1-丁醇、3-甲基-1-丁醇等揮發性化合物，因此也常被用于米酒及黃酒釀造中[18-19]。米根霉M-1來源于中高溫大曲，具有制備成適于大曲白酒釀造的微生物強化劑的潛能。

圖3 菌株的篩選與鑒定

2.2 制曲條件優化

2.2.1 制作M-1米曲條件優化 糖化酶是參與淀粉轉化為葡萄糖的關鍵酶系之一[20]。添加麩皮可以提高原料的疏松度，有利于微生物的生長繁殖。但麩皮也會給酒體帶來雜味，影響酒質[21]。由圖4(a)可知，隨著麩皮的增加，該米曲的糖化酶活力呈先增后降的趨勢，當m麩皮∶m米粉為2∶8時，糖化酶活力最高為861 U/g。隨后糖化酶活力呈下降趨勢，是因為增加麩皮的同時，米粉的含量相應減少，供微生物利用的營養物質也相應縮減。故最終確定m麩皮∶m米粉為2∶8。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

由圖4(b)可知，隨著培養時間的延長，M-1米曲的糖化酶活力先迅速增加后緩慢下降。當培養時間為72 h時，微生物的代謝活動最為活躍，糖化酶活力也達到峰值，為863 U/g，顯著高于72 h前的(P<0.05)，72 h后糖化酶活力有所下降。考慮到培養時間過長容易滋生雜菌，確定培養時間為72 h。

水分是米曲培養階段微生物生長繁殖的基本營養物質之一。含水量低容易引起曲藥通氣性差、氧氣缺乏；含水量高容易延滯菌株的生長，生成孢子[22]。由圖4(c)可知，隨著米曲含水量的增加，糖化酶活力呈先上升后略微下降的趨勢。當米曲含水量為45%時，糖化酶活力達到峰值858 U/g。考慮到含水量過高不僅需要更長的時間來干燥米曲，而且染菌的風險也會增加。故確定米曲含水量為45%。

為使M-1米曲具有較長的保質期，培育完成的米曲需進行干燥處理。由圖4(d)可知，隨著干燥溫度的增加，米曲的糖化酶活力變化不明顯。考慮到米曲的干燥時間與干燥溫度呈負相關，從節約能源、時間的角度出發，確定干燥溫度為40 ℃。

2.2.2 成品米曲檢測 綜合制曲條件優化結果，最終確定M-1米曲的制作工藝條件為m麩皮∶m米粉為2∶8，培養時間72 h，米曲含水量45%，干燥溫度40 ℃。此條件下制作的米曲有利于米根霉M-1糖化酶活力的保持。

由表3可知，M-1成品米曲的酸度、淀粉、水分處于正常范圍，糖化酶活力達864.50 U/g。相較于1#米曲(1 150 U/g)和M1米曲(1 246.9 U/g)的還存在差距[23-24]。然而米根霉M-1是直接從中高溫大曲中篩選獲得的，相較于原中高溫大曲，M-1成品米曲的糖化酶活力提升顯著(P<0.05)，應用該米曲至大曲白酒釀造中能較好地發揮糖化性能。

表3 成品米曲的理化檢測結果?

2.3 M-1米曲的應用

2.3.1 對大曲白酒出酒率的影響 由圖5可知，隨著M-1米曲的增加，大曲白酒的出酒率呈先快速上升后趨于平穩的趨勢。釀造用曲配方為試驗號2時，出酒率達43.17%，顯著高于對照組(38.13%)。隨后大曲白酒的出酒率變化不明顯，說明添加該米曲能一定程度上提高大曲白酒的出酒率。從節約成本的角度考慮，選擇糧食質量的2%為該米曲的添加量。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3.2 驗證實驗 為驗證實驗結果，將原料由5 kg擴大至100 kg，按圖2的釀造工藝，以添加2 kg M-1米曲，20 kg 大曲為試驗組；2 kg麩皮米粉(m麩皮∶m米粉為2∶8)混合的糧谷粉，20 kg大曲為對照組進行驗證實驗。

由圖6可知，試驗組的出酒率(44.61%)顯著高于對照組(38.64%)(P<0.05)，提高了5.91%，與圖5的結果一致，證明了大曲白酒的出酒率與大曲體系的糖化酶活力呈正相關[25]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

從中高溫大曲中篩選出一株產糖化酶能力較強的根霉M-1，通過形態學及分子生物學方法鑒定其為米根霉。

將該菌株制作成米曲，其糖化酶活力為864.50 U/g。添加米曲至大曲白酒釀造中，餾出酒的出酒率提升明顯，說明出酒率與大曲體系的糖化酶活力呈正相關。米根霉M-1是從大曲中篩選獲得的，應用該菌株制作的米曲(微生物強化劑)于大曲白酒的釀造中能更好的兼容，產糖化酶能力受環境的影響較小。然而該米曲對出酒率的提升存在限制性，其糖化酶活力尚未達到1 000 U/g，從中高溫大曲中還能篩選出產糖化酶能力更強的微生物，應用該微生物的強化劑至大曲白酒釀造中，出酒率可能進一步提高。后續將從擴大試驗規模、酒體風味等方向解決問題，以進一步完善理論支撐數據。