基于液相色譜法高效測定廣東某地土壤中醛酮類化合物研究

鐘 聲，施穎娜

(1.深圳市深港聯檢測有限公司,廣東 深圳 518133;2.深圳市華爾信環保科技有限公司,廣東 深圳 518133)

1 引言

環境中存在的大部分醛酮類化合物均具有刺激性和毒性，會刺激人的眼睛、皮膚、鼻子和肺部，長此以往會給人體帶來難以挽回的傷害，而且具有一定的遺傳毒性[1,2]。例如甲醛已被確定為致癌和致畸性物質，能夠影響免疫力，還具有生殖毒性，需要引起人們的警惕。土壤中的醛酮類化合物一旦溶解到地下水中，進入生態系統循環，會嚴重危害人體健康。液相色譜法就是用液體作為流動相的色譜法，其分離原理主要是基于混合物中各組分對兩相親和力的差別[3～5]。

目前對于醛酮類化合物相關研究主要是集中于環境空氣中，對土壤方面的研究較少。對不易揮發的高沸點、熱穩定性較高、分子鏈長、極性不一致的高分子化合物可以普遍用于高效液相色譜法。滿足這種性質的分子大部分為石化產品、食品以及生物化工產品，大約占目前已知有機物的80%[6,7]。前期國內已經制定了液相色譜法測定土壤中醛酮類化合物的標準，已有學者對液液萃取溶劑的選擇和液液萃取的方式進行了對比[8～10]。

本文則以廣東某地的土壤為樣本，基于液液萃取和固相萃取兩種方式，利用液相色譜法來測定其中所含的醛酮類化合物含量。

2 實驗方案

2.1 所用試劑及儀器

高效液相色譜儀具備紫外監測功能，日本進口；恒溫振蕩器，常州澳華儀器生產；色譜柱(SHIMADZUVP-ODS)型，日本進口；超純水機，美國進口；高溫箱式養護儀器，泰斯特公司生產；HLB固相萃取儀器，美國進口；固相萃取裝置，美國進口；移液槍(Thermo 10 mL)；萬分之一天平；平行濃縮儀，北京萊伯泰科公司生產；反轉式振蕩器(長沙永樂康儀器公司生產)；C18固相萃取儀器，德國CNW公司生產。

15種醛、酮類化合物標準濃度溶液(濃度為1000 mg/L)；2,4-二硝基苯肼標準溶液(濃度為1000 mg/L)；乙腈(色譜純)，國藥集團生產；二氧化硅、檸檬酸鈉；緩沖溶液:使用檸檬酸和檸檬酸鈉按照一定比例混合后,加水溶解并稀釋,保證pH值約為3；醋酸-醋酸鈉提取劑：將一定量的醋酸鈉溶于水后與冰醋酸混合，然后加水稀釋。DNPH衍生劑:將3.00 gDNPH溶于乙腈中，保證其容量為1 L[11]。

2.2 實驗條件

在35 ℃的養護條件下維持34 min，使用60%乙腈+40%水進行持續的洗刷，保證流速穩定在1.0 mL/min，使用波長為360 nm的紫外線進行監測，使用樣品的容量為10.0 μL[12]。

2.3 實驗機理

醛酮類化合物中所含有的氧原子可以與水中的氫原子結合形成氫鍵，根據相似相溶原理，分子鏈較短的醛酮類物質能夠與水互溶。醋酸的醋酸鈉溶液能夠將土壤中所含的醛酮類化合物進行提取。在一定溫度和化學條件下，醛酮類化合物可發生衍生化反應，從而生成較為穩定的腙類化合物，經過萃取濃縮、色譜分離、紫外檢測等步驟后，再對其進行物質定量測試[13]。

2.4 實驗方法

將10.00 g的待測樣品置于容量為250 mL的提取容器中，向其中加入200 mL的提取機進行密封，置于振蕩器中振蕩18 h，然后對樣品進行過濾，收集提取到的樣品，取100 mL的樣品放于平底燒瓶中，向其中加入緩沖劑和衍生劑，使用超聲波清洗器進行衍生，保持40 ℃的溫度條件持續超聲30 min。向衍生得到的溶液中加入10 mL氯化鈉溶液，使用固相萃取柱進行完全萃取，用乙腈進行持續洗脫，最后定容至10 mL，依據上文條件進行結果測定。

2.5 實驗操作

按照標準實驗方法進行操作，對土壤的操作主要分為以下幾個階段：提取、衍生、萃取以及濃縮。為了保證實驗效果，在密閉環境中進行提取及衍生操作，萃取濃縮過程應當對整個過程中的氣密性、甲醛測試值進行全面監測，避免實驗結果的干擾[14]。

實驗過程中要確保液體以3～5 mL/min的速度通過固相萃取小柱，用20～30 min的時間確保100 mL衍生液全部通過小柱。在萃取時間為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min時對甲醛含量進行測試，以此得到甲醛含量與萃取時間的關系[15]。

將衍生液放在三角瓶中進行時長約為30 h的萃取濃縮。設置2組對照實驗，觀察萃取物理環境對于樣品的影響。第一組使用錫箔紙將三角瓶的瓶口進行包裹，以減少液體與空氣的接觸；第二組則不做額外處理，直接將瓶口暴露在環境中。實驗結果表明，敞口放置的樣品測試結果明顯高于使用錫箔紙包裹的樣品。

為了提高萃取效率，在萃取過程結束后繼續抽吸1 min。分別測試抽吸1 min、5 min、10 min和15 min情況的甲醛測試值的影響。實驗結果表明，甲醛含量分別18.8 μg/L、35．6 μg/L、67．8 μg/L和70．3 μg/L，表明隨著抽吸時間增加，甲醛測試含量增加，在時間超過5 min后，增加值明顯；超過10 min以后，增加較為緩慢。

3 實驗結果分析討論

3.1 液相色譜柱的選擇

本文選擇了ZORBAXSB-C18(4.6×250 nm,5 μm),ZORBAXEclipseXDB-C18(4.6×250 mm,4 μm),ZORBAXODS(4.6×250 mm,5 μm)3種不同的液相色譜柱對15種醛酮類-DNPH的分離效果，結果如圖1。

注：1～15分別代表：甲醛;乙醛;丙烯醛丙酮;丙醛;丁烯醛;丁醛;苯甲醛;異戊醛;正戊醛;鄰-甲基苯甲醛;間-甲基苯甲醛;對-甲基苯甲醛;正己醛;2,5-二甲基苯甲醛

根據上圖圖譜顯示可以看出使用SB-C18色譜柱，對大多數的目標化合物具有較好的分離效果，響應值和波形圖較為理想，但對間-甲基苯甲醛和對-甲基苯甲醛的區分效果不好。XDB-C18色譜柱同樣能夠較好地分離15種醛酮類化合物，雖然該色譜柱對-甲基苯甲醛和間-甲基苯甲醛的分離效果達不到理想的效果，但是可以基于積分參數對兩種化合物進行單獨計量，本文為方便計算將其視為一類進行計算。ODS色譜柱雖然也有同樣的效果,但是其峰值時間過于短暫，對土壤的基質的干擾性很強，最終的目標物確定較為復雜,最終在此次實驗中選擇ZORBAXEclipseXDB-C18色譜柱。

3.2 樣品提取方式的選擇

在空白土壤樣品中加入一定量的醛酮類混合標準溶液作為對照組，提取方式最終選擇3種進行：探頭式超聲、振蕩、超聲清洗器。其中振蕩和超聲清洗按照標準的實驗方案進行;首先將衍生劑提取劑進行混合，然后加入待測樣品中，保證邊提取邊發生衍生化反應，以便取得更好的探頭式超聲效果。得到如圖2所示的實驗結果。

圖2 3種提取方式下的醛酮類化合物的回收率

從圖2實驗結果進行分析，探頭式方式回收率與超聲清洗器得到結果相差不大，探頭式略高一些，振蕩提取的效率明顯高于其他兩種方式，所有醛酮類化合物的回收率基本上都達到要求，普遍都超過了70%，所以在本次實驗中最終選用振蕩提取的方式提取土壤中的醛酮類化合物。

3.3 萃取方式的對比

這里對液液萃取和固相萃取兩種方式的回收效果進行比較。首先制備相同數量相同條件下加入醛酮類化合物的空白土壤樣品,利用兩種萃取方式對固相進行萃取。液液萃取的操作步驟為：將1.5 g NaCl加入衍生后的提取液之中，然后使用二氯甲烷進行兩次萃取，使用量分別為15 mL和10 mL，利用無水硫酸鈉對萃取液進行脫水，進一步使用氮氣進行持續吸水進行濃縮，最后更換溶劑為乙腈，進行定容至10 mL，對其進行均勻攪拌，最終得到實驗結果如圖3。

圖3 2種萃取方式得到醛酮類化合物的萃取效果

從圖3可以看出，2種方式回收率相差不大，固相萃取方式回收率大多高于液液萃取，二者相差不大，僅有對于甲醛的萃取誤差超過10%，使用2種方式對土壤中醛酮類化合物進行測試均可以，本文采用固相萃取的方式進行測試。

3.4 萃取條件的優化

3.4.1 萃取次數

將2組完全一樣的加入目標物質的進行衍生后得到的提取液進行固相萃取操作。其中一組使用C18固相萃取柱萃取后，經過乙腈洗脫，收集洗脫液，并定容至10 mL;另一組采用同樣的步驟進行2遍洗脫后，然后定容至10 mL。對以上試驗結果進行分析，發現萃取次數對于土壤中醛酮類化合物的回收效果影響并不大，萃取1次完全可以實現相對較好的萃取效果。對于個別含量較高的樣品，可能需要進行多次萃取能夠實現較高的樣品回收效果。

3.4.2 洗脫溶劑

固相萃取的原理是依據根據對不同化合物的吸附性和選擇洗脫性，從而實現對目標物質富集、分離和凈化的效果，本文經過研究后最終選擇使用二氯甲烷和乙腈2種溶劑進行洗脫。

根據洗脫溶劑不同而得到分離效果進行分析，2種洗脫溶劑對于醛酮類化合物的分離結果相差不大，對于極性較弱的化合物，使用二氯甲烷能夠取得較好的結果，對物質結構進行分析，可知是由于二氯甲烷的極性小于乙腈，導致二氯甲烷的效果較好，而在使用中發現乙腈淋洗結果回收更為穩定，不需要額外的轉換溶劑，本試驗最終選擇乙腈作為淋洗溶劑。

3.5 標準曲線與檢出極限

使用乙腈分邊將0.00、5.00、8.00、20.0、50.0、100μL的醛酮類-DNPH標準溶液稀釋至1 mL,使用標準系列溶液濃度區間為:0.00～1.50 μg/mL。根據儀器要求進行樣品分析,橫坐標為標準溶液中醛酮類化合物的濃度，縱坐標則為其對應的圖形面積，繪制標準曲線，得到回歸表達式如表1。

對檢測得到樣品濃度的4倍樣品進行連續測定20次,根據標準偏差S計算方式得到檢出限。計算方法為MDL=t(n-1,0.99)×S,式中t(9,0.99)=2.821,結果見表1。

表1 醛、酮類標準曲線和檢出限

3.6 精確度與準確度測試

根據上述試驗方法對目標類化合物添加濃度為0.20 mg/kg、0.50 mg/kg、2.00 mg/kg的空白土壤樣品進行9次重復測定,根據試驗計算平均回收率和偏差實驗結果如表2所示。

表2 平均回收率和偏差試驗結果

根據表2可以看出，丙酮的平均回收率為47%，醛類化合物的平均回收率均超過60%，范圍為67%～83%,相對標準偏差均低于15%，范圍為9%～13%。分析丙酮回收率較低是根據相似相溶原理丙酮能夠溶于水。

4 結論

采集廣州某化工企業土壤樣品,按照上述分析所用試劑、流程、方法進行化合物含量測定，經過多次的測量、數據分析，得到該土壤樣品中含有的甲醛為1.53 mg/kg、乙醛為0.67 mg/kg，其他醛酮類化合物含量極低未在樣品中檢出。

本次研究經過了提取溶劑、衍生反應、C18萃取柱固相萃取、液相色譜法對土壤樣品中含有15類醛酮類化合物的含量進行測試。分析對比不同色譜柱、提取方式和萃取方法的測試效果對比，固相萃取條件進一步優化。此方法實驗效果優良，數據穩定，樣品回收率高，方便操作，誤差較小。可以在后期土壤污染程度的測試中推廣，作為一種經驗建議。