高效液相色譜法測定人血漿中萬古霉素濃度

陳金成 張 吟林麗梅 王培紅

福建醫科大學附屬第二醫院藥學部，福建泉州 362000

萬古霉素，一種糖肽類時間依賴性抗生素，其藥物代謝動力學/藥物效應動力學評價參數為藥時曲線下面積/最低抑菌濃度（area under curve/minimum inhibitory concentration，AUC/MIC），其治療窗較窄，且其藥理作用和不良反應在一定程度上與其血藥濃度相關，較低的濃度容易誘導細菌產生耐藥性，過高濃度又會引起耳、腎毒性，影響萬古霉素血藥濃度的因素有很多。神經外科術后患者合并使用甘露醇、利尿劑、氨基糖苷類抗生素等腎損害藥物的概率較高，尤其ICU患者，需要進行萬古霉素血藥濃度檢測的人群數量較多，而萬古霉素血藥濃度檢測能顯著降低耳腎毒性的發生率，因此，臨床上為保證藥物安全和有效對萬古霉素患者進行血藥濃度檢測就顯得十分必要。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀（LC-30AD，日本島津）；CTO-30A進樣器（LC-30AD，日本島津）；SPD-M20A紫外檢測器（LC-30AD，日本島津）；SHB-DIII循環水真空泵（上海申光儀器儀表有限公司）；KQ-500DV數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XH-B漩渦混合器（江蘇康健醫療用品有限公司）；800臺式低速離心機（上海醫療器械集團有限公司）；離心機（2-5k，德國Sigma公司）；超純水系統（Milli-Qacademic，美國Millipore公司）；分析電子天平（瑞士，梅特勒公司）。

1.2 試藥

萬古霉素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130360-201302）；內標去甲萬古霉素（中國藥品生物制品檢定所，批號：30338-200303）；空白血漿（福建醫科大學附屬第二醫院體檢中心，健康體檢者的混合血漿）；乙腈（HPLC級，批號：MS1922-001，美國TEDIA公司）；磷酸二氫鉀（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150407）；硫酸鋅（國藥集團化學試劑有限公司，批號：20150104）；以上試劑均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kinetex C100 mm×4.6 mm，2.6 μm；流動相：乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀（pH3.2）的梯度洗脫；流速：1.0 ml/min；柱溫：40℃；檢測波長：220 nm；進樣量：10 μl。采用梯度洗脫法，洗脫程序為時間0.01、3.00、9.25、9.50、13.5、13.75、18.00 min時，分別對應的B相百分比為3%、8%、8%、60%、60%、3%及停止。

2.2 溶液的配置

標準品萬古霉素溶液：精密稱取萬古霉素10 mg 于10 ml容量瓶中，定容后配置成1 mg/ml的萬古霉素溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存備用。

內標去甲萬古霉素溶液：精密稱取去甲萬古霉素10 mg于10 ml容量瓶中，定容后配置成1 mg/ml的內標去甲萬古霉素溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存備用。

10%硫酸鋅溶液：精密稱取硫酸鋅1 g加超純水溶解并于10 ml容量瓶中定容，配制成10%硫酸鋅溶液，經0.22 μm微孔濾膜過濾，置4℃冰箱貯存備用。

2.3 樣品前處理

將配置好的萬古霉素溶液用超純水分步稀釋，分別配置成20、50、100、200、500、1000 μg/ml的萬古霉素溶液。取空白血漿180 μl，依次加入上述濃度的萬古霉素溶液20 μl及內標（去甲萬古霉素溶液）20 μl，再加入10%硫酸鋅溶液50 μl，漩渦震蕩30 s，離心（轉速：10 900 r/min，半徑：10 cm）10 min，取上清液進樣。結果見圖1~4，計算萬古霉素濃度，萬古霉素峰保留時間8 min左右，并且與前后峰分離度良好，血漿中的內源性雜質對測定無干擾。

圖1 空白血漿色譜圖

圖2 去甲萬古霉素純樣色譜圖

圖3 萬古霉素純樣色譜圖

圖4 給藥患者血漿樣品+內標色譜圖

2.4 標準曲線的繪制

上述萬古霉素溶液加入空白血漿后，依次配制成2.22、5.56、11.11、22.22、55.56、111.11 μg/ml的標準血樣，進樣后以萬古霉素與去甲萬古霉素濃度之比為橫坐標X，以萬古霉素與內標峰面積之比為縱坐標Y，做線性回歸，即得直線方程Y=1.33X+0.0056，R= 0.9997（圖5）。

圖5 萬古霉素標準曲線圖

2.5 最低定量下限

取萬古霉素標準曲線中最低濃度2.22 μg/ml的溶液，用空白血漿進行稀釋，按“2.3”項下方法處理血漿，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，在定量下限濃度為2.22 μg/ml濃度下，信噪比（signal-to-noise ratio，S/N）=13.7，符合靈敏度要求。

2.6 精密度與準確度考察

取線性范圍內低、中、高三個濃度（5.56、27.78、55.56 μg/ml）的萬古霉素血清標準液。按“2.3”項下方法處理血漿，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，1天之內平行測定5次，計算日內精密度，包括回收率和相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。取相同樣品連續測5 d，期間于4℃冰箱保存，計算日間精密度。結果見表1，符合方法學要求。

表1 萬古霉素日內、日間精密度與準確度（n=5，%）

2.7 穩定性試驗

制備低、中、高3種濃度（5.56、27.78、55.56 μg/ml）萬古霉素血漿樣品各5份，按“2.3”項下方法處理血漿，按“2.1”項色譜條件進樣檢測，分別在室溫放置4 h、室溫放置24 h、反復凍融1次、反復凍融2次的條件下考察其穩定性，結果見表2，在上述條件下萬古霉素穩定性良好。

表2 萬古霉素穩定性實驗（n=5）

2.8 臨床應用

患者男，42歲，因腦干出血入福建醫科大學附屬第二醫院ICU，后一般細菌涂片檢查出革蘭陽性球菌與革蘭陰性桿菌，以萬古霉素以1.0 g，q12 h靜脈滴注進行抗感染治療，穩態后抽血進行血藥濃度檢測，測得結果為20.48 μg/ml，結果雖略微超過重癥感染時的萬古霉素血藥濃度范圍（15~20 μg/ml），但患者未見腎功能異常，繼續此常規治療方案，患者感染得到有效控制。

患者女，81歲，因急性消化道出血，十二指腸球部潰瘍穿孔并膿毒性休克入福建醫科大學附屬第二醫院ICU，后腹水培養結果顯示革蘭陽性球菌生長，以萬古霉素0.5 g，q6 h靜脈滴注來抗感染治療，5 d后抽穩態濃度血予以臨床藥學室進行血藥濃度檢測，測得結果為22.14 μg/ml，結合患者檢測肌酐清除率較前有所升高，調整萬古霉素劑量為0.5 g，q12 h，并注意腎功能監測，結果表明經劑量調整后患者肌酐清除率有所下降。

3 討論

采用直接沉淀法來處理血樣，與固相萃取法相比，此法操作簡單省時省力，更加適合于醫院用于檢測患者血藥濃度的模式。在蛋白沉淀劑的選擇中，就回收率方面來看，乙腈回收率幾乎為0，甲醇、高氯酸的回收率在60%左右，而硫酸鋅的回收率超過90%；而就沉淀效果來看，10%硫酸鋅的凈化效果明顯好于20%硫酸鋅及30%硫酸鋅，故選用直接沉淀法并以10%硫酸鋅做蛋白沉淀劑。在有機相的選擇中，選用乙腈時的色譜峰要明顯好于選用甲醇時，另外，還有文獻報道，應用磷酸二氫鉀緩沖體系時，其緩沖鹽濃度過大會造成鹽析，導致柱壓升高，影響分離效果，并且，在pH值為3.2時，峰形較為對稱，且保留時間較合適，故選用乙腈-磷酸二氫鉀（pH=3.2）來作為流動相。

自1958年開始，萬古霉素在臨床上被用于治療革蘭陽性菌引起的感染，其主要通過抑制細胞壁的合成，改變細胞膜的通透性并影響RNA合成來起到抗菌作用。在應對β-內酰胺類藥物抵抗的感染時，萬古霉素能起到很好的效果，因而在臨床上是抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的一線用藥。本實驗建立了高效液相色譜法來測定人血漿中萬古霉素濃度，并成功應用于臨床。解決了由萬古霉素治療窗窄引發的一系列問題，實現了萬古霉素的個體化給藥。另外，基于準確數據來進行用藥指導也更能促進臨床用藥的安全、經濟、合理。當然，本研究還存在著很多大的不足跟欠缺，如樣本量少，后續應進行大量的臨床宣講提升樣本量，更重要的是今后的研究重點應根據藥代動力學原理制定劑量調整方案，更好地幫助臨床實施個體化給藥。