響應面法優化海金沙多糖提取工藝及其抗氧化活性

陳小燕，梁艷梅，陳旭波

（麗水學院生態學院，浙江 麗水 323000）

海金沙（Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.）隸屬于海金沙科海金沙屬，別名鐵線藤、左轉藤。據《中國畬藥植物圖鑒·上卷》記載，該種植物在南方地區分布廣泛，主要用于治療尿路結石、肝腸炎、濕疹等，為地方標準收錄的畬藥。目前，海金沙主要應用于中藥處方中，對其單味藥效成分的研究也主要集中在黃酮、酚酸類和甾體苷類等化學成分方面[1-5]。據報道，海金沙主要成分具有抗菌消炎[6]、提高機體免疫力、抗腫瘤、降血糖[7]、抗氧化[8]、消除自由基[9]及其他的臨床治療功效[10]。然而，目前對海金沙有效成分之一的多糖的研究卻相對較少[11]。

植物多糖提取的常見方法有熱水浸提法[12]、復合酶解法[13]、微波法[14]和超聲波法[15]等。微波提取技術與傳統的提取方法相比較，具有低成本、高效率等優點，更加適合快速提取植物多糖[16]。孫萍等[17]運用微波技術提取甘草多糖發現：通過微波處理提取不僅能夠有效減短試驗周期，實驗中溶劑的消耗量也得到減少，而且多糖的提取率也由傳統方法的9.82%提高到13.90%，較傳統方法提高了41.5%。實驗表明，利用微波技術更有利于提取多糖。響應面分析法是目前采用較多的優化方法之一，不僅能夠分析單個因素對提取的影響，還能分析各因素之間的交互作用。它將體系的響應值作為一個或多個因素的函數，運用圖形技術顯現各擬合因素和響應值之間的關系，并且通過計算可推斷出一個較為合理的預測值。

因此，筆者將以海金沙為實驗材料，采取微波傳統提取法和微波輻射預處理法提取海金沙多糖，利用濃硫酸-苯酚法，計算多糖的提取率。以多糖提取率作為考察指標，在單因素實驗的基礎上通過響應面優化提取工藝。參考姚秋萍等[18]的研究測定海金沙多糖粗提物對超氧陰離子自由基的清除率，以評價海金沙多糖的抗氧化能力，為后續研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 海金沙的采集

海金沙干粉：海金沙植株于2020年采自麗水學院校園，陰干，打粉，過40目篩，備用。

1.2 儀器與試劑

電子天平（北京塞多利斯天平有限公司，ISO9001）；電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實業有限公司醫療設備廠，HHS）；臺式高速離心機（SIGMA Laborzentrifugen GmbH，3K15）；G8023DH L-V8型微波爐（佛山市順德區格蘭仕微波爐電器有限公司）等。

95%乙醇、葡萄糖溶液、5%苯酚、濃硫酸、10 mmol/L鄰苯三酚、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（Tris-HCl）等。

1.3 數據統計方式

采用Design-Expert 11.0軟件進行多元回歸擬合；利用Spss 16.0進行方差分析；利用Excel 2010作圖。

1.4 海金沙多糖提取條件的優化

微波傳統提取見前人的研究[16]，傳統提取因素包含了微波時間、微波功率、液料比。在80℃熱水浴中提取60 min，抽濾除渣，獲得海金沙多糖提取液。利用旋轉蒸發儀將提取液濃縮到一定體積，然后加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜。次日在4 000 r/min條件下離心5 min，收集沉淀物并重復醇沉一次，即得水提粗多糖。測定多糖提取率，以確定最佳提取工藝。

微波輻射預處理參考王趙改等[19]的方法，通過控制微波時間、微波功率、液料比和汽化劑用量等因素對樣品進行輻射預處理。在80℃熱水浴中提取60 min，抽濾除渣得海金沙多糖提取液。利用旋轉蒸發儀將提取液濃縮至一定體積，然后加入4倍體積的95%乙醇，靜置過夜。次日在4 000 r/min條件下進行離心5 min，收集沉淀物并重復醇沉一次，即得水提粗多糖。測定多糖提取率，以確定最佳提取工藝。

1.5 海金沙多糖提取率的測定

采用濃硫酸-苯酚法[20]對海金沙多糖提取率進行測定。葡萄糖標準曲線的繪制：分別依次精確吸取100 μg/mL的葡萄糖標準溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于試管中，加入適量蒸餾水定容到1 mL。加入5%的苯酚溶液1 mL，搖勻，在冰浴條件下沿試管壁緩慢加入5 mL濃硫酸，充分搖勻后沸水浴15 min，取出后迅速冷卻至室溫，以蒸餾水為空白對照組，在490 nm波長下測其吸光值。以葡萄糖濃度作為橫坐標，吸光值作為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程。

海金沙多糖提取率的測定：將提取的海金沙多糖定容到一定體積，精確吸取1 mL溶液于試管中，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL濃硫酸，搖勻，沸水浴15 min。取出后迅速冷卻至室溫，于490 nm處測其吸光值，根據葡萄糖標準曲線計算多糖提取率（%），計算公式如下：式中：C為測得的多糖溶液濃度，μg/mL；V為多糖溶液定容體積，mL；N為樣品稀釋倍數；M為樣品質量，mg。

1.6 海金沙多糖提取的單因素實驗與響應面實驗設計

1.6.1 微波傳統提取法

以海金沙干粉為實驗材料，以多糖提取率作為考察指標。在單因素實驗的基礎上進行響應面實驗設計。以測得的多糖提取率當作響應值，進行設計，詳見表1。

表1 單因素實驗設計和響應面水平編碼

1.6.2 微波輻射預處理法

以海金沙干粉為實驗材料，以多糖提取率作為考察目標。在單因素實驗的基礎上進行響應面實驗水平設計，以測得的多糖提取率為響應值，進行四因素三水平設計，單因素實驗及響應面實驗設計如表2所示。

表2 單因素實驗設計及響應面水平編碼

1.7 海金沙多糖抗氧化活性測定

取不同濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）的海金沙多糖溶液0.2 mL，加入50 mmol/L的Tris-Hcl緩沖液（pH=8.2）5.7 mL，在25℃熱水浴條件下保溫10 min，然后加入于25℃預熱的鄰苯三酚溶液（6 mmol/L）0.1 mL。迅速搖勻，以多糖溶液為空白組在320 nm處測定反應1 min時的吸光值（A2），每組分別設置3份平行。以等量的蒸餾水代替海金沙多糖溶液，將Tris-Hcl緩沖液調零，在相同波長下獲得1 min時的吸光值（A1），每組分別設置3份平行。

對照試驗選用不同濃度Vc（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）代替多糖溶液，其余操作步驟、試劑及條件不變，測定吸光度，每組設3份平行。自由基清除率計算公式如下：

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

以100 μg/mL葡萄糖標準溶液作為對照品，繪制葡萄糖標準曲線。葡萄糖標準曲線方程為y=0.007 8x-0.023 5，R2=0.996 1，如圖1所示具有較好的相關性。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 海金沙多糖提取的單因素實驗

2.2.1 微波傳統提取法

由圖2可知，海金沙多糖提取的最適微波功率為280 W，最大值為4.784%；功率在350～420 W范圍內時，較強的微波功率可能導致海金沙多糖的有效成分被分解或被破壞，導致最終多糖提取率反而隨著微波功率的逐漸增大而減小。由圖3可知：在微波時間為0～120 s內，提取率出現先上升后下降現象，提取率在60 s時為7.619%。由圖4可知：液料比的大小對提取率有著明顯的影響，20（mL/g）時提取率最大，為8.894%，在到達峰值后隨著液料比的增大多糖提取率并無明顯的變化，而是趨于平緩。

圖2 多糖提取率對微波功率的響應

圖3 多糖提取率對微波時間的響應

圖4 多糖提取率對液料比的響應

2.2.2 微波輻射預處理提取法

由圖5可知：在280 W時多糖提取率達到最大，此時提取率為4.601%。由圖6可知：當液料比為20（mL/g）時，多糖提取率達到最高值，為8.24%。由圖7可知：當使用微波處理60 s時，海金沙多糖的提取率最高，為10.14%。由圖8可知：汽化劑在0～7.5 mL之間，海金沙多糖提取率隨著用量的增加而逐漸上升，7.5 mL時多糖的提取率最大，為15.642%。

圖5 多糖提取率對微波功率的響應

圖6 多糖提取率對液料比的響應

圖7 多糖提取率對微波時間的響應

圖8 多糖提取率對汽化劑用量的響應

2.3 響應曲面結果與分析

2.3.1 微波傳統提取法的多糖提取率二次響應面回歸模型的建立與分析

對表3中17組數據進行多元回歸擬合分析得到如下方程：

對表3中17組數據進行回歸模型方差分析得到表4。由表4可知：回歸模型差異極其顯著（P＜0.000 1），失擬項差異不顯著（P=0.087 6＞0.05），這說明該回歸方程具有良好的擬合性，試驗誤差值較小說明模型的精確度和準確度很高，重現性很好。一次項C，二次項A2、B2、C2對海金沙多糖提取率均達到極顯著水平（P＜0.01）。由F值可知各因素影響從大到小的順序為：液料比＞微波功率＞微波時間。因素之間的相互作用見圖9～11。

圖9 功率與時間的3D響應面圖

表3 響應面實驗設計與結果

表4 回歸模型方差分析

圖10 液料比與功率的3D響應面圖

圖11 液料比與時間的3D響應面圖

2.3.2 微波傳統提取法的海金沙多糖提取工藝的確定與驗證

根據回歸模型及軟件分析得出微波傳統提取海金沙多糖的最優工藝參數為微波功率279.658 6W、微波時間57.007 3 s、液料比23.861（mL/g）?？紤]可行性及實驗操作的便利性，將最佳工藝參數修正為微波功率280 W、微波時間57 s、液料比24（mL/g），該條件下多糖提取率的預測值為7.756%。通過驗證試驗表明：多糖的提取率為7.582±0.156%，實際值與預測值沒有顯著性差異。

2.3.3 微波輻射預處理提取的海金沙多糖提取率二次響應面回歸模型的建立與分析

對表5中29組數據進行多元回歸擬合分析得到如下方程：

表5 響應面實驗設計與結果

對29組數據進行回歸模型方差分析得到表6。由表6可知：回歸模型差異極其顯著（P＜0.000 1），失擬項差異不顯著（P=0.159 0＞0.05），這說明該回歸方程對試驗具有良好的擬合性，試驗誤差較小為4.46%，說明模型精確度和可信度較高。一次項A和C，二次項AB、AC、BC、BD對海金沙多糖提取率均達到極顯著水平（P＜0.01）。由F值可知各因素影響從大到小的順序為液料比＞微波功率＞微波時間＞汽化劑用量。因素間的相互作用見圖12～17。

圖12 功率與時間的3D響應面圖

表6 回歸模型方差分析

圖14 汽化劑用量與功率的3D響應面圖

圖16 液料比與時間的3D響應面圖

2.3.4 微波輻射預處理提取工藝的確定與驗證

根據回歸模型及軟件分析得出微波輔助預處理海金沙多糖的最優工藝條件為微波功率338.54 W、微波時間71.25 s、液料比28.00（mL/g）、汽化劑用量4.967 mL。考慮實驗的可行性及操作的便利性，將最佳工藝參數修正為微波功率350 W、微波時間71 s、液料比28（mL/g）、汽化劑用量5 mL。該條件下多糖提取率的預測值為13.881%。驗證實驗表明：多糖的提取率為13.507±0.177%，實際值與預測值沒有顯著性差異。

圖13 液料比與功率的3D響應面圖

圖15 汽化劑用量與時間的3D響應面圖

圖17 液料比與汽化劑用量的3D響應面圖

2.4 海金沙粗多糖的抗氧化活性測定

研究表明：通過測定O2-的清除率能反映出物質抗氧化性強弱[21]。本實驗以Vc和兩種提取方法提取的海金沙粗多糖為對象，測定不同樣品對O2-的清除作用。實驗表明：多糖的質量濃度越高其相應抗氧化能力也就越強。如圖18，樣品質量濃度在0.2～0.6 mg/mL范圍內，O2-清除率的上升幅度較大；當質量濃度大于0.6 mg/mL時，O2-清除率上升趨勢逐漸平緩。從總體上來看，在相同質量濃度條件下，Vc清除O2-的能力明顯高于海金沙多糖，但兩種方法提取的海金沙多糖在1 mg/mL條件下對O2-清除率均可以達到60%以上。

圖18 抗氧化活性

3 討論與結論

植物多糖提取方法一直是研究的熱點。不同來源的植物多糖具有不同的特征與性質，因此在對植物多糖進行研究時，應針對植物材料的特征和性質，選用適宜的提取方法[22]，在盡可能提高多糖提取率的基礎上，保證多糖活性。

微波輻射預處理法是先使用一定量的汽化劑先對干物料進行適當時間的浸潤，然后再用高頻電磁波波能對細胞結構進行破壞，最后用熱水提取法進行多糖萃取的一種預處理方法，有別于傳統微波提取。實驗結果表明：當微波功率及處理時間超過一定限度時，多糖提取率不會繼續增加，反而會下降。這可能是因為微波的過度處理，使有效成分遭到破壞。蔡錦源等[23]利用微波輔助預處理法提取香菇多糖并與熱水浸提法相對比，表明兩種工藝提取多糖的提取率不同，抗氧化活性也不同，微波輔助預處理法提取香菇多糖不僅提取率更高，抗氧化活性也更強。筆者采用的兩種微波處理方式表明，其多糖抗氧化活性并沒有顯著性差異。

結果表明：微波輻射預處理提取的多糖的提取率（13.509%）顯著高于微波傳統提?。?.756%）。對其粗提物進行初步純化后測其抗氧化活性發現，兩者抗氧化活性雖均低于Vc，但在1 mg/mL濃度時對O2-清除率均可以達到60%以上，證實海金沙多糖具有較好的抗氧化性。本研究得到的多糖提取率略高于肖懷秋和李玉珍的研究（提取率為12.85%）[24]，而提取時間僅為其一半，可見微波輻射預處理的優勢。另外本研究的提取率低于武蕓等人的研究（提取率為16.475%）[25]，這與提取次數及提取時間的不同有關。

可見，微波輻射預處理在提取海金沙多糖方面較微波傳統提取具有一定的優勢，提取率高且抗氧化活性不會改變。該方法是否適用于其他植物材料有待于進一步驗證。