彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者組織中CXCL9、CXCR3表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系*

冉岑霞 劉思恒 李佳 彭賢貴 張洪洋

(陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院·新橋醫(yī)院 1.血液科；2.血液病醫(yī)學(xué)中心，重慶 400037)

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(Diffuse large B-cell lymphoma，DLBCL)是原發(fā)于淋巴結(jié)或淋巴組織的惡性腫瘤，占中國非霍奇金淋巴瘤的50%，且30%DLBCL是難治性或者在治療后易復(fù)發(fā)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子可通過與靶細(xì)胞膜上的趨化因子受體特異性結(jié)合使靶細(xì)胞產(chǎn)生定向遷移作用，對(duì)靶向抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲可能有積極意義[3-4]。趨化因子CXCL9是ELR-陰性CXC趨化因子亞家族成員之一，可被干擾素-γ(IFN-γ)誘導(dǎo)產(chǎn)生，CXCL9與其受體CXCR3結(jié)合，可聚集CXCR3+細(xì)胞，如效應(yīng)T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)等[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)，CXCL9、CXCR3在急性皮炎患者的皮損中表達(dá)上調(diào)[7]；利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)急性皮炎纖維化依賴于CXCL9和CXCR3，二者可能參與急性皮炎的發(fā)病機(jī)制[8]。最近一項(xiàng)研究報(bào)道稱，腫瘤相關(guān)樹突細(xì)胞(TADCs)可產(chǎn)生高水平的CXCL9并降低其抗原性以誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖[9]。CXCL9、CXCR3在DLBCL中的作用較少見報(bào)道，因此本研究通過檢測DLBCL腫瘤組織中CXCL9、CXCR3表達(dá)水平與患者病理特征的關(guān)系，初步討論其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月～2016年1月在我院采用R-CHOP化療方案治療的92例DLBCL患者，均通過淋巴結(jié)活檢獲取DLBCL腫瘤組織標(biāo)本，及50例病灶旁正常淋巴組織標(biāo)本。標(biāo)本均用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，4℃保存。92例患者中男性51例，女性41例，年齡24～83歲，平均(55.69±7.12)歲；原發(fā)部位：腹股溝淋巴結(jié)39例，胃腸道27例，頸部17例，其他9例；Ann Arbor分期：Ⅰ期14例，Ⅱ期19例，Ⅲ期35例，Ⅳ期24例；組織學(xué)分型：生發(fā)中心型52例，非生發(fā)中心型40例。所有患者均為首次治療，無合并其他腫瘤，無嚴(yán)重心、肝、腎等功能異常者；臨床資料完整。Ki67陽性率≤70% 45例，>70% 47例；乳酸脫氫酶水平正常27例，升高65例；國際預(yù)后指數(shù)(IPI)評(píng)分0～2分56例，3～4分36例。患者及家屬均已簽訂知情同意書，本研究獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：1412-1601)。

1.2 方法

1.2.1 數(shù)據(jù)庫分析 GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)是由北京大學(xué)團(tuán)隊(duì)開發(fā)的數(shù)據(jù)庫，是一個(gè)癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)分析和可視化的網(wǎng)站。基于該數(shù)據(jù)庫，統(tǒng)計(jì)分析CXCL9、CXCR3 mRNA在淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)組織及正常淋巴組織中的差異性表達(dá)。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色法檢測CXCL9、CXCR3蛋白水平 將保存的石蠟組織標(biāo)本連續(xù)4 μm切片，脫蠟后進(jìn)行梯度乙醇脫水，使用枸櫞酸鈉溶液進(jìn)行抗原修復(fù)。一抗采用羊抗多克隆抗體試劑盒(美國Sigma公司)，室溫孵育30 min后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，加入二抗孵育。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)溶液染色，蘇木素復(fù)染，風(fēng)化、脫水、透明、封片。利用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。染色結(jié)果由兩位病理科專業(yè)醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行讀片，采用半定量評(píng)分系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)果評(píng)定。隨機(jī)取5個(gè)高倍鏡視野，用2種評(píng)分體系評(píng)分后取平均值：①按染色強(qiáng)度評(píng)分：無染色為0分，淺黃色為1分，淡黃色或黃棕色2分。②按陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：無陽性細(xì)胞記0分，≤25%記1分，26%～50%記2分，>50%記3分。將兩種評(píng)分方法所得評(píng)分相乘，乘積≥2分定義為表達(dá)陽性(+)，<2分定義為表達(dá)陰性(-)；同時(shí)定義得分乘積≥3分為高表達(dá)，<3分為低表達(dá)。

1.3 隨訪與觀察 DLBCL患者開始化療時(shí)即納入觀察，采用門診復(fù)查或電話、短信等方式隨訪5年，最終隨訪時(shí)間為2021年1月1日，并獲得全部患者隨訪記錄。其中復(fù)發(fā)患者54例，未復(fù)發(fā)患者38例，分析腫瘤組織CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)與患者復(fù)發(fā)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n或(%)表示，采用2檢驗(yàn)分析CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系；采用Kaplan-Meier法分析CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)水平與DLBCL復(fù)發(fā)的關(guān)系；采用COX回歸分析影響DLBCL患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CXCL9、CXCR3基因在DL-BC腫瘤組織和正常淋巴組織中的表達(dá)情況 分析TCGA數(shù)據(jù)庫中47例DL-BC腫瘤組織和337例正常淋巴組織中CXCL9、CXCR3基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示CXCL9、CXCR3基因在DLBCL腫瘤組織中表達(dá)水平與正常淋巴組織比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 TCGA數(shù)據(jù)庫中CXCL9、CXCR3基因在DLBCL腫瘤組織和正常淋巴組織中的表達(dá)

2.2 CXCL9、CXCR3免疫組化結(jié)果及在DLBCL腫瘤組織中的陽性表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，CXCL9、CXCR3主要定位于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞膜(見圖2)。CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于其在正常淋巴組織組織中的陽性表達(dá)率(P<0.05)，見表1。

表1 CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織和正常淋巴組織中的表達(dá)情況比較[n(×10-2)]

圖2 CXCL9、CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織和正常淋巴組織中的染色結(jié)果(SP, 200×)

2.3 DLBCL腫瘤組織中CXCL9、CXCR3蛋白的表達(dá)關(guān)系 本研究結(jié)果顯示，CXCL9蛋白與CXCR3蛋白共表達(dá)陽性DLBCL患者46例，共表達(dá)陰性DLBCL患者21例，僅CXCL9蛋白陽性表達(dá)的DLBCL患者14例，僅CXCR3蛋白陽性表達(dá)的DLBCL患者11例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2=15.836，P<0.001)，見表2。

表2 DLBCL腫瘤組織中CXCL9、CXCR3蛋白的表達(dá)關(guān)系

2.4 CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)水平與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系 CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)水平與DLBCL患者年齡、性別、原發(fā)部位、乳酸脫氫酶水平、IPI評(píng)分無關(guān)(P>0.05)，與Ann Arbor分期、組織學(xué)分型、Ki67陽性率有關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)水平與DLBCL患者臨床病理特征的關(guān)系

2.5 CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)水平與DLBCL復(fù)發(fā)的關(guān)系 DLBCL患者腫瘤組織CXCL9高表達(dá)組5年累積復(fù)發(fā)率明顯高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(68.52%vs36.84%,2=9.788，P<0.001)；CXCR3高表達(dá)組5年累積復(fù)發(fā)率，明顯高于低表達(dá)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(73.68%vs28.57%,2=17.610，P<0.001)，見圖3。

圖3 CXCL9、CXCR3蛋白表達(dá)水平與DLBCL復(fù)發(fā)的關(guān)系

2.6 影響DLBCL患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素分析 單因素分析結(jié)果顯示，CXCL9、CXCR3、Ann Arbor分期、組織學(xué)分型、Ki67陽性率是影響DLBCL患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素(P<0.05)；多因素分析結(jié)果顯示，CXCL9高表達(dá)、CXCR3高表達(dá)、Ann Arbor分期Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型是影響DLBCL患者復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響DLBCL患者復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素分析

3 討論

DLBCL是一種常見的侵襲性淋巴瘤，由于淋巴系統(tǒng)的分布特點(diǎn)，使得淋巴瘤成為一種全身性疾病，幾乎可侵犯到全身的任何組織和器官[10-11]。DLBCL的發(fā)病機(jī)制和原因尚不明確，患者確診時(shí)大多已處于晚期，治療效果及藥物耐受性均較差，嚴(yán)重威脅患者生命健康。近年來，生物標(biāo)志物在腫瘤早期診斷及復(fù)發(fā)中的作用研究成為熱點(diǎn)。

趨化因子是一類誘導(dǎo)趨化、促進(jìn)免疫細(xì)胞分化、引起組織外滲的蛋白質(zhì)，其在腫瘤環(huán)境中的抗腫瘤免疫反應(yīng)作用越來越引起人們關(guān)注[12]。CXCL9是一種被IFN-γ誘導(dǎo)產(chǎn)生的單核因子，可在炎癥條件下由腫瘤微環(huán)境中的髓細(xì)胞產(chǎn)生；另外CXCL9介導(dǎo)淋巴細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞，包括活化的T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞，并已被證明在免疫檢查點(diǎn)療法中發(fā)揮作用[13]。Razis等[14]研究發(fā)現(xiàn)，趨化因子CXCL9與乳腺癌亞型和不良預(yù)后相關(guān)，可作為乳腺癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。DLBCL的發(fā)生、發(fā)展受多種因素、多條信號(hào)通路調(diào)節(jié)[15]，CXCL9在DLBCL中的作用方式和機(jī)制尚未闡明。Cheng等[16]報(bào)道稱，CXCL9在DLBCL組織和細(xì)胞系中均呈高表達(dá)，并與患者臨床進(jìn)展和較短總生存期密切相關(guān)，且其以β-catenin蛋白依賴的方式促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，這為CXCL9作為DLBCL腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)提供依據(jù)。本研究首先利用TCGA數(shù)據(jù)庫查詢可知，CXCL9基因在淋巴樣腫瘤彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤(DLBCL)中表達(dá)水平高于正常組織，利用免疫組化染色結(jié)果顯示，CXCL9蛋白在DLBCL腫瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常淋巴組織，免疫印跡法進(jìn)一步證實(shí)CXCL9蛋白表達(dá)水平在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，表明CXCL9在DLBCL中發(fā)揮癌基因作用，可能參與DLBCL腫瘤的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，CXCL9蛋白水平與DLBCL患者Ann Arbor分期、組織學(xué)分型、Ki67陽性率有關(guān)，與患者年齡、性別、原發(fā)部位、乳酸脫氫酶水平、IPI評(píng)分無關(guān)，Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型、Ki67陽性率>70%的DLBCL患者腫瘤組織CXCL9高表達(dá)占比更高。國內(nèi)學(xué)者龔予希等[17]研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者分期Ⅲ～Ⅳ期、IPI評(píng)分3～5分是DLBCL患者發(fā)生復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)因素，與本研究結(jié)果稍有差異，推測可能與地域因素、檢測方法、納入病例數(shù)等有關(guān)。后續(xù)應(yīng)擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步開展多中心、前瞻性研究以對(duì)本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

研究發(fā)現(xiàn)，CXCL9、CXCL10、CXCL11/CXCR3軸可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞遷移、分化和激活，導(dǎo)致腫瘤抑制(旁分泌軸)，然而也有研究報(bào)道該軸參與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移(自分泌軸)[18-20]。CXCL9可以直接作用于表達(dá)CXCR3受體的腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[21-22]。Bai等[23]的最新一項(xiàng)研究利用基因表達(dá)譜交互分析評(píng)估DLBCL和橋本甲狀腺炎的重疊差異表達(dá)基因(DEGs)，結(jié)果顯示鑒定出的15個(gè)基因中CXCR3在DLBCL中表達(dá)高于正常組織，與本研究結(jié)果一致。本研究利用TCGA數(shù)據(jù)庫可知，CXCR3基因在DLBCL腫瘤組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，其免疫組化結(jié)果顯示CXCR3蛋白陽性表達(dá)率在DLBCL患者腫瘤組織中表達(dá)升高，主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜，其表達(dá)水平與患者Ann Arbor分期有關(guān)，表明CXCR3表達(dá)上調(diào)參與DLBCL發(fā)展進(jìn)程，發(fā)揮癌基因作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，致表皮B細(xì)胞淋巴瘤的CD20陽性腫瘤細(xì)胞表達(dá)CXCR3，與其特異性配體結(jié)合可能導(dǎo)致患者病情進(jìn)展緩慢，提示CXCR3在不同類型B細(xì)胞淋巴瘤中可能與其配體結(jié)合發(fā)揮不同的生理作用[24]。本研究結(jié)果顯示，CXCR3蛋白在DLBCL腫瘤組織中表達(dá)水平明顯高于正常淋巴組織，其表達(dá)水平與腫瘤Ann Arbor分期、組織學(xué)分型、Ki67陽性率有關(guān)，Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型、Ki67陽性率>70%的患者腫瘤組織中CXCR3高表達(dá)人數(shù)占比更大，表明高水平的CXCR3與腫瘤細(xì)胞遷移、浸潤及增殖活性有關(guān)。進(jìn)一步分析患者預(yù)后發(fā)現(xiàn)，高水平CXCL9、高水平CXCR3的DLBCL患者復(fù)發(fā)率明顯升高；COX回歸分析結(jié)果顯示CXCL9高表達(dá)、CXCR3高表達(dá)、Ann Arbor Ⅲ～Ⅳ期、非生發(fā)中心型時(shí)，DLBCL患者5年復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)增加，表明CXCL9、CXCR3可能成為DLBCL患者5年復(fù)發(fā)的潛在指標(biāo)。

4 結(jié)論與啟示

趨化因子CXCL9及其受體CXCR3在DLBCL患者腫瘤組織中高表達(dá)，且二者表達(dá)存在一定相關(guān)性，表明CXCL9、CXCR3可能共同作用參與DLBCL發(fā)生發(fā)展過程，高水平的CXCL9、CXCR3提示DLBCL患者5年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加，為臨床指示DLBCL患者預(yù)后提供潛在生物指標(biāo)。