miR-138通過靶向LCN2在七氟醚誘導的大鼠認知障礙中的作用及機制*

鄭育秀 劉麗麗 黃澤波 王濤 劉莉芳

(海南醫學院第二附屬醫院麻醉科，海南 海口 570311)

術后認知功能障礙(Postoperative cognitive dysfunction，POCD)是一種神經變性疾病，以長期POCD綜合征為特征[1]。手術和麻醉是導致認知障礙的主要原因，七氟醚麻醉可減少海馬區的神經發生和神經元存活[2]。此外，七氟醚麻醉可引起神經毒性和POCD[3]。因此，有必要探索一種針對七氟醚麻醉誘導的POCD的有效神經保護方法。越來越多的證據[4]表明，手術麻醉誘導的認知障礙與大腦發育相關的多種基因表達的改變有關。近年來，微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)的失調與麻醉相關的POCD有關[5]。MiRNAs是一種小的非編碼RNA，通過抑制轉錄本的翻譯或誘導靶mRNA的降解負向調控基因表達。此外，越來越多的miRNAs已被證明與麻醉劑誘導的海馬細胞凋亡有關[6-7]。由于miRNAs在細胞死亡和分化的調節中具有重要作用，鑒定參與麻醉劑暴露引起認知障礙的miRNAs并了解其功能分子機制至關重要。有一項研究[8]篩選了七氟醚暴露后差異表達的miRNAs，研究表明七氟醚治療后，miR-138是顯著下調的miRNAs之一。然而miR-138在七氟醚麻醉誘導中的功能性分子機制仍未知。Janus激酶2/信號轉導和轉錄激活因子3(Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)信號通路參與了許多生理過程，包括炎癥、增殖、分化和發育，它可能有助于驅動神經元對細胞因子的生存反應[9]。此外，JAK2/STAT3是POCD發展的潛在機制。李等[10]證明Kappa阿片受體激動劑對大鼠POCD具有神經保護作用，部分是通過抑制JAK2/STAT3通路介導的。在阿爾茨海默氏癥的動物模型中，激活JAK2/STAT3通路改善空間學習和記憶[11]。總之，這表明miR-138可能通過JAK2/STAT3信號通路參與七氟醚麻醉誘導的POCD。因此，本研究通過七氟醚治療建立認知障礙大鼠模型，進一步探討miR-138在七氟醚麻醉誘導認知障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 7周齡SD大鼠(240±10) g 90只，將其飼養在標準條件的實驗室中[溫度(22±1)℃、濕度(60±5)%、光照/黑暗周期為12 h]。大鼠可隨意獲得水和食物。所有實驗均經我院倫理委員會批準，并遵循國家衛生研究院關于動物護理和使用的指南進行。

1.2 主要試劑及儀器 七氟醚(上海恒瑞制藥有限公司)；miR-138 mimic、NC mimic、pcDNA-LCN2腺病毒載體合成[漢恒生物科技(上海)有限公司]；蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)；逆轉錄系統、SYBR Premix Ex Taq II、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒[普洛麥格(北京)生物技術有限公司]；ELISA試劑盒(Abcam公司)；BCA試劑盒(武漢博士德生物有限公司)；脂質運載蛋白2(Lipocalin-2，LCN2)、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH (Abcam公司)。Morris水迷宮視頻分析系統(上海玉研科學儀器有限公司)；分光光度計(Thermo Fisher Scientific公司)；多功能酶標儀[美谷分子儀器(上海)有限公司]；顯微鏡(Leica公司)；凝膠成像分析系統(Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及七氟醚麻醉 將SD大鼠隨機分為對照組(20只)、七氟醚組、七氟醚+NC mimic組、七氟醚+miR-138 mimic組、七氟醚+miR-138 mimic+Vector組、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2組。選用70只大鼠構建七氟醚麻醉誘導的認知障礙大鼠模型，將大鼠置于一個以5 L/min的速率供應2.5% 的七氟醚和空氣-氧氣混合物(吸入氧氣分數為40%)的麻醉室內，持續吸入6 h。實驗過程中用麻醉氣體監測儀連續監測七氟醚和氧氣的濃度，并測量直腸溫度維持在37℃左右。其中，20只大鼠為七氟醚組，剩余50只七氟醚誘導的大鼠側腦室分別注射10 μL NC mimic、miR-138 mimic以及共注射miR-138 mimic+Vector和miR-138 mimic+pcDNA-LCN2腺病毒懸液，記為七氟醚+NC mimic組(20只)、七氟醚+miR-138 mimic組(20只)、七氟醚+miR-138 mimic+Vector組(5只)、七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2組(5只)。對照組大鼠：吸入空氣-氧氣混合物6 h，共20只。

1.3.2 Morris水迷宮實驗 通過實驗評估暴露于七氟醚和常規空氣中大鼠的學習和記憶能力。每組大鼠被訓練在圓形水池中游泳5天。水池中放置一個直徑約10 cm、距水面2 cm的隱藏圓形平臺。將大鼠從不同位置(北、南、東、西)放入水中，實驗要求大鼠在60 s內游泳并找到平臺，當大鼠在規定時間內無法找到隱藏的平臺時，則將大鼠引導到平臺上，休息10 s再進行下一次實驗。采用ANY-maze動物行為視頻跟蹤系統記錄第5 d每只大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期)、穿越平臺次數。

1.3.3 HE染色 HE染色檢測大鼠海馬神經元的病理變化。各組大鼠深度麻醉后，逐層解剖暴露心臟，先灌注0.9%生理鹽水，再灌注4%多聚甲醛。灌注成功后解剖腦組織，固定后用石蠟包埋并切片。根據蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒說明書進行染色，蘇木精染色細胞核，伊紅染色細胞質。最后，在顯微鏡下觀察海馬神經元的形態并拍照。

1.3.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) Morris水迷宮實驗結束后，通過斷頭處死大鼠。在冰上快速解剖海馬組織，使用研缽將組織磨成粉末。分別用Trizol試劑從海馬組織中提取總RNA。使用分光光度計檢測RNA的濃度和純度。使用反轉錄試劑盒將1 μg的總RNA逆轉錄為cDNA。用SYBR Premix Ex Taq II檢測miR-138和LCN2的表達水平。GAPDH和U6分別用作LCN2和miR-138的內部對照，使用2-ΔΔCt方法計算目的基因的相對表達量。基因引物序列表，見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 Western blotting 大鼠海馬組織在含有1%苯甲磺酰氟的RIPA裂解緩沖液中勻漿。離心后收集上清液。采用BCA蛋白測定法測定蛋白濃度。蛋白質樣品經15% SDS-PAGE分離。隨后，蛋白質被轉移到PVDF膜上。在室溫下，將膜在5%脫脂牛奶封閉1 h，隨后與一抗在4℃孵育過夜，然后與相應的二抗在37℃孵育1 h。GAPDH作為內參。用化學發光試劑顯現條帶，并在Bio-Rad凝膠成像系統下觀察。利用Image J軟件分析目標條帶的灰度值。

1.3.6 酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 將每組大鼠的冷凍海馬標本與適量生理鹽水混合。充分勻漿后，在4℃下以8000 g的速度離心10 min。收集上清，根據試劑盒說明書使用ELISA試劑盒測定海馬組織中IL-6、TNF-α和IL-1β的表達水平。

1.3.7 末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP 缺口末端標記法(TUNEL法) 使用TUNEL染色試劑盒檢測大鼠海馬神經元凋亡。取TUNEL試劑盒中試劑1(TdT)和試劑2(dUTP)按1：9混合，覆蓋切片。TUNEL標記后，用4-6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)作為熒光示蹤劑復染海馬神經元以檢測細胞核。腦凋亡細胞均為TUNEL陽性，熒光顯微鏡下為綠色熒光標記。

1.3.8 雙熒光素酶報告基因 將LCN2的野生型(WT-LCN2)和突變型(MUT-LCN2)3’UTR構建到pMIR-REPORT螢火蟲熒光素酶載體中，該載體包含miR-138的預測結合位點。將293T細胞以1000個細胞/孔的密度接種到96孔板中。然后使用Lipofectamine 2000共轉染100 nM miR-138 mimic或NC mimic。轉染48 h后，使用雙熒光素酶報告分析試劑盒測定熒光素酶活性，并用腎素熒光素酶活性標準化。實驗重復3次。基因序列：miR-138序列為GCCGGACUAAGUGUUGUGGUCGA；WT-LCN2序列為AUCACCUGGCUGCCCCACCAGCC；MUT-LCN2序列為AUCACCUGGCUGCCCACAAGAAC。

2 結果

2.1 miR-138在七氟醚誘導的大鼠海馬中的表達水平 與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠海馬中miR-138的表達均顯著降低(P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組大鼠海馬中miR-138的表達顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組大鼠海馬中miR-138的表達水平

2.2 miR-138改善七氟醚誘導的大鼠空間認知能力 Morris水迷宮實驗結果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠逃避潛伏期均顯著增加，穿越平臺次數均顯著減少(P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組大鼠逃避潛伏期顯著減少，穿越平臺次數顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 miR-138減輕七氟醚誘導的大鼠海馬神經元病理損傷 HE染色結果顯示，對照組海馬組織排列規則，未見明顯的病理損傷；七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠海馬神經元細胞形態不完整，核濃縮，排列紊亂松散，體積小；而七氟醚+miR-138 mimic組大鼠海馬神經元的病理損傷一定程度上得到了改善，病理損傷減輕。見圖3。

圖3 HE染色檢測各組大鼠海馬神經元病理損傷(400×)

2.4 miR-138抑制七氟醚誘導的大鼠海馬神經元凋亡 Western blotting結果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠海馬神經元凋亡數量均顯著增加，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平均顯著升高，Bcl-2顯著降低(均P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組大鼠海馬神經元凋亡數量顯著減少，cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低，Bcl-2升高，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖4。

圖4 miR-138抑制七氟醚誘導的大鼠海馬神經元凋亡

2.5 miR-138抑制七氟醚誘導的大鼠海馬神經元炎癥反應 ELISA實驗結果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組大鼠中IL-1β、TNF-α、IL-6水平均顯著增加(均P<0.05)；與七氟醚組、七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組中IL-1β、TNF-α、IL-6水平降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖5。

圖5 miR-138抑制七氟醚誘導的大鼠海馬神經元炎癥反應

2.6 LCN2是miR-138的靶基因 雙熒光素酶報告實驗顯示，與LCN2-MUT和miR-138 mimic共轉染的細胞相比，miR-138 mimic與LCN2-MUT共轉染的細胞相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)。此外，RT-qPCR和Western blotting結果顯示，與對照組比較，七氟醚組和七氟醚+NC mimic組中LCN2水平均顯著升高，而七氟醚+miR-138 mimic組LCN2水平較七氟醚組、七氟醚+NC mimic組顯著降低(均P<0.05)。見圖6。

圖6 LCN2是miR-138的靶基因

2.7 miR-138靶向LCN2對七氟醚誘導的海馬中JAK2/STAT3通路蛋白及凋亡蛋白的影響 與七氟醚+NC mimic組比較，七氟醚+miR-138 mimic組中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平降低，Bcl-2水平升高，p- JAK2和p-STAT3蛋白水平

升高(均P<0.05)；與七氟醚+miR-138 mimic組、七氟醚+miR-138 mimic+Vector組比較，七氟醚+miR-138 mimic+pcDNA-LCN2組中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax蛋白水平均顯著升高，Bcl-2水平降低，p-JAK2和p-STAT3蛋白水平均顯著降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖7。

圖7 各組大鼠JAK2/STAT3通路蛋白及凋亡蛋白的表達

3 討論

POCD發病機制復雜，由麻醉和手術及多種因素引起的神經功能衰退，包括中樞神經系統的炎癥反應和凋亡。七氟醚是一種常用的吸入麻醉劑，引起的POCD的機制與神經炎癥和細胞凋亡密切相關[12]。因此，深入了解七氟醚誘發POCD的機制，尋找合適的靶點和機制來減少甚至消除POCD的發生是研究的重點。

據報道，許多miRNAs與麻醉誘導的POCD有關。其中，在七氟醚治療后，miR-96被證明可促進海馬神經元凋亡，加重七氟醚對海馬神經元和認知功能的影響[13]。此外，miR-34a可促進七氟醚誘導的海馬細胞凋亡[14]。然而，一些miRNA對七氟醚介導的細胞凋亡具有神經保護作用。研究發現miR-665抑制七氟醚誘導的細胞凋亡，提示具有潛在的神經保護作用。有研究[8]報道，miR-138是七氟醚暴露后下調最顯著的miRNA之一。本研究結果表明，與對照組大鼠相比，接受七氟醚治療的大鼠海馬組織中miR-138水平降低。

海馬體是學習、記憶以及其他基本認知能力的關鍵大腦區域[15]。因此，本實驗重點研究海馬體。七氟醚暴露可導致空間學習和記憶損傷[16]。本研究建立了七氟醚誘導的動物模型，通過Morris水迷宮實驗評估認知能力，結果發現暴露在七氟醚中會導致空間學習和記憶的缺失，表現為逃避潛伏期顯著增加，穿越平臺次數顯著減少；此外，七氟醚暴露導致海馬神經元嚴重損傷，這與之前的報道[17]關于麻醉藥引起的認知障礙是一致的。miR-138可以減少潛伏期時間，增加穿越平臺次數，海馬神經元的病理損傷減輕，這些結果表明miR-138可能在七氟醚麻醉誘導的大鼠認知障礙中具有重要作用。

研究[18]表明，七氟醚麻醉引起的大腦結構和神經POCD的變化是由激活的caspase-3的表達變化和神經細胞凋亡誘導引起的。Bcl-2家族的蛋白質，如Bax和Bcl-2被發現是調節線粒體膜對細胞色素C的通透性的分子，而Caspase-9被發現在細胞死亡中起核心作用[19]。抗凋亡蛋白Bcl-2在神經退行性疾病、缺血、氧化應激和創傷等多種逆境下調節神經元凋亡中發揮著關鍵作用，促凋亡Bax是許多神經細胞群體中誘導凋亡和壞死的重要因素[20-21]。而miR-138治療則改善七氟醚誘導的神經元凋亡，這可以通過TUNEL染色以及凋亡蛋白cleaved caspase-3、cleaved caspase-9和Bax水平的降低以及Bcl-2蛋白水平的升高來證明，提示miR-138通過抑制中樞神經細胞凋亡發揮神經保護作用。然而，POCD病的發病機制非常復雜，可能包括吸入麻醉藥的直接作用、手術創傷的后果以及炎癥反應。針對炎癥因子分布，有證據[22]表明，海馬中促炎癥因子和抗炎因子水平的變化與七氟醚誘導的POCD有關。此外，我們還證明了miR-138對炎癥的抑制作用，包括降低IL-6、TNF-α 、IL-1β的水平。雖然miRNA在七氟醚誘導的神經元凋亡和炎癥中發揮不同的作用，但miRNA的表達與七氟醚誘導的神經元進展密切相關。這些結果表明miR-138可以作為海馬凋亡和炎癥的抑制因子，減輕七氟醚麻醉誘導的認知障礙。

為了進一步確定miR-138在七氟醚誘導的認知障礙中的作用機制，本研究證明了miR-138可以與LCN2的3′-UTR結合并負調控其水平。在其他疾病中，miR-138-5p和LCN2表現出與我們的結果一致的調節關系。如miR-138可以負調控LCN2的表達，從而抑制缺氧誘導的心肌細胞凋亡[23]。LCN2是分泌型脂蛋白家族的成員，參與先天免疫、細胞凋亡和腎臟發育等多種細胞過程[24]。既往研究[25]還表明LCN2缺失會減弱海馬神經元死亡和認知能力下降。此外，腦室內注射重組LCN2蛋白引起CA1神經元死亡和POCD。據報道[26]LCN2通過JAK2/STAT3通路抑制神經炎癥損傷，在腦缺血中發揮了強大的治療作用。研究[27]發現JAK2/STAT3通路與認知功能有關，如右美托咪定通過JAK2/STAT3途徑減輕異氟醚誘導的認知障礙；山參處理通過激活JAK2/STAT3顯著減輕了通常由三甲基素引起的認知障礙[28]。目前的研究發現，異氟醚麻醉不僅增加了Bax的表達，降低了Bcl-2的表達，而且還增加了p-JAK2和p-STAT3蛋白的水平。這些結果表明七氟醚誘導的大鼠海馬神經元凋亡與JAK2/STAT3通路的激活有關。此外，miR-138治療抑制了神經元的凋亡，并且p-JAK2和p-STAT3蛋白的水平降低，而LCN2過表達又一次逆轉這一結果，表明miR-138靶向LCN2通過JAK2/STAT3通路抑制七氟醚麻醉誘導的海馬神經元凋亡。

4 結論

本研究結果提示，miR-138 靶向LCN2通過JAK2/STAT3信號通路對七氟醚麻醉誘導的大鼠POCD具有神經保護作用，為七氟醚麻醉誘導的認知障礙治療提供了新的靶點。然而，miR-138在七氟醚麻醉誘導的認知障礙中的分子機制要進一步闡明，仍需進一步深入研究。