TDAG8通過AKT/mTOR參與胰腺癌疼痛作用的機制*

吳瓊 張振武 王哲銀 張娟 趙妍

(深圳市人民醫院疼痛科，廣東 深圳 518020)

胰腺癌是癌癥死亡的重要原因之一，大多數胰腺癌患者在診斷時出現中度至重度疼痛，故疼痛治療尤為重要。胰腺癌疼痛的原因包括神經鞘和神經節的浸潤、導管和間質壓力增加以及腺體炎癥[1-2]。但胰腺癌疼痛機制尚未完全了解，目前對癌癥疼痛的評估和治療策略尚不充分。T細胞死亡相關基因8(TDAG8)是OGR1家族的一員，被鑒定為一種質子感應G蛋白偶聯受體。TDAG8主要在背根神經節(DRG)神經元中表達。越來越多的研究[3]表明TDAG8在疼痛中具有重要作用，如減弱脊髓中TDAG8的表達可抑制骨癌疼痛。另外，TDAG8可以調節神經膠質細胞數量來控制類風濕性關節炎慢性疼痛[4]。然而，目前對TDAG8維持胰腺癌疼痛的功能作用和潛在機制知之甚少。有研究[5-6]表明，絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)的激活可導致各種刺激引起的疼痛相關行為，如腦源性神經營養因子(BDNF)和神經損傷。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是AKT下游信號分子，調控轉錄、翻譯起始、核糖體生物合成和凋亡。最近的證據表明mTOR在脊髓和感覺神經元軸突中表達，阻斷mTOR可減輕與局部炎癥或神經性疼痛相關的疼痛相關行為[7-8]。然而，AKT/mTOR在胰腺癌疼痛中的作用報道鮮少。因此，本研究構建裸鼠移植瘤胰腺癌疼痛模型，通過沉默TDAG8及AKT通路抑制劑LY294002處理模型鼠來探討TDAG8在胰腺癌疼痛中的作用，進一步為臨床試驗提供可能幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 主要試劑、儀器 人胰腺癌細胞系SW1990細胞(中國科學院ATCC細胞庫)； AKT/mTOR通路抑制劑LY294002(上海碧云天生物公司)；反轉錄試劑盒、SYBR Green試劑盒、蘇木素伊紅(HE)染色試劑盒(寶日醫生物技術(北京)有限公司)；NC-siRNA、TDAG8-siRNA (siRNA鏈經過化學修飾)(深圳華大基因)； Trizol試劑(美國Invitrogen公司)；TDAG8、降鈣素基因相關肽(CGRP)、P物質(SP)、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR抗體(英國Abcam公司)。電子Von Frey測痛儀(美國IITC)；石蠟切片機(德國Leica公司)；普通光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；凝膠成像系統(美國BioRad公司)。

1.1.2 實驗動物 5周齡雌性BALB/c裸鼠(19～21 g)48只飼養在溫度23℃～25℃、濕度45%～55%的12 h的光/暗循環環境中，食物和水可以隨意獲得。所有實驗得到本院倫理委員會的批準(IACUC202006)。

1.2 方法

1.2.1 構建胰腺癌裸鼠模型 人胰腺癌細胞系SW1990保存在添加10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中進行培養，每3天更換一次培養基。BALB/c裸鼠在特定的無病原體環境中適應一周后，用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉裸鼠，在左側腰區切開腹部，將胰腺尾部和脾臟暴露出來。用裝有26號針的注射器將20 μL SW 1990細胞(5×106)緩慢注入胰腺體內，形成2～3 mm的囊泡。隨后將胰腺和脾臟移入腹腔，用手術縫合線縫合切口。所有手術均在超凈臺中進行。然后，進行藥物治療和疼痛行為。

1.2.2 實驗分組及給藥 將裸鼠隨機分為4組：假手術組(Sham組)、模型組(Model組)、NC-siRNA組、TDAG8-siRNA組，每組12只。Sham組裸鼠注射相同體積的培養基作為對照。NC-siRNA、TDAG8-siRNA、LY294002組在構建胰腺癌裸鼠模型后分別每天腹腔注射100 μL NC-siRNA、TDAG8-siRNA。同時模型組裸鼠隨機分兩組，分別腹腔注射AKT/mTOR通路抑制劑LY294002 30 mg/kg (LY294002組)以及相同體積的DMSO溶液(DMSO組)作為對照。

1.2.3 HE染色 裸鼠造模4周后，將Sham組和Model組裸鼠麻醉，隨后解剖裸鼠胸腔暴露心臟，生理鹽水灌注主動脈，然后用4%多聚甲醛固定。灌注成功后，將胰腺從腹膜臟器分離，置于4%多聚甲醛過夜。將胰腺組織放入不同酒精梯度脫水，二甲苯透明，隨后制作石蠟組織塊，并切成5 μm的切片。切片經二甲苯和酒精梯度脫蠟、復水。然后根據HE試劑盒說明書進行染色，染色完成后梯度酒精脫水，晾干，用中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察組織切片，拍照保存。

1.2.4 測量體重 分別于造模后1、3、5、7、10、14、21、28 d測量Sham組和Model組裸鼠體重，記錄并分析。

1.2.5 駝背評分 將裸鼠單獨放置在一個開闊的場地中心，地板上覆蓋著干凈的無紡布，并對其進行300秒的觀察。駝背行為0～4分：0分：正常；1分：輕度聳起；2分：嚴重聳起；3分：嚴重駝背，活動減少；4分：靜止不動。觀察人員對組別進行盲法，由3名獨立人員統計結果。

1.2.6 檢測裸鼠腹部機械性痛覺閾值 為了評估裸鼠機械痛覺過敏行為，實驗動物提前3 d在試驗環境中適應，每天10 min。根據以前報道的方法[10]，采用電子Von Frey儀測量機械痛閾值。將裸鼠置于網狀篩網平臺頂部的塑料室中，適應10 min。逐漸以越來越大的力刺激裸鼠上腹部區域的皮膚。在刺激過程中的裸鼠出現舔撓腹部或者退縮被認為是陽性反應。記錄儀器獲得的值為機械痛閾值。試驗連續進行5次，計算平均痛閾值(每15 min 進行一次試驗)。

1.2.7 實時熒光定量PCR 在手術后的不同時間點處死裸鼠，由于胰腺由來自脊髓T8～12的神經支配，因此使用Trizol試劑從脊髓背角組織中提取總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒反轉錄成cDNA。使用SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒進行實時熒光定量PCR (RT-qPCR)分析，并使用β-actin標準化靶基因mRNA的相對表達。引物序列：TDAG8：forward 5′-CAG CAG CAC GGC CTT CCT CAC TT-3′，reverse 5′-CGA CAC TTG TTT CGT CTT CCC AC-3′；β-actin：forward 5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，reverse 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′。

1.2.8 Western blotting 在手術后的不同時間點處死裸鼠，在冰上取脊髓背角組織于含有10 mM PMSF的RIPA裂解緩沖液中勻漿提取。首先，在10% SDS-PAGE凝膠上分離每孔含20 μg總蛋白的20 μL上樣緩沖液，然后轉移至PVDF膜。用5%脫脂牛奶在TBST中室溫封閉1 h，并與一抗在4℃下孵育過夜。二抗孵育2 h后，使用Bio-Rad紫外成像系統檢測印跡信號，Image J軟件對免疫印跡進行定量。

2 結果

2.1 胰腺癌痛裸鼠和正常裸鼠體重變化的比較 Sham組裸鼠術后第8 d開始體重逐漸增加，而Model組裸鼠體重從第8 d逐漸降低，與Sham組比較，Model組裸鼠第10～28 d體重顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組裸鼠的體重變化

2.2 胰腺癌痛裸鼠和正常裸鼠胰腺組織病理學變化的比較 HE染色結果顯示，Sham組裸鼠胰腺組織中腺泡細胞排列整齊，并且觀察到規則的胰島細胞；Model組裸鼠胰腺中觀察到胰腺癌細胞呈條索狀排列密集，可見炎性細胞浸潤。見圖2。

圖2 各組裸鼠的胰腺組織HE染色

2.3 胰腺癌痛裸鼠脊髓背角組織中TDAG8的表達 為了揭示疼痛過程的分子機制，通過RT-qPCR和Western blotting 檢測胰腺癌痛裸鼠脊髓背角組織中TDAG8的表達，結果顯示，與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組中TDAG8 mRNA和蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組的TDAG8 mRNA和蛋白水平顯著降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。見圖3。

圖3 各組裸鼠脊髓背角組織中TDAG8的表達

2.4 抑制TDAG8對胰腺癌痛裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的影響 與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組裸鼠從第14～28 d駝背評分顯著升高(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組裸鼠第14～28 d評分顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。使用Von Frey纖維測痛儀測量裸鼠腹部機械刺激痛敏反應，結果顯示，與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組裸鼠在術后第10～28 d腹腔機械痛閾值均顯著下降(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組裸鼠第10～28 d腹腔機械痛閾值顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的表達

2.5 抑制TDAG8對胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP及AKT/mTOR通路蛋白表達的影響 Western blotting 結果顯示，與Sham組比較，Model組和NC-siRNA組SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平均顯著升高(P<0.05)；與Model組、NC-siRNA組比較，TDAG8-siRNA組的SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

圖5 各組裸鼠脊髓背角組織SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白的表達

2.6 LY294002對胰腺癌痛裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的影響 與DMSO組比較，LY294002組裸鼠第14～28 d駝背評分顯著降低，并且逐漸減少(P<0.05)；裸鼠腹部機械刺激痛敏反應實驗結果顯示，裸鼠術后第10～28 d腹腔機械痛閾值顯著升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖6 LY294002對胰腺癌痛裸鼠駝背評分以及機械痛閾值的影響

2.7 LY294002對胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白表達的影響 Western blotting 結果顯示，與DMSO組比較，LY294002組SP、CGRP、p-AKT和p-mTOR蛋白水平顯著降低，差異均有統計學意義(P<0.05)，見圖7。

圖7 LY294002對胰腺癌痛裸鼠中SP、CGRP以及AKT/mTOR通路蛋白表達的影響

3 結論

胰腺癌引起的劇烈疼痛嚴重損害了患者的生活質量，威脅患者的生命。疼痛治療的藥物包括阿片類藥物和非阿片類輔助鎮痛藥物，如非甾體抗炎藥物。然而，大多數疼痛治療不能控制胰腺癌疼痛[9-10]。為了研究人類胰腺癌相關疼痛，本研究通過將人SW 1990細胞移植到BALB/c裸鼠體內，成功地建立了胰腺癌誘導疼痛裸鼠模型，這一模型與韓等[11]之前報道的模型一致。在術后第4周，組織學分析顯示，正常裸鼠內分泌細胞排列整齊，胰島正常。內分泌細胞和胰島分布在毛細血管周圍，用于傳遞分泌的激素。相比之下，在SW 1990異種移植裸鼠胰腺中發現正常胰腺組織結構被破壞，表明成功構建了胰腺癌痛動物模型。本研究結果顯示SW 1990異種移植裸鼠體重明顯減輕。癌癥患者體重下降是由于疼痛和胃出口梗阻引起的，導致飲食攝入減少。

胰腺癌患者的疼痛很難控制，因為只有當腫瘤高度進展并迅速轉移到其他器官時，內臟疼痛才會出現[12]。內臟疼痛導致腹部皮膚機械刺激后疼痛閾值降低，稱為機械異常性疼痛[13]。在本研究的動物模型中觀察到類似的現象。SW 1990異種移植裸鼠腹部皮膚的機械閾值持續降低，表明在當前模型中，胰腺癌引起的內臟疼痛因腫瘤進展增加而加重。內臟疼痛引起的轉導途徑和感知與皮膚疼痛不同。腹部器官接受雙重外源性神經支配，包括脊髓和迷走神經。軀體性疼痛的定位和特征明確，而內臟性疼痛則呈彌漫性定位不準確。在患者和動物模型中觀察到自發的內臟痛行為[14-15]。在本研究中，胰腺癌誘發疼痛裸鼠模型引起顯著的駝背行為。降鈣素基因相關肽(CGRP)和P物質(SP)是影響疼痛傳遞的兩種重要神經遞質，在脊髓損傷大鼠背角中表達上調。有研究[16]表明，P物質和CGRP等神經肽在疼痛產生中起關鍵作用，抑制CGRP和SP可減輕疼痛。本研究結果顯示胰腺癌誘發疼痛裸鼠中CGRP和SP表達升高，與之前研究一致。有研究[17]報道TDAG8在脊髓和背根神經節中表達，支持了TDAG8參與痛覺的可能。近年研究[18-19]發現TDAG8參與炎癥性疼痛和骨癌性疼痛。目前鮮少有研究報道TDAG8在胰腺癌疼痛中的表達。本研究發現胰腺癌痛裸鼠脊髓背角組織中TDAG8表達顯著升高。此外，TDAG8基因沉默減輕了胰腺癌誘導的機械痛覺過敏和內臟痛引起的駝背評分，并且抑制CGRP和SP的表達，以上結果證實了TDAG8在胰腺癌疼痛中具有重要作用。

AKT-mTOR信號級聯參與了一些生理和病理過程，如嗎啡耐受、痛覺過敏、血管生成等。既往研究[20]表明，AKT信號通路是神經性疼痛脊髓中樞致敏所必需的。mTOR是AKT通路的下游激酶之一，在疼痛相關的中樞神經系統中被激活，并作為阿片類藥物誘導痛覺過敏的有效靶點[21]。AKT/mTOR信號通路與疼痛密切相關外，研究表明，在慢性收縮損傷大鼠模型中，AKT/mTOR通路與慢性神經性疼痛相關[22]。在本研究中發現胰腺癌誘發疼痛裸鼠中AKT/mTOR信號通路相關蛋白磷酸化水平升高，這表明AKT/mTOR信號通路在裸鼠胰腺癌誘發疼痛中被激活。此外，結果還發現TDAG8 siRNA抑制 AKT/mTOR信號通路的激活。LY294002是一種AKT抑制劑，已被廣泛用于阻斷動物模型中的AKT/mTOR信號通路[23]。為了進一步驗證抑制AKT/mTOR信號通路在裸鼠胰腺癌誘發疼痛中的作用，本研究將LY294002腹腔注射到胰腺癌模型裸鼠體內，同時注射等體積的DMSO為對照，隨后研究其對機械痛覺過敏及內臟痛行為的影響。結果發現LY294002對胰腺癌痛裸鼠的影響結果與抑制TDAG8表達的結果一致。因此，靶向AKT/mTOR信號通路可能提供了一種通過TDAG8治療胰腺癌疼痛的策略。

4 結論

本研究結果提示，TDAG8在胰腺癌疼痛進展中具有重要作用，抑制TDAG8可通過抑制AKT/ mTOR信號通路的激活從而減輕胰腺癌疼痛。靶向TDAG8或其下游信號分子可能有效緩解胰腺癌疼痛，這一研究發現可能在將來為預防、減輕或完全緩解胰腺癌的疼痛治療方法提供一種新途徑。