miR-320通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路減輕大鼠燒傷后腸道黏膜損傷

溫海玲 楊景哲 孟祥熙 張祥云

1承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院南院區(qū)燒傷整形科（河北承德 067000）；2河北省軍區(qū)承德離職干部休養(yǎng)所（河北承德 067000）

燒傷后腸道損傷引起的生理屏障損傷是導(dǎo)致患者死亡的重要因素之一［1］。嚴(yán)重?zé)齻?，腸道微血管通透性增加，腸細(xì)胞壞死、細(xì)胞凋亡和腸黏膜屏障功能受損，導(dǎo)致腸道細(xì)菌和毒素移位，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征和多器官功能障礙綜合征［2］。最近的研究表明，腸道炎癥是燒傷后腸道屏障破壞的主要原因［3］。然而，腸道微生態(tài)是一個(gè)與宿主共生的復(fù)雜生態(tài)網(wǎng)絡(luò)。腸道微生態(tài)功能障礙介導(dǎo)的腸道屏障破壞的具體機(jī)制涉及多種因素。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）是哺乳動(dòng)物模式識(shí)別受體家族的成員，被認(rèn)為是將細(xì)胞外抗原識(shí)別信息傳遞給細(xì)胞并引發(fā)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵跨膜蛋白［4］。研究表明［5］，TLR4 在燒傷期間的炎癥啟動(dòng)和器官損傷中起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)髓系分化初級(jí)反應(yīng)基因88（myeloid differentiation primary response gene 88，MyD88）依賴性通路，TLR4 可以介導(dǎo)核因子（NF）-κB的活化，進(jìn)而誘導(dǎo)包括腫瘤壞死因子（TNF）-α 和白細(xì)胞介素（IL）-6 在內(nèi)的炎性細(xì)胞因子的表達(dá)和釋放，導(dǎo)致炎癥正反饋的惡性循環(huán)［5］。但是TLR4 只能通過(guò)與其特異性配體結(jié)合才能介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［6］。MicroRNA（miRNA）是短的非編碼RNA 序列，在各種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［7］。燒傷、疾病和其他一些因素可能會(huì)改變miRNA 的表達(dá)，從而對(duì)腸道穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響［8］。有證據(jù)表明miR-320 參與了多種病理過(guò)程，包括調(diào)節(jié)各種細(xì)胞和器官的炎癥過(guò)程，并且與細(xì)胞增殖、凋亡有關(guān)［9］。此外，最新證據(jù)表明，上調(diào)miR-320 表達(dá)減少燒傷后氧化應(yīng)激和腸細(xì)胞凋亡［10］。表明miR-320 可能在燒傷誘導(dǎo)的腸道損傷中具有保護(hù)作用，但是具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究通過(guò)建立大鼠燒傷模型，探討miR-320 的腸道保護(hù)機(jī)制是否與TLR4/NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性Sprague-Dawley 大鼠（240 ～260 g）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司（許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008）。大鼠被關(guān)在籠子里，在特定的無(wú)病原體條件下，允許隨意獲取食物和水，并保持12 h 的暗/光周期（室溫20～24 ℃，相對(duì)濕度40%～70%）。這些動(dòng)物是分開(kāi)飼養(yǎng)的，隨機(jī)在籠子里飼養(yǎng)4 ～6 只動(dòng)物。本研究經(jīng)承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 燒傷模型建立和分組處理 在燒傷模型建立前24 h，將80 g/L 硫化鈉應(yīng)用于大鼠脫毛背表面。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食物和水。通過(guò)腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉動(dòng)物。將大鼠放置在預(yù)制模板的矩形開(kāi)口，露出裸露皮膚，同時(shí)保護(hù)剩余皮膚，根據(jù)Walker-Mason 燒傷模型［11］，將大鼠裸露的皮膚沉浸在沸水中（100 ℃水浴，背部15 s）造成20%TBSAⅢ°燙傷（下文簡(jiǎn)稱燒傷），燒傷后大鼠立即干燥。假手術(shù)組采用溫水（37 ℃水浴，背部15 s）行背部浸泡。SD 大鼠隨機(jī)分為4組（n=12）：假手術(shù)（Sham）組、假手術(shù)+miR-320 組、燒傷（Scald）組和燒傷+miR-320組。燒傷組和燒傷+miR-320 組建立燒傷模型，并且燒傷+miR-320 組在燒傷模型建立前1 周通過(guò)尾靜脈注射腺相關(guān)病毒（AAV）-miR-320（山東維真生物科技有限公司），連續(xù)3 d，每天注射5 μL。此外，假手術(shù)+miR-320 組在相同時(shí)間注射AAV-miR-320。各組于燒傷后24 h 隨機(jī)處死6 只動(dòng)物。麻醉動(dòng)物后，沿著腹部中線切開(kāi)腹壁，暴露并分離腹主動(dòng)脈，并進(jìn)行腹主動(dòng)脈穿刺。抽取10 mL 動(dòng)脈血，將動(dòng)物處死。切除回腸末端組織，用生理鹽水沖洗并分成兩部分。其中一部分在液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移到冰箱中-80 ℃保存。另一部分儲(chǔ)存在4%多聚甲醛中。各組其余6只小鼠用于體內(nèi)FITC-葡聚糖測(cè)定。

1.3 組織學(xué)分析 回腸末端組織在4%多聚甲醛中浸泡一夜，轉(zhuǎn)移到pH 7.4 的磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）中，并以4 μm 的厚度切片。隨后，使用蘇木精和伊紅（H&E）對(duì)切片進(jìn)行染色，并使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 將獲取血樣在4 ℃下以3 000×g離心15 min。收集從樣品中分離的血清，并使用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、IL-6 和DAO的濃度。

1.5 體內(nèi)FITC-葡聚糖測(cè)定 參照文獻(xiàn)方法［12］測(cè)定FITC-葡聚糖，用于評(píng)估腸道通透性。大鼠禁食3 h，然后以40 mg/100 g 的劑量灌胃FITC-葡聚糖溶液。4 h 后，通過(guò)腹主動(dòng)脈穿刺采集血樣，并在4 ℃下以3 000 ×g離心10 min 分離血清。使用熒光酶標(biāo)儀測(cè)量FD-40 的血清吸光度，激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm。

1.6 RNA 提取和RT-qPCR 分析 使用總RNA 提取試劑盒（北京Solarbio 公司）從腸組織中提取總RNA。然后使用iScript cDNA 合成試劑盒（美國(guó)Bio-Rad 公司）對(duì)RNA 樣本進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，并在CFX96實(shí)時(shí)系統(tǒng)（Bio-Rad）上使用SYBR Green Supermix（Bio-Rad）進(jìn)行定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTqPCR）擴(kuò)增。miR-320 的定量使用針對(duì)miRNA 設(shè)計(jì)的Bulge-loop miRNA RT-qPCR 引物（廣州RiboBio公司）進(jìn)行。U6 用于使miR-320 水平正常化。所使用的引物序列如下：miR-320 正向：5′-AAAAGCTGGGTTGAGAGGG-3′，反向：5′-TGCGTGTCGTGGAGTC-3′；U6 正向：5′-GAAGCGCGGCCACGAG-3′，反向：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。細(xì)胞接種在含有10%胎牛血清（FBS）（美國(guó)Invitrogen 公司）、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70% ～80%匯合時(shí)，將細(xì)胞分為：對(duì)照組（Con）、Con+miR-320 組、LPS 組和LPS+miR-320 組。miR-320 模擬物（miR-320）和對(duì)照模擬物（miR-NC）均購(gòu)自廣州Ribo-Bio 公司。使用Lipofectamine 3000（美國(guó)Invitrogen 公司）將miRNC 轉(zhuǎn)染至Con 組和Con+miR-320 組細(xì)胞，將miR-320 轉(zhuǎn)染至LPS 組和LPS+miR-320 組細(xì)胞。48 h后收獲轉(zhuǎn)染細(xì)胞，LPS 組和LPS+miR-320 組加入50 μg/mL LPS（美國(guó)Sigma 公司）處理24 h。Con 組和Con+miR-320 組使用載體處理24 h。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析 使用RIPA 裂解緩沖液（上海Beyotime 公司）在冰上從回腸組織或細(xì)胞中分離總蛋白。收集上清液，并在4 ℃下以12 000 r/min離心10 min后，使用BCA分析試劑盒（上海Beyotime公司）檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)通過(guò)10% SDSPAGE分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h 后，將膜用PBS 洗滌兩次，隨后與針對(duì)ZO-1（1∶500；美國(guó)Invitrogen 公司），Claudin 1（1∶500；英國(guó)Abcam 公司），TLR4、MyD88、NF-κB p-p65、NF-κB p65（1∶800；美國(guó)CST 公司）和GAPDH（1∶10 000；Abcam）在4 ℃孵育過(guò)夜。將膜用Tris 緩沖液-吐溫緩沖液洗滌3 次，然后與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000；Abcam）在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑（美國(guó)PerkinElmer 公司）顯示信號(hào)。使用Image J 軟件計(jì)算條帶強(qiáng)度，并將其歸一化為GAPDH 的條帶強(qiáng)度。

1.9 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè) TLR4 的pGL3 熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒由上海Genomeditech 公司設(shè)計(jì)。使用Lipofectamine 3000 試劑將報(bào)告質(zhì)?；蜉d體對(duì)照和miR-320 模擬物或miR-NC 共轉(zhuǎn)染到NCM460細(xì)胞中。48 h 后，使用雙熒光素酶測(cè)定系統(tǒng)（美國(guó)Promega 公司）檢測(cè)熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，并使用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)方差分析（ANOVA）或t檢驗(yàn)評(píng)估差異的顯著性。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 燒傷誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙期間miR-320 表達(dá)降低 假手術(shù)組腸黏膜絨毛在燒傷后24 h 致密、高聳、完整，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1A）。與假手術(shù)組相比，燒傷組腸黏膜絨毛水腫、變短、變寬，腸黏膜明顯受損，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，并且燒傷組大鼠血清中DAO 和FITC 葡聚糖表達(dá)顯著增加（P＜0.05）（圖1B-C），表明燒傷大鼠腸道通透性增加。此外，燒傷組大鼠腸道組織中miR-320 的表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低（P＜0.05，圖1D）。

圖1 燒傷誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙期間miR-320 表達(dá)降低Fig.1 Decreased miR-320 expression during burn-induced intestinal barrier dysfunction

2.2 miR-320 上調(diào)減弱炎癥反應(yīng)并改善燒傷大鼠的腸道屏障功能 大鼠通過(guò)尾靜脈連續(xù)三天注射miR-320 模擬物，誘導(dǎo)腸組織中miR-320 表達(dá)顯著增加（P＜0.05，圖2A）。ELISA 測(cè)量顯示上調(diào)miR-320 顯著 降 低了TNF-α 和IL-6的血清濃度（P＜0.05，圖2B、C）。此外，燒傷誘導(dǎo)的血清DAO和FITC-葡聚糖以及萎縮性腸黏膜的增加被miR-320 模擬物部分改善（P＜0.05，圖2D、F）。通過(guò)用miR-320 模擬物處理，腸道組織中Occludin 和ZO-1的水平也升高（P＜0.05，圖2G）。

圖2 miR-320 上調(diào)減弱炎癥反應(yīng)并改善燒傷大鼠的腸道屏障功能Fig.2 Up-regulation of miR-320 attenuates inflammatory response and improves intestinal barrier function in burned rats

2.3 miR-320介導(dǎo)的保護(hù)作用涉及TLR4/NF-κB信號(hào)通路 與假手術(shù)組相比，燒傷組中TLR4、MyD88蛋白的表達(dá)和p-NF-κB（p-p65）磷酸化均顯著升高（P＜0.05）。與燒傷組相比，燒傷+miR-320 組中TLR4、MyD88 蛋白的表達(dá)和p-NF-κB（p-p65）磷酸化均顯著降低（P＜0.05，圖3）。

圖3 miR-320 抑制燒傷大鼠腸道中TLR4/NF-κB 信號(hào)通路Fig.3 miR-320 inhibits the TLR4/NF-κB signaling pathway in the gut of burn rats

2.4 miR-320 體外抑制腸上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB通路的活性 研究使用TargetScan 證實(shí)了TLR4 是miR-320 的潛在靶基因（圖4A）。細(xì)胞熒光素酶活性測(cè)定結(jié)果表明，在pGL3-TLR4 3′UTR-WT 載體存在的情況下，用miR-320 模擬物轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶活性降低（P＜0.05，圖4B）。此外，LPS 處理的NCM460 細(xì)胞中miR-320 表達(dá)顯著降低（P＜0.05），TLR4、MyD88 蛋白的表達(dá)和p-NF-κB（p-p65）磷酸化均顯著升高（P＜0.05，圖4C、D）。miR-320上調(diào)逆轉(zhuǎn)了LPS 誘導(dǎo)的TLR4/NF-κB 通路激活（P＜0.05），并且減少了NCM460 細(xì)胞培養(yǎng)基中TNF-α 和IL-6的濃度（P＜0.05，圖4E、F）。

圖4 miR-320 體外抑制腸上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB 通路的活性Fig.4 miR-320 inhibits the activity of TLR4/NF-κB pathway in intestinal epithelial cells in vitro

3 討論

燒傷會(huì)改變腸道結(jié)構(gòu)、功能并破壞腸黏膜屏障，從而導(dǎo)致腸道細(xì)菌移位和嚴(yán)重的燒傷感染［1］。因此，保護(hù)腸道結(jié)構(gòu)的完整性，促進(jìn)燒傷后腸黏膜的恢復(fù)，具有重要的臨床意義。本研究中，HE 染色觀察到燒傷模型大鼠腸絨毛紊亂，腸細(xì)胞變性壞死，表明燒傷大鼠腸黏膜受損。先前研究表明，miR-320 與腸道免疫密切相關(guān)，在腸道損傷中起著核心作用［13］。本研究改變了腸道m(xù)iR-320的表達(dá)并建立了燒傷大鼠模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-320 會(huì)降低腸道炎癥水平并減輕腸道屏障的破壞，其保護(hù)機(jī)制與抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路激活相關(guān)。

越來(lái)越多的研究認(rèn)為miRNA 在許多免疫相關(guān)疾病中發(fā)揮著重要作用［14］。最近的一項(xiàng)研究［13］報(bào)告，miR-320 通過(guò)與眾多靶標(biāo)結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)主要免疫細(xì)胞類型，從而調(diào)節(jié)微環(huán)境。腸道是一個(gè)巨大的免疫器官，是一個(gè)完整而穩(wěn)定的生物網(wǎng)絡(luò)［15］。腸道微環(huán)境至關(guān)重要，腸道菌群越來(lái)越被認(rèn)為是腸道微環(huán)境的重要組成部分；許多研究都報(bào)道了疾病中腸道菌群的變化。既往研究報(bào)道，miRNAs 參與病原菌感染中免疫功能和炎癥的調(diào)節(jié)［16］。LIU等［17］據(jù)報(bào)道，大腸桿菌和具核梭桿菌的生長(zhǎng)受合成的miRNA 模擬物調(diào)節(jié)，其滲透細(xì)菌并因此影響細(xì)菌基因調(diào)控。miR-320 具有復(fù)雜的生物學(xué)功能和獨(dú)特的表達(dá)譜，在各種生理和病理過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用［5］。它是一種被廣泛研究的miRNA，與免疫和炎癥密切相關(guān)。既往研究［18］證實(shí)，miR-320 在炎癥性腸病患者的炎癥組織中低表達(dá)。此外，有研究［19］發(fā)現(xiàn)miR-320 在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎的過(guò)程增強(qiáng)腸道屏障功能。本研究得出了相同的結(jié)論。此外，AAV9 可以介導(dǎo)腸道中的靶向基因轉(zhuǎn)移來(lái)調(diào)節(jié)miR-320 在腸道中的表達(dá)［20］。本研究發(fā)現(xiàn)miR-320 過(guò)表達(dá)減輕了腸道屏障的破壞與炎癥水平。因此，進(jìn)一步證明了miR-320 可能在保護(hù)燒傷介導(dǎo)的腸道破壞中起重要作用。

本研究觀察到燒傷誘導(dǎo)后，大鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的腸道炎癥，這與之前的研究結(jié)果一致［3，10］。同時(shí)，燒傷誘導(dǎo)腸道TLR4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路的明顯激活。miR-320 干預(yù)改善了腸道炎癥，并顯著抑制了TLR4/MyD88/NF-κB 的激活。TLR4/MyD88/NF-κB 通路被普遍認(rèn)為在炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［21］。在健康的成年哺乳動(dòng)物中，腸道上皮中的TLR4 表達(dá)水平通常非常低甚至可以忽略不計(jì)，從而限制了針對(duì)胃腸道微生物群的過(guò)度炎癥反應(yīng)［22］；而在各種病理情況下腸道TLR4 表達(dá)顯著增加，例如缺血/再灌注、內(nèi)毒素血癥、潰瘍性結(jié)腸炎等［23］。WEN 等［24］發(fā)現(xiàn)在嚴(yán)重?zé)齻笫竽c道的黏膜中，TLR4和NF-κB蛋白水平高度上調(diào)。相比之下，本研究顯示燒傷后大鼠腸道組織中TLR4 蛋白表達(dá)的明顯上調(diào)。另一方面，TLR4/NF-κB 激活也被證明可以下調(diào)TJP 表達(dá)并增加腸道通透性。GUO 等［5］觀察到燒傷大鼠回腸遠(yuǎn)端TLR4/NF-κB 激活，伴隨明顯的腸道屏障破壞，表現(xiàn)為血漿DAO 和內(nèi)毒素水平升高，以及ZO-1 和occludin 下調(diào)。本研究驗(yàn)證了上述結(jié)果，并在體外觀察到miR-320 可抑制LPS 誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞TLR4/NF-κB 信號(hào)通路激活，表明miR-320 的腸道保護(hù)機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB 通路有關(guān)。

總之，本研究揭示了燒傷誘導(dǎo)的腸屏障功能障礙中miR-320 水平降低。miR-320 的上調(diào)通過(guò)抑制TLR4/MyD88//NF-κB 信號(hào)通路來(lái)減少炎癥反應(yīng)并改善腸道屏障功能。因此，miR-320 有望成為治療燒傷誘導(dǎo)的腸道屏障功能障礙的潛在新靶點(diǎn)。