妊娠期糖尿病孕婦及2型糖尿病患者腸道菌群的特點(diǎn)分析

青 瑤, 周環(huán)宇, 周超夢(mèng), 宋 哲, 韋金華, 高劍波, 4

(1. 蚌埠醫(yī)學(xué)院 研究生院, 安徽 蚌埠, 233000; 2. 大連醫(yī)科大學(xué) 研究生院, 遼寧 大連, 116000;3. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 產(chǎn)科, 江蘇 常州, 213000;4. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院 內(nèi)分泌代謝科, 江蘇 常州, 213000)

2型糖尿病(T2DM)是一種以胰島素抵抗和慢性低度炎癥為特征的代謝性疾病，可引起眼、腎臟、心臟、血管等重要組織器官慢性損害，病情嚴(yán)重時(shí)可危及生命。T2DM好發(fā)于40歲以上人群，但隨著現(xiàn)代化生活方式的轉(zhuǎn)變，其發(fā)病年齡日趨年輕化[1]。部分年輕T2DM女性患者由妊娠期糖尿病(GDM)孕婦產(chǎn)后進(jìn)展而來, 20%～50%的GDM孕婦在產(chǎn)后5年內(nèi)可進(jìn)展為T2DM[2]。

GDM是懷孕期間首次出現(xiàn)的不同程度的糖代謝異常，是孕期最常見的并發(fā)癥之一[3]。GDM會(huì)對(duì)母親及后代的健康產(chǎn)生短期和長期的不利影響，例如剖宮產(chǎn)、巨大兒、新生兒低血糖癥等不良妊娠結(jié)局，母親及其后代罹患肥胖、心血管疾病、T2DM等疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加[4]。GDM嚴(yán)重威脅母親及其后代的生命健康，因此有必要在孕期進(jìn)行有效干預(yù)，從而預(yù)防或減少母親及其后代相關(guān)代謝性疾病的發(fā)生。目前, GDM的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與T2DM的發(fā)生機(jī)制相似[5], 現(xiàn)有研究[6]顯示腸道菌群紊亂與T2DM的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。本研究分析了GDM孕婦和T2DM患者腸道菌群特點(diǎn)，探討腸道菌群影響GDM和T2DM發(fā)生的可能機(jī)制，尋找差異菌群，以期為未來臨床應(yīng)用腸道微生態(tài)制劑治療GDM和T2DM提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年2月—2021年3月南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院產(chǎn)科、內(nèi)分泌科、體檢科的61例女性為研究對(duì)象。將GDM孕婦納為G組(n=15), 該組符合2010年國際糖尿病與妊娠研究組(IADPSG)關(guān)于GDM的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]; 健康孕婦納為N組(n=18); T2DM患者納為D組(n=14), 該組符合1999年世衛(wèi)組織(WHO)關(guān)于T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]; 健康女性納為A組(n=14)。4組納入標(biāo)準(zhǔn)為: ① 20～40歲的中國女性; ② 采樣前1個(gè)月內(nèi)未使用抗生素治療, 2周內(nèi)未服用益生菌制劑者; ③ 無炎癥性腸病、腸易激綜合征等胃腸道疾病者; ④ 無腫瘤病史及心、肝、腎等臟器功能不全者; ⑤ 無自身免疫性疾病和甲狀腺等其他內(nèi)分泌疾病者。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬常州第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 方法

在清晨采集參與者新鮮糞便樣本，為了避免糞便表面和尿液污染，用無菌勺收集糞便內(nèi)部樣品3～5 g, 置于無菌密閉管中，立即放入-80 ℃冰箱保存。同時(shí)收集所有參與者的信息，如年齡、身高、體質(zhì)量、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、血壓、總膽固醇、甘油三酯等臨床資料。

根據(jù)操作說明書使用QIAGEN公司的QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit提取糞便細(xì)菌總DNA, 使用Qubit Fluorometer檢測(cè)DNA的濃度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測(cè)DNA的完整性，將質(zhì)量合格的DNA樣品送往武漢華大基因有限公司，構(gòu)建測(cè)序文庫和進(jìn)行Illumina HiSeq2500平臺(tái)高通量測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

下機(jī)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)過濾，得到的高質(zhì)量Clean data用于后期分析; 通過reads之間的overlap關(guān)系(重疊關(guān)系)將reads拼接成Tags; 然后把Tags聚類成OTU, 再與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)、物種注釋; 之后基于OTU和物種注釋結(jié)果進(jìn)行樣品物種多樣性分析、組間物種差異分析等。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料中符合正態(tài)分布者用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn); 不符合正態(tài)分布者以中值(最小值，最大值)表示, 2組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn); 所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料比較分析

G組口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)1 h血糖、口服OGTT 2 h血糖水平高于N組，年齡、BMI大于N組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); 2組孕周、身高、體質(zhì)量、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、甘油三酯、總膽固醇比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。D組空腹血糖水平高于A組，體質(zhì)量、BMI大于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01); 2組年齡、身高、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、總膽固醇水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 G組與N組臨床資料比較分析

表2 D組與A組臨床資料比較分析

2.2 樣本OTU統(tǒng)計(jì)分析

G組與N組共33個(gè)樣本中獲得2 536 388條有效原始序列，每個(gè)樣本平均76 860條序列，平均序列利用率為97.86%, 所有序列按照97.00%的相似性水平聚類，總共得到665個(gè)OTUs。D組與A組共28個(gè)樣本中獲得2 097 298條有效原始序列，每個(gè)樣本平均74 903條序列，平均序列利用率為99.19%, 樣本序列按照97.00%的相似性水平聚類，總共得到686個(gè)OTUs。

G組與N組共有的OTUs數(shù)目為523個(gè)，表明2組樣本相似性較高, G組特有的OTUs數(shù)目為69個(gè), N組特有的OTUs數(shù)目為73個(gè)，表明2組物種豐度存在差異; 其中，與N組相比, G組樣本的OTU數(shù)目偏少，說明GDM孕婦的物種豐度略低于健康孕婦(圖1A)。D組與A組共有的OTUs數(shù)目為461個(gè)，表明2組樣本相似性較高, D組特有的OTUs為70個(gè), A組特有的OTUs為155個(gè)，表明2組物種豐度存在差異；與A組相比, D組樣本的OTU數(shù)目較少，說明T2DM患者的物種豐度低于健康女性(圖1B)。

A: G組和N組OTU分布Venn圖; B: D組與A組OTU分布Venn圖。G代表GDM孕婦, N代表健康孕婦; D代表T2DM患者, A代表健康女性。不同顏色代表不同的組,重疊部分為2組共有的OTUs,非重疊部分為各組特有的OTUs。圖1 G組和N組、D組與A組OTU分布Venn圖

2.3 腸道菌群多樣性分析

2.3.1 Alpha多樣性分析: 對(duì)G組與N組、D組與A組的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示, G組、N組、D組、A組的Observed species指數(shù)分別為(232.53±55.42)、(221.72±58.16)、(174.86±63.40)、(239.64±73.04); G組、N組、D組、A組的Shannon指數(shù)分別為(3.53±0.44)、(3.47±0.56)、(2.66±0.63)、(3.00±0.61)。

G組與N組的Observed species指數(shù)、Shannon指數(shù)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明GDM孕婦與健康孕婦的腸道菌群Alpha多樣性無顯著差異。D組Observed species指數(shù)水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 表明T2DM患者腸道中菌群的豐富度低于健康女性。D組與A組的Shannon指數(shù)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 表明T2DM患者與健康女性的腸道菌群多樣性無顯著差異。見圖2。

A: G組與N組Alpha多樣性分析; B: D組與A組Alpha多樣性分析。G代表GDM孕婦, N代表健康孕婦; D代表T2DM患者, A代表健康女性。Observed species指數(shù)反映群落中物種的豐富度, Shannon指數(shù)反映群落中物種的多樣性。圖2 G組與N組、D組與A組Alpha多樣性分析

2.3.2 Beta多樣性分析: 對(duì)G組與N組、D組與A組的Beta多樣性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示, G組和N組的腸道菌群各自聚集，區(qū)分良好，表明GDM孕婦與正常孕婦的菌群組成結(jié)構(gòu)存在著差異(見圖3A)。D組和A組的腸道菌群各自聚集，區(qū)分良好，表明T2DM患者與健康女性的菌群組成結(jié)構(gòu)存在著差異(見圖3B)。

2.4 腸道菌群結(jié)構(gòu)分析

G組和N組中共檢測(cè)出11種細(xì)菌門類，包括厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)等。2組主要由厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)組成(見圖4A)。對(duì)G組與N組的門水平物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示, G組與N組相比，厚壁菌門(Firmicutes)的豐度升高，擬桿菌門(Bacteroidetes)的豐度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

D組和A組中共檢測(cè)出12種細(xì)菌門類，包括擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)、梭桿菌門(Fusobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)等, 2組主要由擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)、變形菌門(Proteobacteria)組成(見圖4B)。對(duì)D組與A組的門水平物種豐度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示, D組與A組相比，變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)的豐度均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

A: G組與N組PLS-DA分析; B: D組與A組PLS-DA分析。G代表GDM孕婦, N代表健康孕婦; D代表T2DM患者, A代表健康女性。橫縱坐標(biāo)表示相對(duì)距離,無實(shí)際意義,一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)樣本,大卵圓形表示G組與N組、D組與A組的腸道菌群各自聚集,區(qū)分良好。圖3 G組與N組、D組與A組PLS-DA分析

A: G組與N組物種豐度柱狀圖; B: D組與A組物種豐度柱狀圖。G代表GDM孕婦, N代表健康孕婦; D代表T2DM患者, A代表健康女性。橫坐標(biāo)表示樣本名稱,縱坐標(biāo)表示注釋到的物種相對(duì)豐度,右側(cè)不同顏色表示不同的物種,所有樣品中豐度均小于0.5%的物種全部合并成其他。圖4 G組與N組、D組與A組物種豐度柱狀圖

2.5 腸道菌群差異分析

LEfSe分析發(fā)現(xiàn), G組與N組的腸道菌群區(qū)分良好，提示GDM孕婦與健康孕婦菌群結(jié)構(gòu)明顯不同(見圖5A)。LDA分析結(jié)果顯示，厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱(Clostridia)、梭菌目(Clostridiales)、擬桿菌綱(Bacteroidia)、擬桿菌目(Bacteroidales)、擬桿菌屬(Bacteroides)、毛螺菌屬(Lachnobacterium)在2組中存在顯著差異; 其中，在屬水平上, G組與N組相比，毛螺菌屬(Lachnobacterium)的豐度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

LEfSe分析發(fā)現(xiàn), D組與A組的腸道菌群區(qū)分良好，提示T2DM患者與健康女性菌群結(jié)構(gòu)明顯不同(見圖5B)。LDA分析結(jié)果顯示，氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)、考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)、瘤胃球菌科(Ruminococcaceae)、毛螺菌屬(Lachnospiraceae)、羅氏菌屬(Roseburia)、乳桿菌目(Lactobacillales)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)等49個(gè)菌群在2組中存在顯著差異; 其中，在屬水平上, D組與A組相比，考拉桿菌屬(Phascolarctobacterium)的豐度升高，羅氏菌屬(Roseburia)、蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)等產(chǎn)丁酸鹽細(xì)菌豐度降低，鏈球菌屬(Streptococcus)、放線菌屬(Actinomyces)、糞球菌屬(Coprococcus)、變形桿菌屬(Proteus)等人體共生菌豐度降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), 但P值經(jīng)過FDR校正后，發(fā)現(xiàn)只有鏈球菌屬(Streptococcus)、放線菌屬(Actinomyces)仍具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

A: G組L與N組LEfSe分析聚類圖; B: D組與A組LEfSe分析聚類圖。G代表GDM孕婦, N代表健康孕婦; D代表T2DM患者, A代表健康女性。圖中從內(nèi)到外5個(gè)圈依次是門、納、目、科、屬水平的物種。不同顏色表示不同分組,與分組相同顏色的節(jié)點(diǎn)表示在該分組中起到重要作用的微生物群,一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)菌群。其中,黃色節(jié)點(diǎn)表示的是在不同分組中沒有起到重要作用的微生物類群。圖5 G組L與N組、D組與A組LEfSe分析聚類圖

3 討 論

女性孕期體內(nèi)會(huì)發(fā)生激素、免疫、代謝等方面的變化，在孕晚期容易出現(xiàn)胰島素敏感性降低[9]，相應(yīng)的腸道菌群也會(huì)發(fā)生顯著改變[10]。目前，研究[6]顯示腸道菌群在驅(qū)動(dòng)代謝性疾病方面發(fā)揮重要作用，包括肥胖、T2DM。一項(xiàng)研究[11]發(fā)現(xiàn), GDM孕婦的菌群豐度低于健康孕婦，而Alpha多樣性高于正常孕婦, GDM孕婦腸道中厚壁菌門、毛螺菌屬等水平升高，擬桿菌門、薩特氏菌屬水平降低，厚壁菌門/擬桿菌門(F/B)比值升高，與本研究結(jié)果有相似之處。本研究中，與健康孕婦相比, GDM孕婦的腸道菌群豐度下降, Alpha多樣性無差異，這可能與孕周不同有關(guān)。前者孕周在28周之后，本研究孕周在24～28周。研究[12]發(fā)現(xiàn)，孕婦孕晚期的腸道菌群Alpha多樣性較孕中期增加。

厚壁菌門和擬桿菌門是人體腸道菌群中的優(yōu)勢(shì)菌門，兩者通過調(diào)控脂肪及膽汁酸等代謝通路，維持機(jī)體的能量平衡[13]。厚壁菌門被稱為“肥胖細(xì)菌”，在肥胖人群中明顯富集[14], 擬桿菌門剛好相反。因此，可以推測(cè)GDM孕婦腸道內(nèi)菌群比例在高脂飲食誘導(dǎo)下發(fā)生紊亂，促進(jìn)厚壁菌門的生長，抑制擬桿菌門的生長，導(dǎo)致機(jī)體從食物中吸收大量的能量并儲(chǔ)備起來，引起肥胖、胰島素抵抗、血糖升高等。因此，該比值的研究成果提示腸道菌群在未來有望成為預(yù)測(cè)GDM發(fā)病的生物標(biāo)志。毛螺菌屬可通過分解膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs), SCFAs可以為宿主細(xì)胞提供能量，維持腸上皮細(xì)胞完整性、抑制炎癥和調(diào)節(jié)腸黏膜免疫[15]。該菌屬在GDM孕婦中減少，無法給腸道細(xì)胞提供足夠的能量，抗腸道炎癥作用被削弱，引起腸黏膜屏障破壞、有害菌及炎癥因子入血，誘發(fā)GDM孕婦體內(nèi)慢性低度炎癥反應(yīng)，損害胰島β細(xì)胞及其他臟器，導(dǎo)致胰島素分泌受限、胰島素抵抗。因此，產(chǎn)SCFAs類有益菌有望成為臨床上治療GDM的新方法。

在正常情況下，腸道內(nèi)各菌群處于動(dòng)態(tài)平衡中，對(duì)維持腸黏膜屏障完整性和調(diào)控機(jī)體免疫、代謝等方面具有重要的意義[16]。當(dāng)高脂飲食等引起腸道菌群結(jié)構(gòu)紊亂時(shí)，腸道中革蘭氏陰性菌增多，其外膜的主要成分脂多糖(LPS)在細(xì)菌裂解后被大量釋放。高脂飲食可破壞腸黏膜屏障，促使大量LPS透過腸屏障入血，作用于免疫細(xì)胞表面Toll樣受體，誘發(fā)機(jī)體低度代謝性炎癥反應(yīng)，損害胰島β細(xì)胞及其他臟器，導(dǎo)致胰島素分泌受限和胰島素抵抗，最終發(fā)展為糖尿病[6]。相關(guān)研究[17-18]發(fā)現(xiàn), T2DM患者變形菌門豐度明顯升高。本研究結(jié)果顯示，變形菌門豐度在T2DM患者中降低，這可能與不同的測(cè)序方法、性別、種族、年齡等因素有關(guān)。研究[19]發(fā)現(xiàn), T2DM患者血液中炎性細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(CRP)等升高，提示腸道菌群紊亂引起的“代謝性內(nèi)毒素血癥”可能是導(dǎo)致T2DM的重要環(huán)節(jié)。

羅氏菌屬、蘇黎世桿菌屬是目前已知的產(chǎn)丁酸細(xì)菌, QIN J J等[17]發(fā)現(xiàn), T2DM患者中羅氏菌屬(Roseburia)的豐度降低，該菌屬與血糖濃度呈負(fù)相關(guān)，接近顯著水平(P=0.06)。KARLSSON F H等[20]發(fā)現(xiàn)，該菌屬與改善胰島素敏感性有關(guān)，可較好地識(shí)別出T2DM患者和糖耐量異常群體。研究[21-22]發(fā)現(xiàn)，高豐度的考拉桿菌與胃腸健康、高胰島素敏感性和減少全身炎癥有關(guān)，該菌屬在本研究T2DM患者腸道中富集，可能受該類患者主觀上限制碳水化合物攝入的影響，其與碳水化合物攝入量有關(guān)，被認(rèn)為是有前景的碳水化合物攝入量的生物標(biāo)志物[23]。健康的腸道菌群表現(xiàn)為菌群數(shù)量豐富，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且穩(wěn)定，對(duì)外界環(huán)境壓力具有強(qiáng)大的抵抗力，反之，則表現(xiàn)為腸道菌群豐度及多樣性降低、有益菌比例相對(duì)下降、致病菌比例相對(duì)升高、菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈變化以及對(duì)外環(huán)境壓力的抵抗力喪失[24]。本研究中, T2DM患者的菌屬OTU豐度、物種豐富度以及數(shù)十個(gè)菌屬的數(shù)量均比健康女性低，表明T2DM患者腸道中的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈改變。因此，未來可能通過調(diào)節(jié)腸道菌群進(jìn)而實(shí)現(xiàn)治療T2DM。

綜上所述，與健康女性相比, GDM孕婦和T2DM患者的腸道菌群發(fā)生明顯改變，該研究成果可為未來在臨床嘗試應(yīng)用腸道微生態(tài)制劑治療GDM和T2DM提供參考依據(jù)。