復方甘菊利多卡因凝膠對大鼠皮膚創面愈合的影響

謝振年, 安曉靜, 周海洋, 王芳麗, 王立平

(中國中醫科學院西苑醫院, 1. 肛腸外科, 2. 病理科, 北京, 100091;. 中國人民解放軍空軍特色醫學中心 普外科, 北京, 100142;4. 航天中心醫院 普外科, 北京, 100049; 5. 北京豐益肛腸醫院, 北京, 100000)

創面修復包括機體自身組織的再生、修復、重建以及后期的人為干預，影響因素較多，易引發局部和全身感染[1]。創面的愈合，尤其是外科術后的創面修復一直是困擾臨床醫生的難題。復方甘菊利多卡因凝膠(簡稱甘美達凝膠)的主要成分為鹽酸利多卡因和洋甘菊花酊，其對口腔炎癥與疼痛具有顯著的療效，但關于其在外科手術創面愈合中作用的研究仍較少[2-5]。本研究建立皮膚創面大鼠動物模型，觀察甘美達凝膠對創面修復的效果，并探討其作用機制，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

SD大鼠18只[北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證號為SCXK(京)2019-0008], 體質量180～220 g, 性別相同。飼養條件為自由進食和飲水，室溫20 ℃, 相對濕度約50 ℃。皮膚創面模型建成后，將18只大鼠隨機分為實驗組(甘美達凝膠)、陽性藥組(多黏菌素B)和模型組(生理鹽水沖洗)。治療時間觀察點分別為治療7、14 d時, 7 d時每組為6只, 14 d時每組為3只。

1.2 主要藥物及試劑

復方甘菊利多卡因凝膠(Kamistad, STADA Consumer Health Deutschland GmbH), 復方多黏菌素B軟膏(孚諾，浙江孚諾醫藥股份有限公司)，生理鹽水。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)和白細胞介素-1β(IL-1β)酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(Fankew, Shanghai FANKEL Industrial Co.,Ltd)。

1.3 建立皮膚創面模型

采用10%水合氯醛對大鼠進行麻醉，劑量為30 mg/kg。將大鼠背部脫毛消毒，備皮面積為2 cm×2 cm。將大鼠麻醉后固定于手術臺上，在背部脊柱一側頭尾兩端平行于脊柱標記1個圓形切口，用手術刀沿標記線切除全層皮膚至深筋膜，形成創面。

1.4 治療過程

創面模型形成后，實驗組、陽性藥組和模型組分別在局部涂抹藥物，每天2次。模型組采用生理鹽水沖洗潰瘍面。分別在治療1、7、14 d時記錄創面愈合情況，并用游標卡尺測量潰瘍直徑。

1.5 觀察指標

分別于治療7、14 d時將各組大鼠脫頸處死，切除潰瘍組織，分為2塊，其中一塊置于-80 ℃冰箱凍存，留待TNF-α、IL-6和IL-1β檢測使用; 另一塊放入10%甲醛溶液中固定24 h, 行常規脫水、包埋、切片，采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察創面的組織病理變化和免疫組織化學染色結果。采用ELISA試劑盒檢測創面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量，方法參照試劑盒說明書。

1.6 統計學方法

2 結 果

2.1 各組大鼠治療7、14 d時創面愈合情況

各組大鼠建模時潰瘍面積基本一致(圖1)。治療7 d時，實驗組、陽性藥組創面均較模型組縮小，但差異無統計學意義(P>0.05); 治療14 d時，陽性藥組創面仍大于模型組，但差異也無統計學意義(P>0.05)。見表1。

圖1 各組大鼠建模時潰瘍面積比較

表1 各組大鼠不同時點皮膚創面橫徑比較 cm

2.2 各組大鼠創面的組織形態學觀察

治療7 d時，模型組創面組織中可見明顯的炎性滲出層，肉芽組織水腫，毛細血管豐富且擴張，充血明顯，大量炎癥細胞浸潤; 與模型組相比，實驗組、陽性藥組炎性滲出層明顯變薄或消失，肉芽組織水腫減輕，毛細血管密度減少且擴張不明顯，炎癥細胞密度減少，同時可見較明顯的成纖維細胞出現。見圖2。

治療14 d時，模型組創面仍可見少量炎性滲出，但肉芽組織中血管數量明顯減少，擴張不明顯，炎癥細胞數量減少，成纖維細胞增加并可見膠原形成; 與模型組相比，實驗組血管減少更加明顯且呈閉塞狀態，炎癥細胞數量明顯減少，成纖維細胞數量明顯增加，膠原排列有序; 與模型組相比，陽性藥組創面有改善，但炎癥細胞數量和血管密度仍略多。見圖3。

2.3 各組創面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達

治療7 d時，實驗組大鼠創面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平均低于模型組、陽性藥組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。治療14 d時，實驗組大鼠創面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達水平仍低于模型組，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

A、D: 模型組創面組織形態學可見較厚的炎性滲出層,肉芽組織中血管豐富,炎癥細胞密度較大; B、E: 實驗組創面組織形態學可見炎性滲出層較薄,肉芽組織中血管減少,炎癥細胞密度降低,成纖維細胞增多; C、F: 陽性藥組創面組織形態學可見肉芽組織的成熟度低于實驗組。A、B、C放大倍數為40倍, D、E、F放大倍數為400倍。圖2 治療7 d時各組大鼠創面的組織形態學HE染色情況

A、D: 模型組創面組織形態學可見肉芽組織中血管狹長,炎癥細胞密度降低,成纖維細胞和膠原出現; B、E: 實驗組創面組織形態學可見血管數量明顯減少,成纖維細胞核膠原較模型組增多; C、F: 陽性藥組創面組織形態學可見肉芽組織成熟度低于實驗組。A、B、C放大倍數為40倍,D、E、F放大倍數為400倍。圖3 治療14 d時各組大鼠創面的組織形態學HE染色情況

表2 各組大鼠不同時點創面組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的表達 ng/mg

2.4 各組創面組織中膠原含量的苦味酸-天狼猩紅染色情況

采用苦味酸-天狼猩紅染色分析創面組織中膠原含量的變化，治療7、14 d時，實驗組創面組織中的膠原含量均高于模型組，且膠原較為粗大，見圖4。

圖4 各組治療7、14 d時創面組織中膠原含量的苦味酸-天狼猩紅染色比較(偏振光觀察,放大倍數100倍)

2.5 各組創面組織的免疫組織化學染色情況

本研究以灰度值表示免疫組化的表達, CCR7/CD68表示經典活化(M1)型巨噬細胞的比例, CD163/CD68表示替代活化(M2)型巨噬細胞的比例，結果以累積光密度(IOD)表示。結果顯示，治療7、14 d時，各組M1型和M2型巨噬細胞的比例差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠不同時點創面組織中CCR7/CD68和CD163/CD68的表達 IOD

3 討 論

皮膚創面的愈合一般需要經過凝血期、炎癥期、增殖期和重塑期。在創面形成初期，毛細血管內的血液流入創面，與其他生物學分子形成凝血塊覆蓋于創面表面; 炎癥期時，中性粒細胞在創面聚集并開始吞噬病原體等微生物，發揮清除作用; 在損傷后48～72 h, 巨噬細胞開始發揮吞噬功能，隨著創面愈合的過程，巨噬細胞的表型也發生相應的改變，為成纖維細胞提供大量的生物因子; 在創傷后72 h, 炎癥因子也會被招募至創面發揮相應的作用，伴隨大量肉芽組織形成，成纖維細胞開始遷移，膠原逐漸增多[6]。

肛腸疾病手術后病原微生物的控制尤為重要，這是因為肛腸術后的創面多為開放性創面，加之糞便的殘留和刺激，極易受細菌感染，導致傷口愈合緩慢。目前，促進創面愈合的方法有很多，包括各種敷料、組織工程皮膚、生長因子、干細胞治療、天然藥物和復方藥物等，其中綜合應用多種方法是臨床常用的選擇。甘美達凝膠是一種復方外用凝膠，其主要成分為洋甘菊花酊、鹽酸利多卡因。洋甘菊花酊是甘美達凝膠的主要成分，具有抗炎、促進傷口愈合的作用，已被證實對多種細菌，尤其是金黃色葡萄球菌具有明顯的抑制作用[7-8]; 鹽酸利多卡因的主要作用是阻斷痛覺傳入的產生和傳導，具有快速的止痛作用，且局部應用不影響手術創面愈合[9]。本實驗以大鼠皮膚創面模型為研究對象，治療7、14 d時，病理形態學顯示采用甘美達凝膠的實驗組創面炎性滲出層消退時間提前，肉芽組織更早進入成熟期，膠原含量也明顯增多; 創面縮小的差異無統計學意義可能與觀察時間偏短有關。

TNF-α是一種促炎癥細胞因子，主要參與機體的炎癥反應和免疫反應，可以激活中性粒細胞，增強其吞噬能力，也可以促進巨噬細胞的活化[10]。IL-6和IL-1β也是重要的促炎癥介質，在全身性感染的發生發展中起著重要的作用，是啟動炎癥反應的因子，可以觸發炎性反應瀑布效應[11]。研究[12]表明，炎癥因子含量過高不僅可以導致潰瘍組織的炎癥反應，還會抑制創面的愈合，降低炎癥因子的水平，進而促進潰瘍的愈合。本實驗采用ELISA法檢測不同時點創面組織中炎癥因子的含量，在用藥7 d時，采用甘美達凝膠的實驗組創面組織中炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-1β均較模型組顯著降低，但在用藥14 d時差異無統計學意義，說明甘美達凝膠在創面早期抗炎治療中可以發揮重要的作用，可以促使肉芽組織更趨于成熟，推測可能與炎癥因子水平的控制有關。

巨噬細胞是由外周血中的單核細胞分化而來，是機體重要的免疫細胞，具有吞噬、殺傷病原微生物的功能，也可以分泌炎性因子或細胞因子來調節機體的免疫反應，參與組織的修復[13-14]。在不同的微環境中，巨噬細胞可以分化為M1型和M2型, M1型主要發揮抗原提呈、吞噬殺滅病原微生物的作用, M2型則可抑制局部炎癥反應，促進組織的再生修復和創面的愈合[15]。有研究[16]認為巨噬細胞可以促進創面愈合，也有研究[17]認為巨噬細胞只是引發了炎癥反應，并不利于創面愈合。本研究結果顯示，在創面形成后7、14 d, 各組創面組織中的巨噬細胞數量差異無統計學意義，表型也無明顯變化。

綜上所述，甘美達凝膠對皮膚創面具有較好的抗炎和促進愈合的作用，創傷早期抑制炎癥因子釋放可能是其主要作用機制之一。