基于手機的便攜式藻類顯微與智能識別系統研究*

蘇 昂孫鳳云魯子鵬張季儒王昭玉高 瑞*劉 劍*

(1.山東大學控制科學與工程學院生物醫學工程研究所，山東 濟南 250061；2.齊魯工業大學(山東省科學院)，山東省科學院海洋儀器儀表研究所，山東 青島 266001)

微型藻類是水體的重要組成部分和水質評價的重要指標[1-2]。水中氮、磷等元素的超標會造成微型藻類爆發性繁殖，從而形成水華、赤潮等水體自然災害[3]。不同微藻類群的時空分布特征、所產生的危害以及所形成水華的治理方法都具有顯著差異性[4]，因此微藻監測對水華的研究和治理具有十分重要的意義。

微藻檢測主要分為宏觀檢測和微觀檢測，宏觀檢測有無人機或衛星遙感檢測[5-6]、熒光檢測[7]，利用遙感或熒光監測水華，只能監測總體微藻密度，難以研究水體中微藻種類構成以及特定藻類密度。微觀檢測包括傳統顯微鏡檢測[8]、流式細胞儀檢測[9]和基因檢測[10]。傳統顯微鏡檢測和流式細胞儀檢測可以精確檢測特定種類微藻并分析水體中藻種構成，但是都存在檢測成本高，相關設備體積大難以實現微藻現場檢測等問題[11]。基因檢測耗時較長，無法實現微藻的實時監測[12]。目前現場檢測微藻主要以檢測胡蘿卜素和葉綠素為主，但是僅能檢測總體的藻類含量，不能判斷藻類種屬和觀察微藻形態[13]。因此研發一種既能開展現場藻類種屬檢測又能觀察細節形態的便攜式藻類檢測儀對海洋、湖泊、河流等水域的富營養化研究與治理有重要意義。

本文設計了一種基于手機的便攜式藻類顯微與智能識別系統，可拍攝微藻顯微圖片，分辨率達2 μm，基于手機內置的微藻檢測APP可實現微藻種類識別并計算密度。整體設備尺寸為156 mm×84 mm×52 mm，總重量為550 g。基于普通智能手機平臺，直接取自然水樣檢測，簡單便攜，檢測成本低，可實現特定種類微藻的現場檢測以及水華發展過程的監測，為水華的預警、監測以及相關研究提供重要的技術支持。

1 系統設計

1.1 便攜式顯微鏡結構設計

便攜式顯微鏡由鏡架，透鏡，電源和光源四部分組成，采用單透鏡結合智能手機相機成像，顯微鏡結構如圖1(a)所示。玻片座內置LED燈作為光源，光線由透光孔發出，透過玻片經過球形透鏡和手機鏡頭放大，在手機相機中成像。玻片座套在調焦螺栓上與調焦盤配合實現調焦。球形透鏡可分為50倍鏡、100倍鏡、200倍鏡三種。其中200倍鏡分辨率為2 μm，結合手機相機，可將微藻清晰放大200倍至1 000倍。顯微鏡實物圖如圖1(b)所示，圖中左上角為顯微鏡放大倍數為400倍時拍攝的刻度玻片視場圖，圖中白色標注為100 μm。

圖1 便攜式手機顯微鏡爆炸圖及實物圖

1.2 藻類智能識別APP的設計

當前研究中一般使用細胞計數板計數進而計算微藻密度，不僅工作量大、對識別人員專業能力要求高而且容易造成視覺疲勞降低準確度。本系統采用深度學習算法對顯微鏡拍攝圖像中的藻類進行識別并計數。利用深度學習模型的研究一般在PC端完成[14]，降低了系統的便攜性，影響現場檢測的實現。本文在手機端開發了基于yolov5深度學習模型的微藻檢測APP，通過APP可以調用手機相機拍攝顯微照片，或查看已拍攝的微藻照片進行識別計數，檢測結果保存在數據庫中。

基于智能手機搭建系統可以更好地做到微型化，提高系統的便攜性，便于開展現場檢測。同時可以依托智能手機成熟的軟件開發系統開發配套APP，實現數據的存儲和處理，做到顯微拍攝和數據處理的一體化。智能手機不僅作為上位機進行數據處理，而且是成像系統的重要組成部分。

1.3 微藻密度檢測原理

制作玻片時取5 μL水樣均勻分布于18 mm×18 mm的范圍內，所以水樣中微藻密度計算公式如下:

式中:N為視場可見藻類數量，S1為水樣分布面積，S2為視場面積，P為水樣中藻類密度。

檢測水樣時應先通過預檢測估計水樣中微藻密度，然后經過離心或稀釋處理保證檢測時微藻密度在系統可檢測范圍內。測量微藻密度時，每一次樣本觀察共拍攝10張顯微照片并使用深度學習模型進行識別，為減小誤差去掉兩個濃度最低值和兩個濃度最高值，取剩余6組結果平均值作為檢測結果并記錄。

2 實驗與結果

2.1 實驗材料及設備

為驗證微藻檢測系統的實用性和現場檢測能力，本文開展了水華模擬實驗，在敞口玻璃器皿中，加入取自野外的河水，并養有水生植物和小型觀賞魚類。利用水生植物、魚類、水中微藻等在玻璃器皿中組成一個小型生態水體系統，用來模擬自然界中的水環境。通過人為調控水體的富營養化程度，模擬自然水域中水華的形成過程。在對水樣鏡檢時發現玻璃器皿中優勢藻種為羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum)并且其他藻種極其稀少，因此以羊角月牙藻為水樣中目標藻類，觀察月牙藻的增殖情況和密度變化。

羊角月牙藻為月牙型單細胞藻，大小約為2 μm×20 μm，當使用200倍球形透鏡和2倍手機攝像頭組合時即總體放大倍數為400倍時觀察效果較好，所以在以羊角月牙藻為研究對象時，均以上述透鏡組合進行觀察。放大倍數為400倍時顯微鏡視場范圍為一直徑0.3 mm的圓。

實驗中所用主要設備為尼康E200生物顯微鏡、XB-K-25型血球計數板(上海求精公司)、XK-400型離心機(江蘇新康公司)。

2.2 微藻識別深度學習模型

經過一個月的培養，使用便攜式顯微鏡鏡檢水樣時拍攝了月牙藻不同密度下顯微圖像共750副，去掉7副成像質量差的圖像，共743張月牙藻顯微照片作為深度學習模型數據集。人工標注后，通過程序按照9∶1的比例將數據集分為訓練集和測試集。訓練網絡選用yolov5l，迭代周期300輪。訓練結束后，得到的最優模型精確率(Precision)為0.94，召回率(Recall)為0.99，mAP0.5為0.99，訓練結果如圖2所示。

圖2 目標識別模型訓練結果

mAP0.5表示當置信閾值為0.5時多類別平均精度的平均值，由于本研究中僅有月牙藻一個類別，因此mAP0.5的值等于平均精度(Average Precision，AP)，通過式(2)計算平均精度

式中:p表示精確率(Precision)，r表示召回率(Recall)，此時AP的值等于置信閾值為0.5時，Precision-Recall曲線下方所構成區域的面積。精確率、召回率的計算公式分別如下:

式中:TP表示正確的目標被正確識別為目標區域的數量，FP表示非正確的目標被錯誤識別為目標區域的數量，FN表示正確的目標被錯誤地識別為背景區域的數量。由上述可知，精確率、召回率和mAP0.5的值越接近于1，表示所訓練模型的識別效果越好。

將最優模型部署到微藻檢測APP中，微藻識別及微藻密度檢測界面如圖3所示。當系統檢測出圖像中的目標藻類時，用檢測框標出微藻并顯示相對應的置信值和標簽，以標簽“sc”代表月牙藻。檢測結果頁面上方為NMS及Threshold調節按鈕，NMS(Non-maximum suppression)為非極大抑制，其目的是為了消除多余的檢測框，找到最佳的物體檢測位置，實驗顯示當NMS為0.7時效果較好。Threshold表示置信閾值，當目標框置信值大于設定值時，該目標判定為正確目標。本實驗所訓練模型檢測Threshold為0.5時，效果較好。

圖3 手機APP識別月牙藻并計算其密度

2.3 微藻密度梯度實驗

為驗證本系統檢測微藻的可靠性，本文開展了微藻密度梯度試驗，首先配置四種藻液，標號為A、B、C、D。分別使用傳統的顯微鏡計數法和所研制的便攜式智能微藻檢測系統對四種藻液進行檢測，獲得月牙藻密度。顯微鏡計數法是將經過適當稀釋的藻液放在血球計數板載玻片與蓋玻片之間的計數室中，在顯微鏡下進行計數。由于計數室的容積是一定的(0.1 mm3)，所以可以根據在顯微鏡下觀察到的微藻數目來換算成單位體積內的微藻總數目。實驗中所用顯微鏡為尼康E200生物顯微鏡，血球計數板為XB-K-25型血球計數板(上海求精)。配置高濃度藻液時使用XK-400型離心機(江蘇新康公司)進行離心處理。

測量結果如圖4(a)所示，月牙藻在104個/mL～107個/mL范圍內，傳統顯微鏡計數法和本便攜式檢測系統測量結果的相對誤差分別為3.03%、2.64%、4.08%、0.84%。同時針對一個數量級范圍內的藻液，實驗配制五種不同密度梯度，使用兩種方法分別對其進行測量，結果如圖4(b)所示，月牙藻在2.2×106個/mL～12.1×106個/mL范圍內，便攜式顯微鏡視場可見微藻數量與微藻密度有較好的線性相關性，擬合直線的R2為0.979 18。

圖4 微藻密度梯度實驗結果

2.4 水華監測實驗

培養玻璃器皿放在陽臺，人為調控，加速水體的富營養化進程。每隔3 d～4 d選取光照正常日拍攝水體外觀圖，并取水樣在微藻檢測系統下進行檢測，記錄實驗數據。每次取上、中、下層水樣各0.5 mL，共1.5 mL水樣，使藻液均勻混合。取5 μL藻液制成玻片放便攜式顯微鏡下鏡檢。根據視野中藻類分布情況每次拍攝10張不同視場區域的月牙藻顯微照片作為鏡檢數據保存。水華監測數據如圖5所示。

圖5 水華模擬實驗

在水華模擬實驗中，由于隨季節變化會出現溫度的較大幅度改變，實驗中監測到兩次水華的發展過程。第一次為春季水華，發生在3月上旬至四月初，共28 d，水溫變化為(19±2)℃；第二次為夏季水華，發生在五月中旬至六月中旬，共28 d，水溫變化為(25±2)℃。取樣日水溫數據記錄如表1所示。

表1 春、夏季水溫對比及取樣日水溫變化

如圖5所示，春季時培養皿中水華爆發，呈現先增長后衰退的現象，由于人為調控導致水體富營養化加劇，月牙藻大量增殖。當月牙藻增殖到臨界點時，此時密度為8.7×106個/mL。由于受到溫度、無機鹽、溶解氧等因素制約以及魚類和微生物捕食活動影響，月牙藻發生死亡，密度降低，其密度變化趨勢與相關研究結果一致[15]。由表1可知，夏季平均水溫比春季高約6.3℃，因此相關酶活性增強，月牙藻生命活動更活躍，開始增殖形成夏季水華，水華發展趨勢與春季一致。由于此時溫度較高，月牙藻數量臨界值更高為16.5×106個/mL，超過臨界值后密度出現降低至11.9×106個/mL，但仍高于春季時的臨界密度值。圖5中所示水體外觀圖與微藻檢測系統檢測結果相一致，水體外觀圖右上角為對應的便攜式顯微鏡視場照片。同時由圖5可知，夏季增殖線斜率為0.49，而春季增殖線斜率為0.2，由于微藻生命活動更活躍，夏季微藻增殖速率高于春季，此現象符合有關水華的研究結果[16]。由水華模擬實驗可知，微藻檢測系統可以完成對水華發展過程的監測，預警水華爆發，并且具備對水體的現場檢測能力。

3 結論與展望

本文開發了基于智能手機的便攜式微藻檢測系統，并且通過微藻密度梯度實驗和水華模擬實驗，與傳統顯微鏡檢測結果對比，驗證了微藻檢測系統的可靠性和現場檢測能力，實驗結果說明該系統可以高效、快速地測量目標微藻濃度并實時監測水華發展。但是由于自然界水華發展周期長，發展狀況及速率難以人為控制，所以本文僅在實驗室開展了模擬水華實驗，其準確度和功能還應結合自然水域檢測實驗進一步驗證和改進。同時還應開展多藻類水華實驗，建立多種微藻數據庫，訓練相關目標識別模型，驗證該系統對多種微藻的識別及密度測量功能。