氧化應激在急性肝損傷中的作用

廖 月， 何毅懷， 羅亞文

遵義醫科大學附屬醫院 感染科， 貴州 遵義 563000

急性肝損傷是指既往肝功能正常的患者在6個月內出現肝生化指標快速改變，常由病毒感染、酒精、藥物、毒物和代謝異常等原因引起，并存在一定的地域差異，在亞洲國家主要為肝炎病毒感染，在歐洲國家主要為酒精，是臨床常見的危重急癥之一。在急性肝損傷中，肝臟的合成、代謝和排泄功能受損，如果肝細胞功能損傷進一步加重或毒性產物增多，急性肝損傷患者出現黃疸、凝血功能障礙和肝性腦病等，可進展為急性肝功能衰竭[1]。正常情況下，體內氧化系統與抗氧化系統處于動態平衡狀態，當各種因素導致體內活性氧(reactive oxygen species，ROS)與抗氧化劑平衡紊亂，即產生氧化應激[2]。氧化應激參與肝損傷的發生和發展，被認為是急慢性肝臟疾病的病理生理基礎，并與肝癌的發生密切相關[3]。急性肝損傷會引起細胞內的各種應激反應(代謝應激、氧化應激及內質網應激等)，而同樣，持續應激將增加肝細胞損傷和死亡的風險，引起炎癥和纖維化等肝臟疾病[4]。氧化應激可激活炎癥反應和抗氧化反應，在急性肝損傷的發病機制中具有重要作用。

總之，了解氧化應激參與急性肝損傷的發生發展機制對臨床研究和治療至關重要。本文從氧化應激概述、氧化應激與損傷因素、氧化應激與肝損傷相關通路及潛在藥物靶點進行綜述，為了解急性肝損傷時氧化應激作用、影響及臨床藥物對其調控機制提供參考。

1 氧化應激

正常情況下，體內氧化系統與抗氧化系統處于動態平衡。但由于各種原因打破平衡將產生氧化應激，其中主要表現為ROS與抗氧化劑之間的失衡。ROS是含氧的分子，氧來源于O2的不完全還原。ROS主要包括細胞代謝的副產物超氧陰離子(superoxide anion，O2-)、羥基自由基(hydroxyl radical，HO-)、過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)。ROS過多會引起脂質自由基產生過多，如丙二醛(malondialdehyde，MDA)[2]。生理條件下，線粒體中進行氧化磷酸化過程以及合成必需的生物分子，可使ATP向細胞供能。在氧化磷酸化過程中，各種酶催化氧化還原反應并產生ROS。如果各種原因產生過多的ROS，引起氧化應激，出現線粒體功能障礙，最終將導致細胞自噬、壞死和凋亡等[5]。 ROS由還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase，NADPH oxidase，Nox)和黃嘌呤氧化物(xanthine oxide，XO)或線粒體電子泄漏產生。XO催化嘌呤代謝中黃嘌呤和次黃嘌呤的氧化，導致O2-和H2O2的形成[6]。

ROS主要有兩個來源，第一種途徑是隨著還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和還原型黃素腺嘌呤二核苷酸(reduced flavin adenine dinucleotide，FADH2)的氧化磷酸化過程，分子O2在電子傳遞鏈(electron transfer chain，ETC)中被還原成H2O(圖1)。ETC由整合到線粒體內膜的五種蛋白組成，包括復合體Ⅰ(NADH脫氫酶)、復合體 Ⅱ (琥珀酸脫氫酶)、復合體 Ⅲ (細胞色素c還原酶)、復合體 Ⅳ (細胞色素c氧化酶)和復合體 Ⅴ (ATP合酶)。三大營養物質代謝產物經三羧酸循環生成的NADH和FADH2分別經復合體 Ⅰ 和復合體 Ⅱ 線粒體各形成一對電子，復合體 Ⅰ 有4個質子轉運出線粒體內膜，復合體 Ⅱ 不參與質子的轉運。電子轉移到Q循環，泛醌Q被還原為泛醌醇QH2，同時4個質子穿到線粒體內外膜間。QH2在復合體 Ⅲ 被氧化，電子通過細胞色素c轉移到復合體 Ⅳ，分子氧接受電子還原為H2O，將消耗2個質子，因此此處僅2個質子轉移至間隙。在這個過程中因線粒體內外膜之間的質子增多，勢能增加，因此內膜上的線粒體解偶聯蛋白(uncoupling proteins，UCP)將質子泵入線粒體基質，減輕線粒體膜的電勢能。尤其是發生氧化應激時，線粒體會通過上調UCP2的表達以抵抗氧化應激。另一種途徑是線粒體細胞色素催化循環，包括由廣譜有機化合物組成的細胞色素P450酶，如脂質、類固醇和異生素，可產生各種反應副產物，如O2-和H2O2[7-10]。

圖1 線粒體氧化磷酸化生成電子與抗氧化劑清除O2-的簡要示意圖

生理條件下，ROS參與了細胞增殖、免疫調節、應激相關反應信號傳導過程、自噬和炎癥等生理病理過程；而過量的ROS會導致細胞發生氧化應激和引起細胞代謝功能受損，并可通過直接破壞必需的蛋白質、DNA或脂質而直接引起細胞死亡或導致包括炎癥在內的一系列疾病的發生[11]。

肝臟是ROS攻擊的主要器官。肝實質細胞中的線粒體、微粒體和過氧化物酶體等可產生ROS，對于肝臟的正常生理功能十分重要；但肝臟中庫普弗細胞、星狀細胞等對氧化應激相關分子的敏感性更高。因此，當ROS產生過量，將會導致這些細胞迅速作出激活反應。氧化應激能誘導Kupffer細胞產生TNFα等細胞因子而促進細胞炎癥和凋亡；氧化應激引起脂質過氧化從而引起肝星狀細胞增殖和膠原合成，導致肝臟纖維化的發生和進展。總之，ROS水平升高超過生理量而抗氧化系統又不能及時清除時，將導致一系列疾病或癥狀的發生發展。

2 抗氧化系統

抗氧化系統內源性分子包括由酶組成的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidases，GSH-Px)和非酶組成的維生素C、維生素E、尿酸、金屬結合蛋白、多胺、膽紅素、類胡蘿卜素等，維生素E被認為是體內外均有作用，其他非酶成分暫認為是體外有作用[2,12]。抗氧化系統功能減弱將不利于肝臟恢復正常功能。有研究[13]表明，老年小鼠中谷胱甘肽(glutathione，GSH)恢復延遲導致氧化應激延長，抑制肝組織修復和肝細胞增殖，從而使肝損傷不易恢復。GSH是細胞中最豐富的硫醇，能直接與ROS反應。此外，GSH在由GSH-Px催化的反應中參與過氧化物還原，通常與肝損傷有關。肝臟中的抗氧化酶通常易受到各種因素的影響，包括應激、激素以及外源性物質[14]。利用氧化劑與抗氧化劑平衡對機體維持正常生理活動十分重要，而增加抗氧化系統活性已經是抗氧化治療的研究靶點，未來或許有更重要的地位。

3 氧化應激與損傷因素

導致急性肝損傷的常見原因通常也會導致肝細胞氧化應激，如病毒感染(尤其是HBV)、酒精、藥物等(圖2)。若損傷因素持續存在，過度的氧化應激將導致慢性肝病發生，如酒精相關性肝病、非酒精性脂肪性肝炎、纖維化和肝細胞癌等[15]。ROS的增多會引發不同類型的細胞死亡，包括壞死、凋亡、自噬等。因此，在許多肝病中，有效清除ROS、維持細胞氧化還原階段是一條有效途徑[16]。

圖2 損傷因素與氧化應激簡要示意圖

3.1 氧化應激與肝炎病毒

3.1.1 氧化應激與HBV 肝炎病毒感染導致急性肝損傷在亞洲國家十分常見，尤其是HBV，其次為HCV，這兩者均與氧化應激相關[3]。乙型肝炎中的氧化應激發生在多個層面，包括DNA氧化、蛋白質氧化、脂質過氧化以及ROS和活性氮(reactive nitrogen species，RNS)的產生。在慢性HBV感染患者中，氧化應激血清指數(如HO-、O2-、H2O2等)增加，抗氧化劑血清指數(如總巰基、維生素C、尿酸、維生素E、膽紅素等)減少。乙型肝炎感染患者中，隨著疾病轉為慢性，氧化應激增加，抗氧化值降低，提示氧化應激可能與HBV活動有關[17]。有學者[18]通過對296例慢性乙型肝炎患者氧化應激指標進行研究，發現HBV誘發的肝病患者存在氧化應激反應導致的肝損傷，損傷程度與HBV基因型及耐藥性突變相關，提出氧化應激可能與患者HBV進展有關。這表明氧化應激不僅與HBV感染相關的肝病密切相關，且可能與HBV活動有關。因HBV具有強嗜肝性，主要攻擊肝細胞[19]，如果能夠深入探討氧化應激與HBV之間機制的研究，且將抗氧化治療作為乙型肝炎的輔助治療，有望更好阻止HBV導致的急性肝損傷向肝衰竭或慢性肝病的方向發展。

3.1.2 氧化應激與HCV 氧化應激也參與HCV感染的發展，HCV的大多數蛋白都參與氧化應激的誘導[12]。有學者[20]納入40名健康對照者和370例丙型肝炎相關性慢性肝病患者(分為120例血清酶正常的丙型肝炎患者、130例血清酶高的丙型肝炎患者以及120例肝硬化患者)，比較氧化應激標志物MDA、總過氧化物和氧化應激指數(oxidative stress index，OSI)，發現實驗組數據均升高，肝硬化組最高。這表明隨著丙型肝炎相關性慢性肝病程度的加重，氧化應激指標也升高，提示氧化應激參與了丙型肝炎的進展。

不但如此，當丙型肝炎合并其他感染或損傷因素時會加重氧化應激，并且氧化應激指標可能成為檢測或診斷指標。例如，HCV感染患者飲酒過量，酒精在體內通過肝臟中細胞色素P450代謝，將導致ROS產生增多，激活氧化應激，HCV感染加重，肝損傷也將隨之加重[21]。Gravier-Hernández等[22]通過病例對照研究分析了HIV合并HCV感染時氧化還原指標的變化。共納入330例研究對象，分為健康對照組、HIV組和HIV-HCV組，檢測其氧化還原、病毒學等指標，發現HIV-HCV組ROS及總過氧化物等均比健康對照組和HIV組升高，提示HIV-HCV合并感染時氧化應激較單獨感染時重，在治療合并感染時應注意抗氧化應激。由此可見，無論是丙型肝炎單獨作用，還是其他因素聯合作用，均與氧化應激相關，且在多因素作用的情況下，氧化應激加重。深入研究氧化應激和HCV之間的機制，并分析氧化應激與HBV、HCV之間的異同，將來或可在治療病毒性肝炎中更好地運用抗氧化方案。

3.2 氧化應激與酒精性肝病 酒精也可通過激活氧化應激造成急性肝損傷。乙醇過量或中毒直接導致ROS和RNS的產生，從而打破肝細胞內氧化還原反應平衡[23]。Gou等[24]在小鼠3種急性肝損傷模型(分別由高脂乳劑、酒精和CCl4誘導)中發現，甘草總黃酮均可降低實驗組小鼠血清ALT、AST水平及肝臟氧化劑MDA含量，且升高肝臟抗氧化劑SOD和GSH含量。這些結果表明，由酒精誘導的酒精性肝損傷產生了氧化應激，且可被甘草總黃酮抑制或減輕。

不但如此，氧化應激通過多種機制參與酒精性肝病的發展。長期飲酒將導致CYP2E1介導的酒精代謝增加，進而導致MDA、RNS和ROS等升高，這些物質通過脂質和蛋白質過氧化等介導肝損傷。除此之外，ROS也可誘導肝細胞線粒體結構和功能受損[25]。Wan等[26]在乙醇誘導的酒精性肝炎小鼠模型中發現，實驗組小鼠體內MDA升高，反映實驗組小鼠發生氧化應激；而注射TNFα刺激蛋白6(tumor necrosis factor-α-stimulated protein 6，TSG-6)后，與正常對照組小鼠相比，小鼠肝臟GSH顯著增加，氧化應激減輕，TSG-6可以通過調控氧化應激來影響酒精性肝損傷進展。同樣在乙醇誘導的酒精性肝病中，小鼠肝臟蛋白酪氨酸磷酸酶1B (protein-tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)被破壞后，乙醇誘導的損傷和氧化應激反應減輕[27]。以上表明氧化應激通過多種機制參與酒精性肝損傷的發生發展，而通過控制氧化應激可以減輕酒精性肝損傷。

3.3 氧化應激與藥物或毒物性肝損傷 藥物性肝損傷是指由處方藥和非處方藥引起肝功能損害或不良反應，常表現為氧化應激和細胞死亡，嚴重時可導致肝功能永久喪失和死亡[28-29]。部分藥物性肝損傷是由于藥物降低抗氧化劑水平，促進ROS在肝臟中累積和脂質過氧化水平增高而導致[30]。ROS將羰基引入氨基酸側鏈，影響蛋白質的結構和功能；此外，脂質過氧化時，ROS還可能氧化多不飽和脂肪酸。線粒體膜內的脂質過氧化增加了膜滲透性，破壞了細胞膜和細胞器的完整性[14]。例如，CCl4可增加肝臟的氧化應激，導致肝細胞活性下降，抗氧化酶如CAT、SOD、GSH-Px和GSH等水平降低，而氧化應激生物標志物MDA水平增加[31]。在小鼠急性藥物性肝損傷模型中[使用對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，300 mg/kg]，APAP增加了脂質過氧化反應，APAP中毒的小鼠肝組織中酶類抗氧化劑和還原型GSH含量降低。但這種氧化應激可被波爾定堿(boldine)所治療[32]。上述研究表明，藥物在體內過多可引起氧化應激，氧化應激會破壞蛋白質結構和提高脂質過氧化水平加重肝損傷。氧化應激可能是藥物性肝損傷治療的潛在靶點或預防藥物性肝損傷必須考慮的方面。

4 氧化應激與肝損傷相關通路及潛在藥物靶點

4.1 氧化應激與Nrf2 Nrf2具有抗氧化、解毒和保護細胞等作用，90%以上的抗氧化基因受Nrf2調控，且調控主要是在翻譯后水平進行[29, 33]。Nrf2作為抗氧化的重要調節因子，在細胞質內與Kelch 樣品相關蛋白1(Kelch sample related protein-1，Keap1)結合形成復合物。氧化應激發生后，Nrf2和Keap1的復合物解離，Nrf2進入細胞核與抗氧化反應元件(antioxidant response element，ARE)結合，從而促進代謝酶/抗氧化蛋白質酶(CAT、GSH-Px和SOD等)的轉錄激活[34]。Senthil Kumar等[35]利用Lucidone預處理人肝癌細胞HepG2細胞，且使用乙醇刺激細胞誘導氧化應激后，發現Lucidone上調內源性抗氧化血氧合酶1(hemoxygenase-1，HO-1)的表達及激活Nrf2的表達，并且顯著降低了HepG2細胞中MDA、ROS的水平和抗氧化劑GSH的耗竭。因此，提出Nrf2激活可降低細胞中MDA和ROS的水平，且此種效應可被藥物Lucidone加強。此外，Gong等[36]利用乙醇誘導HepG2 C34細胞(不表達CYP2E1，為對照組)與HepG2細胞E47細胞(表達CYP2E1，為實驗組)產生氧化應激，發現Nrf2在E47細胞中被激活，而沉默Nrf2會降低GSH的水平并增加ROS和脂質過氧化，導致E47細胞的活力下降。因此，在酒精性肝損傷中，參與乙醇代謝的CYP2E1水平升高可激活Nrf2，其蛋白質和mRNA水平增加，而發揮抗氧化作用。這表明在酒精性肝損傷中，乙醇代謝使CYP2E1升高，激活Nrf2，Nrf2通過降低ROS和MDA、增加GSH來發揮抗氧化作用，這種作用均發揮在氧化系統與抗氧化系統。由此可見，在酒精性肝損傷中不止一種機制能夠激活Nrf2發揮抗氧化作用。

Nrf2相關通路抗氧化機制不但與酒精代謝引起的肝損傷相關，藥物也可將Nrf2相關通路作為調節氧化應激的潛在靶點。Yu等[37]通過分離小鼠原代肝細胞培養后，利用大豆苷元預干預，脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導氧化應激，發現100 μmol/L大豆苷元上調Nrf2的表達使LPS誘導的ROS產生減少，SOD活性增加，提示大豆苷元可通過調控Nrf2通路來抑制炎癥和氧化應激。類似地，Lv等[38]發現daphnetin在小鼠和HepG2細胞中也可能通過上調Nrf2/Trx-1來減輕氧化應激。Hu等[39]用LPS和D-氨基半乳糖誘導小鼠發生急性肝損傷，并用油酸乙醇酰胺(oleoylethanolamide，OEA)預處理和治療。結果發現OEA預處理降低了肝臟MDA水平，通過上調Nrf2和HO-1增加SOD和GSH-Px水平，上述研究表明，OEA可通過Nrf2相關通路發揮抗炎和抗氧化應激作用，減輕急性肝損傷。Xu等[33]研究發現大豆肽可刺激H2O2誘導的HepG2細胞中Nrf2，激活的Nrf2可上調SOD、CAT和GSH-Px的水平，抑制ROS和MDA生成。上述研究表明，上調Nrf2可在氧化應激和抗氧化應激2個方面抗氧化和保護細胞，減輕肝損傷，可能發揮關鍵作用。

4.2 氧化應激與NF-κB NF-κB是炎性反應和免疫反應的重要調節劑，其家族包括5種亞型：NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)、c-Rel、Rel A(p65)和Rel B，其中Rel A(p65)即NF-κB p65是最重要的轉錄因子[40]。研究[34]表明，NF-κB可以單獨或通過其他通路影響氧化應激，上述的Nrf2的抑制或失活將激活NF-κB的轉錄。Long等[41]使用APAP造成小鼠急性肝損傷后，并用蠶蛹油(Silkworm pupa oil)干預，發現蠶蛹油可以減少肝組織中NF-κB p65的表達，即可以抑制NF-κB p65信號通路，減低MDA水平，升高SOD和GSH-Px活性，從而減輕急性肝損傷，因此抑制NF-κB信號通路可以減輕APAP誘導的急性肝損傷。此外，Wang等[42]使用花姜酮(Zerumbone，ZER)干預CCl4誘導的小鼠急性肝損傷模型，發現ZER預處理降低了Toll受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)、NF-κB p-p65和環氧化酶(cyclooxygenase，COX-2)的蛋白水平，并且恢復了SOD和GSH-Px的活性，降低了MDA的產生，且均呈劑量依賴性；并在LPS誘導的炎性細胞模型中進一步證明ZER可能通過抑制TLR4/NF-κB/COX-2途徑來對抗氧化應激和炎癥，從而達到保肝作用，這表明在體內和體外ZER均可通過抑制NF-κB相關通路來發揮抗氧化作用。Li等[43]使用脂多糖/D-氨基半乳糖誘導急性肝衰竭小鼠模型，發現4-辛基衣康酸(4-Octyl Itaconate，4-OI)可以減輕實驗組小鼠肝損傷，降低血清ALT和AST水平，并且4-OI可激活Nrf2，抑制NF-κB p65的激活，從而減輕ROS相關的肝細胞凋亡。除藥物性肝損傷外，NF-κB信號轉導機制也參與酒精性肝損傷中的氧化應激反應。Zhang等[44]也發現黑牛肝菌(Boletus aereus)可保護酒精誘導的小鼠急性肝損傷，且此種保護機制與氧化應激介導的NF-κB信號轉導相關。但不同的是，在Boletus aereus中檢測到了其他抗氧化劑，如維生素、總多酚和總甾醇，可以調節體內的氧化應激，減少ROS的產生，并且抑制NF-κB信號通路的激活。由此可見，NF-κB信號轉導通路可以促進炎癥，且部分可能受Nrf2的調控影響氧化應激。

除了上述較為常見的分子通路外，氧化應激也有其他相關分子或通路(圖3)。Liu等[45]通過外源性腹腔注射百草枯建立大鼠急性肝損傷模型，產生氧化應激，并且實驗組在注射百草枯前1 h注射不同劑量的NaHS，結果發現H2S顯著抑制ROS的產生和MDA含量的升高，同時增加GSH/GSSG比值以及SOD、GSH-Px等抗氧化酶的水平。這表明藥物并不完全是激活Nrf2和抑制NF-κB來達到減輕氧化應激作用的，但是基于目前的研究，激活Nrf2和抑制NF-κB在抗氧化中發揮重要作用。因此，在抗氧化過程中，如何調節信號通路從而減輕氧化應激所致肝損傷有待深入研究。

圖3 氧化應激主要通路簡要示意圖

5 小結與展望

近年來，關于氧化應激與急性肝損傷乃至肝病的發生發展機制取得了一些進展，尤其是Nrf2與NF-κB等因子對氧化應激的調控，從分子生物學水平推動了氧化應激與肝病發病機制的研究。但上述研究大部分尚處于動物實驗或細胞驗證階段，對大規模人群的長期研究仍任重道遠。

在研究肝臟疾病發病機制時，可從以下方面進行：(1)探討氧化應激對病毒、酒精、藥物等不同病因所誘導的異同機制；(2)探討ROS產生增多對肝細胞、肝星狀細胞、Kupffer細胞等數量、活力、功能的影響及其機制；(3)探討ROS誘導的肝臟組織病理且與其他器官病理的異同；(4) 探討氧化應激相關信號傳導的變化且與其他器官受損時信號變化的異同。

氧化應激的生物標志物可作為診斷工具或治療靶點，在未來研究以氧化應激為治療靶點時可從以下方面進行: (1)探索在急性肝損傷中線粒體介導ROS的分子通路，研究能否通過阻止主要通路而抑制或弱化氧化應激的發生；(2)探索急性肝損傷中抗氧化體系減弱(如抗氧化酶表達受抑或酶活性減弱)的分子機制，能否通過增強抗氧化體系阻止或減輕氧化應激；(3)探索氧化應激對肝炎-肝硬化-肝癌三部曲的影響程度及機制。加深對氧化應激的認識，合理使用抗氧化劑，加上適度的有氧運動，可以減輕或逆轉氧化應激引起的損傷，與氧化應激相關的信號通路或許可以成為肝臟疾病診斷和治療的潛在靶點。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：廖月負責查閱文獻及撰寫文章；何毅懷、羅亞文參與修改文章的關鍵內容。