黃芪湯含藥血清對(duì)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的大鼠肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和成管能力的影響及其作用機(jī)制

王浩藝， 麥靜愔， 平 鍵,3， 成 揚(yáng),3,4

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 肝病研究所， 上海 201203； 2 上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院 治未病科， 上海 200052；3 上海中醫(yī)藥大學(xué)肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203； 4 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 上海 201203

肝纖維化是肝臟對(duì)多種病理刺激的自我修復(fù)反應(yīng)。在該過(guò)程中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)上調(diào)，多種細(xì)胞因子激活肝星狀細(xì)胞，使細(xì)胞外基質(zhì)生成降解失衡、過(guò)度沉積。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC)先于肝星狀細(xì)胞激活，其持續(xù)去窗孔化、表型改變、形成內(nèi)皮下基底膜，即肝竇毛細(xì)血管化，是肝纖維化、肝硬化的早期特征性病變[1-2]，由此伴隨的內(nèi)皮功能障礙和血管新生，會(huì)進(jìn)一步加重肝纖維化的進(jìn)展，并參與門(mén)靜脈高壓形成[3-4]。因此，如何抑制LSEC的增殖和血管新生對(duì)于肝纖維化、肝硬化的治療具有重要意義[5]。

在肝硬化“虛損生積”理論的指導(dǎo)下[6]，本課題組前期臨床研究[7]發(fā)現(xiàn)，黃芪湯可以改善乙型肝炎肝硬化伴輕、中度食管靜脈曲張患者門(mén)靜脈直徑和食管靜脈曲張Palmer評(píng)分。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[8]成功復(fù)制膽管結(jié)扎大鼠肝硬化門(mén)靜脈高壓模型，發(fā)現(xiàn)黃芪湯可以顯著降低門(mén)靜脈壓力，減少肝竇毛細(xì)血管化標(biāo)志物的表達(dá)。基于此，本研究體外分離、培養(yǎng)大鼠LESC，進(jìn)一步觀察黃芪湯對(duì)LESC增殖、遷移和成管能力的影響并初步探討其相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 20只雄性SD大鼠，8周齡，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：XYXK(滬)2020-0009。所有大鼠均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心清潔級(jí)飼養(yǎng)室，飼養(yǎng)環(huán)境：22 ℃，12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞 分離的雄性SD大鼠原代LSEC。

1.3 藥品 黃芪湯由黃芪30 g和炙甘草5 g組成，委托江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司制作顆粒劑(批號(hào)：1212353)，1.2 g黃芪湯顆粒相當(dāng)于黃芪生藥量6 g、炙甘草生藥量1 g。制備工藝如下：取飲片，加水煎煮二次，合并煎液，過(guò)濾。濃縮至一定相對(duì)密度的清膏，噴霧干燥，過(guò)篩。按照處方取以上提取物，混合30 min使之均勻。將以上混合物干法制粒，制成12～40目顆粒。采用空白鋁箔袋噴印包裝噴碼，按照規(guī)格將顆粒包裝成鋁箔小袋。使用前配置成0.14 g/mL溶液(成人用量為6 g/d，體質(zhì)量按60 kg計(jì)算，大鼠灌胃劑量等效約為人體14倍，因此換算為大鼠每天灌胃劑量1.4 g/kg)。

1.4 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清(FBS)、青鏈霉素混合液、RIPA裂解液購(gòu)于北京索萊寶科技公司，貨號(hào)分別為：11995、S9030、P1400、R0010；BCA蛋白檢測(cè)試劑盒、噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為：P0012、C0009S、P0018M；重組鼠細(xì)胞VEGF購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司，貨號(hào)：400-31；Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)Corning公司，貨號(hào)：356234；GAPDH抗體、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1(CD31)抗體、內(nèi)皮性一氧化氮合酶(eNOS)抗體、蛋白激酶B(AKT)抗體、磷酸化(p)-AKT抗體、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抗體、磷酸化(p)-mTOR抗體購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)分別為：ab9485、ab28364、ab5589、ab126811、ab8805、ab2732、ab63552；內(nèi)皮素-1(ET-1)抗體購(gòu)于南京安研生物科技有限公司，貨號(hào)：NY-174490M；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗購(gòu)于英國(guó)Abcam公司，貨號(hào)：ab97051。5415R型高速低溫離心機(jī)(日本Olympus公司)；pectramax M5酶標(biāo)儀(美國(guó)Molecular Devices公司)；DP80倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；041BR127719型電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 黃芪湯藥物血清制備 隨機(jī)選擇SD大鼠10只，按照1.4 g/kg的劑量給予黃芪湯灌胃，另10只大鼠給予相同體積的蒸餾水灌胃。1次/d，連續(xù)3 d。第3天給藥灌胃后2 h，無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈取血10 mL，4 ℃靜置2 h，離心制備血清(3000 r/min、20 min)，56 ℃滅活30 min，過(guò)濾，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩４怂幬镅鍨楦邉┝拷M，1倍比稀釋為中劑量含藥血清，3倍比稀釋為低劑量含藥血清。

1.5.2 大鼠LSEC分離和培養(yǎng) 使用雄性SD大鼠用于分離原代LSEC，分離方法：將前灌流液、膠原酶溶液等置于37 ℃水浴預(yù)熱，無(wú)菌硅膠管一端通過(guò)恒流泵與前灌流液瓶相連，另一端通過(guò)氣泡管與穿刺針相連接。大鼠麻醉后，分別用碘酒、酒精消毒皮毛，U型剖腹術(shù)分層打開(kāi)腹腔，暴露內(nèi)臟。分離門(mén)靜脈，在門(mén)靜脈近肝門(mén)處圍結(jié)扎線，門(mén)靜脈穿刺，插入留置針，扎緊管口，開(kāi)啟恒流泵，流量為10～20 mL/min，迅速剪斷下腔靜脈，使肝臟變?yōu)榫鶆虻牡S色。分離肝臟，連同留置針懸掛于放有布氏漏斗的鐵架臺(tái)上，待前灌流液灌注約8 min后，開(kāi)始灌注膠原酶溶液循環(huán)灌注20 min，待肝被膜下肝組織幾乎液化后，快速剪下肝臟，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿，剪碎后放入裝有50 mL膠原酶溶液的硅化三角燒瓶中，加入4 mL DNA酶Ⅰ溶液，加酶配制液至100 mL。將燒瓶放入恒溫水浴振蕩器分散肝組織，200 r/min，37 ℃，20 min。振蕩后將細(xì)胞懸液通過(guò)二層200目不銹鋼篩濾至2根50 mL離心管中，將細(xì)胞懸液離心(900 r/min、5 min)，收集上清。然后將上清離心(1800 r/min、10 min)，收集沉淀；用PBS重懸沉淀后再次離心(1800 r/min、10 min)；再用10 mL PBS混勻沉淀，得到LSEC細(xì)胞懸液。沿離心管壁依次加入體積分?jǐn)?shù)50%的percoll 15 mL，體積分?jǐn)?shù)為25%的percoll 20 mL和10 mL細(xì)胞懸液，離心(2700 r/min、20 min)。小心吸取50%和25% percoll間的LSEC混濁帶，加等量PBS，混勻，離心(2700 r/min、10 min)；將沉淀懸于10 mL 20% FBS DMEM培養(yǎng)基中，40 min后，收集未貼壁細(xì)胞懸液，再培養(yǎng)于另一培養(yǎng)瓶中，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。LSEC采用含有10% FBS、1%雙抗生素的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.5.3 LSEC分組和藥物干預(yù)處理 LSEC分為6組：空白組，VEGF組，血清對(duì)照組，黃芪湯低、中、高劑量組(以下簡(jiǎn)稱(chēng)空白組、VEGF組、血清組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)，每組LSEC均采用含有10% FBS、1%雙抗生素的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)中各組LSEC藥物干預(yù)處理方法如下：(1)空白組，予以上述培養(yǎng)液；(2)VEGF組，予以40 ng/mL的VEGF；(3)血清組，予以VEGF和10%空白血清；(4)低劑量組，予以VEGF和10%低劑量黃芪湯含藥血清；(5)中劑量組，予以VEGF和10%中劑量黃芪湯含藥血清；(6)高劑量組，予以VEGF和10%高劑量黃芪湯含藥血清。

1.5.4 MTT檢測(cè) 各組LSEC以1×104個(gè)/孔的密度接種于96孔板，予以100 μL上述培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)48 h，然后20 μL/孔加入5 mg/mL MTT溶液，37 ℃恒溫孵育4 h，棄去每孔殘液，150 μL/孔加入二甲基亞砜。將96孔板置于搖床輕微搖動(dòng)10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)的吸光值，計(jì)算細(xì)胞活力，細(xì)胞活力(%)=處理組細(xì)胞吸光值/對(duì)照組細(xì)胞吸光值×100%。

1.5.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 各組LSEC懸浮于無(wú)血清培養(yǎng)液，密度為1×106個(gè)/mL。在上室(8 μm孔徑)6孔插板上種植500 μL LSEC懸浮液；在下室添加600 μL(10% FBS和1%雙抗生素)DMEM培養(yǎng)液。于37 ℃和5% CO2環(huán)境下孵育24 h，將遷移細(xì)胞使用4%多聚甲醛固定15 min，然后使用0.1%結(jié)晶紫染色15 min，漂洗，顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

1.5.6 成管實(shí)驗(yàn) 將Corning凝膠基底膜基質(zhì)(150 μL，10 μg/mL)預(yù)包被于24孔板，將密度為1×105個(gè)/孔的LSEC種植于24孔板，依照分組加入相應(yīng)的培養(yǎng)液，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h后，在顯微鏡下觀察LSEC，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行血管生成長(zhǎng)度測(cè)量。血管長(zhǎng)度(%)=處理組細(xì)胞管長(zhǎng)/空白組細(xì)胞管長(zhǎng)×100%。

1.5.7 Western Blot檢測(cè) 各組LSEC培養(yǎng)48 h后收集，使用RIPA裂解液抽提總蛋白，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)總蛋白含量，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫下1 h進(jìn)行阻斷封閉，加入CD31(1∶1000)、eNOS(1∶1000)、ET-1(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶500)、mTOR(1∶1000)、p-mTOR (1∶500)、GAPDH(1∶1000)一抗，4 ℃過(guò)夜。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶2000)室溫下2 h，TBST洗滌3次，每次10 min，用ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 黃芪湯含藥血清對(duì)VEGF誘導(dǎo)大鼠LSEC增殖的影響 MTT檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組相比，VEGF組、血清組、低劑量組LSEC增殖均顯著增加(P值均<0.05)；VEGF組、血清組、低劑量組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與血清組比較，中、高劑量組的LSEC活性顯著下降(P值均<0.05)，其中高劑量組比中劑量組的細(xì)胞活力下降更為明顯(P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠LESC活力比較

2.2 黃芪湯含藥血清對(duì)大鼠LSEC遷移的影響 Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組相比，VEGF組、血清組的LSEC遷移數(shù)目顯著增多(P值均<0.05)；血清組與VEGF組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與血清組比較，低劑量組細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯增加(P<0.05)，而中、高劑量組細(xì)胞的遷移數(shù)目明顯減少(P值均<0.05)(圖1，表2)。

注：a，空白組；b，VEGF組；c，血清組；d，低劑量組；e，中劑量組；f，高劑量組。

表2 各組大鼠LESC遷移細(xì)胞數(shù)目比較

2.3 黃芪湯含藥血清對(duì)大鼠LSEC成管能力的影響 成管實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：空白組LSEC幾乎無(wú)管腔結(jié)構(gòu)形成。與空白組相比，VEGF組、血清組能明顯促進(jìn)LSEC管腔結(jié)構(gòu)形成，其成管節(jié)點(diǎn)數(shù)、交叉點(diǎn)數(shù)、血管長(zhǎng)度均顯著增加(P值均<0.05)；血清組與VEGF組成管能力比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與VEGF組、血清組相比，低劑量組對(duì)LSEC成管具有促進(jìn)作用，可見(jiàn)管腔形成(P值均<0.05)，而中、高劑量組在成管節(jié)點(diǎn)數(shù)、交叉點(diǎn)數(shù)、血管長(zhǎng)度方面均顯著降低，較少有完整管腔形成(P值均<0.05)(圖2，表3)。

2.4 黃芪湯含藥血清對(duì)大鼠LSEC表達(dá)CD31、eNOS和ET-1的影響 Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組比較，VEGF組、血清組LSEC中CD31、eNOS和ET-1蛋白表達(dá)顯著升高(P值均<0.05)；VEGF組與血清組蛋白表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與VEGF組、血清組比較，低劑量組CD31和eNOS蛋白表達(dá)差異不明顯(P>0.05)，ET-1蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與VEGF組、血清組、低劑量組相比，中劑量組CD31、eNOS和ET-1蛋白表達(dá)水平均顯著下降(P值均<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組CD31、eNOS和ET-1蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P值均<0.05)(圖3，表4)。

注：a，空白組；b，VEGF組；c，血清組；d，低劑量組；e，中劑量組；f，高劑量組。

表3 各組大鼠LESC成管能力比較

圖3 各組大鼠LSEC中CD31、eNOS、ET-1、GAPDH蛋白表達(dá)

2.5 黃芪湯含藥血清對(duì)AKT/mTOR信號(hào)通路的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：與空白組比較，VEGF組、血清組、低劑量組LSEC中p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)均明顯增加(P值均<0.05)；VEGF組與血清組之間p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與低劑量組和血清組相比，中劑量組LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平均明顯下降(P值均<0.05)；與中劑量組比較，高劑量組LSEC的p-AKT/AKT和p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平顯著下降(P值均<0.05)(圖4，表5)。

圖4 各組大鼠LSEC中AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)

表5 各組大鼠LESC中AKT/mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

3 討論

慢性肝病是全球面臨的主要健康挑戰(zhàn)之一，肝纖維化是慢性肝病進(jìn)程中重要的病理階段，決定了慢性肝病的發(fā)展和預(yù)后。如何控制、逆轉(zhuǎn)肝纖維化成為慢性肝病治療的關(guān)鍵。目前抗肝纖維化治療尚未滿足對(duì)預(yù)防慢性肝病進(jìn)展為肝硬化、肝癌的需求[9-10]，在中醫(yī)學(xué)整理觀念和辨證論治原則指導(dǎo)下，探索、優(yōu)化中醫(yī)藥抗肝纖維化的治療方案，符合當(dāng)前肝纖維化治療的主流[11-12]。

表4 各組大鼠LESC中CD31、eNOS、ET-1蛋白表達(dá)比較

肝纖維化是肝臟損傷的階段性病理改變，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)未將其歸屬于一個(gè)獨(dú)立性的疾病，中醫(yī)古籍亦無(wú)肝纖維化的病名記載，現(xiàn)多將其歸屬于“脅痛”“肝積”等范疇，其病因各異，但基本病機(jī)可歸納為“虛損生積”，即機(jī)體功能損傷，無(wú)以化氣，因虛致瘀，因虛生積[13]。治積之要，張?jiān)卣J(rèn)為“當(dāng)先養(yǎng)正則積自除”，強(qiáng)調(diào)扶助正氣的重要性。黃芪湯出自北宋《太平惠民和劑局方》，由黃芪、甘草6∶1相虛配伍，黃芪益氣扶正，且能活血生血，甘草緩氣養(yǎng)陰血，且助黃芪益氣補(bǔ)血，與肝纖維化病機(jī)相契合，補(bǔ)氣癥自消，養(yǎng)正積自除，虛瘀同治，標(biāo)本兼顧。

LSEC是肝竇內(nèi)數(shù)目最多的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞群，在維持肝臟穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要的作用，其結(jié)構(gòu)和功能的改變常常是肝纖維化發(fā)生的初始事件[14]。眾所周知，病理性血管的新生，既伴發(fā)于肝纖維化的發(fā)生，又能加速肝纖維化的進(jìn)程。肝竇毛細(xì)血管化是肝臟微血管生成的主要形式，其發(fā)生能進(jìn)一步加重肝臟微循環(huán)障礙，促進(jìn)肝纖維化、肝硬化的發(fā)展及并發(fā)癥的形成，使肝纖維化逆轉(zhuǎn)更加困難。因此抑制肝竇毛細(xì)血管化和LSEC介導(dǎo)的病理性血管新生，可能成為肝纖維化防治的重要策略。生理狀態(tài)下LSEC不表達(dá)CD31，隨著肝竇毛細(xì)血管化發(fā)生，LSEC表型發(fā)生變化，CD31表達(dá)增加，因此CD31被認(rèn)為是肝竇毛細(xì)血管化的標(biāo)志物[15]。ET-1主要來(lái)源于內(nèi)皮細(xì)胞，與內(nèi)皮素受體結(jié)合促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，是內(nèi)皮功能障礙的病理生理學(xué)基礎(chǔ)[16]。研究[17]表明LSEC功能障礙和損傷后會(huì)合成及分泌豐富的ET-1，引起LSEC窗孔結(jié)構(gòu)改變、縮小，促進(jìn)肝竇毛細(xì)血管化[18]。VEGF是eNOS的激活劑，慢性肝病中VEGF表達(dá)升高，促進(jìn)LSEC表達(dá)eNOS，引起內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管通透性改變[19]，有利于長(zhǎng)期局部血管的生成[1,20]。AKT是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和血管生成的重要信號(hào)分子，mTOR是其下游信號(hào)分子之一，AKT/mTOR信號(hào)通路的激活在細(xì)胞增殖、血管生成中發(fā)揮重要的作用[21]。

本研究以大鼠LSEC作為研究對(duì)象，以VEGF刺激LSEC來(lái)模擬肝纖維化發(fā)生時(shí)LSEC所處的病理環(huán)境，予以不同劑量的黃芪湯含藥血清干預(yù)。結(jié)果顯示，血清對(duì)照組中在VEGF誘導(dǎo)下可以促進(jìn)LSEC增殖、遷移和血管新生，促進(jìn)CD31、eNOS、ET-1蛋白表達(dá)和AKT/mTOR信號(hào)通路的激活，中、高劑量的黃芪湯含藥血清可以抑制由VEGF誘導(dǎo)的LSEC增殖、遷移和血管新生，抑制CD31、eNOS、ET-1蛋白表達(dá)，該作用機(jī)制可能與抑制AKT/mTOR信號(hào)通路的激活相關(guān)。值得注意的是，黃芪湯對(duì)LSEC成管能力的影響可能與劑量相關(guān)，低劑量時(shí)可以促進(jìn)血管新生，中、高劑量時(shí)可以抑制血管新生。關(guān)于黃芪湯對(duì)LSEC成管能力的影響更深層次的作用機(jī)制，本研究團(tuán)隊(duì)將在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年4月28日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：PZSHUTCM2019041835，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王浩藝參與課題設(shè)計(jì)，收集數(shù)據(jù)，資料分析，撰寫(xiě)論文；麥靜愔、平鍵參與課題設(shè)計(jì)，收集數(shù)據(jù)，修改論文；成揚(yáng)負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。