異種肝移植中的急性體液性排斥反應

章忠強， 梁碩洲， 司中洲， 齊海智

1 中南大學湘雅二醫院 肝臟移植科， 長沙 410011；2 中南大學湘雅二醫院 移植醫學研究中心， 長沙 410011

肝移植是治療急慢性肝衰竭、晚期肝硬化等終末期肝病最為有效的治療手段[1-2]。據世界衛生組織統計，目前我國HBV感染者達8600萬人，HCV感染者約1000萬人，每年約33萬人死于HBV或HCV感染導致的晚期肝硬化，而肝移植是能夠挽救這些患者生命的唯一手段。據中國肝移植注冊中心統計，我國每年約有20余萬人正在等待肝移植手術，但最終能夠獲得肝臟供體的患者僅7000人左右，大多數患者在等待供體的過程中死亡，肝臟供體短缺狀況在我國尤為突出。

異種器官移植作為潛在解決器官短缺的方法，一直是生物醫學領域關注的焦點[3-4]。 人類從1968年開始基于大動物異種肝移植模型的實驗研究[5]，早期的動物異種肝移植研究將野生型豬(未行基因編輯的豬)的肝臟移植至靈長類動物體內，但物種之間的不相容性導致嚴重的超急性排斥反應(hyperacute rejection, HAR)以及彌漫性的血管內凝血，受體很快死亡[6-7]。

現代基因工程技術(CRISPR-Cas9技術等)通過敲除供體豬體內與受體天然抗體結合抗原的基因，以及植入人的補體相關調節蛋白抑制受體體內補體系統的激活，并配合新型免疫抑制劑的應用，避免了HAR的發生，HAR在一定程度上得到了較好的控制，從而使動物異種肝移植研究取得進一步的發展[4,8-9]，受體最長生存期延長至29 d(表1)。

野生型豬的肝移植入人體或非人靈長類動物體內后，隨著受體體內大量的針對移植物表面抗原的先天性抗體的結合，誘發抗體介導的HAR，導致移植物血管內血栓形成、出血性壞死、內皮細胞損傷以及IgM、IgG、C3沉積[19]，外觀出現明顯的壞死性改變(圖1)，受體通常在30h內死亡[18]。豬體內的半乳糖-α1,3-半乳糖是誘發HAR的主要靶抗原，其在人類、猩猩和舊世界猴的體內不表達，而這些靈長類動物體內通常存有大量針對該抗原的抗體(抗-Gal抗體)[20]。通過將野生型豬細胞內的α1,3-半乳糖基轉移酶基因敲除，并表達人的補體調節蛋白(如CD46、CD55、CD59)的基因工程豬作為異種肝移植供體，以及免疫抑制劑的應用，可防止HAR的發生，受體生存期得到了一定時間的延長，但血小板持續減少、血栓性微血管病、消耗性的凝血異常成為了受體死亡的主要原因[12, 16-17, 21]。

表1 基因工程豬-非人靈長類動物異種肝移植受體存活時間

圖1異種肝移植術后發生超急性排斥反應(野生型豬肝供體移植到恒河猴)

雖然在原位肝移植模型移植物內或者異位輔助性肝移植術后短期尚未發現明顯排斥反應證據，但是在存活26 d的異位輔助性肝移植模型的有13種基因編輯的移植物中出現了明顯的急性體液性排斥反應，并伴有炎癥損傷、間質出血和血栓性微血管病[18]。因此，隨著受體時間的延長，急性體液性排斥反應將很可能是導致異種肝移植物失功的主要因素之一。明確異種肝移植急性體液性排斥反應的機制，了解其防治策略，對我國開展異種肝移植研究具有重要的意義。

1 急性體液性排斥反應的機制

急性體液性排斥反應是由受體體內抗體結合異種抗原后通過激活補體系統和固有免疫細胞[巨噬細胞、自然殺傷(NK)細胞、中性粒細胞等]反應，導致異種移植物血管內皮細胞被激活和損傷，并在數天或數周的時間內出現局灶性缺血、彌漫性血管內凝血，最終出現結構和功能破壞的過程[20]。

1.1 抗-Gal和抗-非Gal抗體 受體體內的抗-Gal抗體、抗-非Gal抗體結合異種移植物細胞表面的Gal或非Gal抗原，激活受體補體系統級聯反應，是誘發急性體液性排斥反應破壞異種移植物的主要原因[18]。通過將非人靈長類動物受體體內的Gal抗體去除，可有效抑制CD55和CD59異種移植物內急性體液性排斥反應的發生[22]，但即使是使用GTKO豬作為移植物，急性體液性排斥反應仍然會發生[23]，這表明抗-Gal和抗-非Gal抗體均可以誘發急性體液性排斥反應。胞苷酸-N-乙酰神經氨酸羥化物(N-glycolyl neuraminic sialic acid，Neu5Gc)是胞苷酸-N-乙酰神經氨酸羥化酶(cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)編碼基因的產物，是在2002年發現的一個重要的非Gal抗原，由于Neu5Gc在人體內不表達，人類體內逐漸形成高滴度的抗-Neu5Gc抗體[24]。另一個重要的非Gal抗原為聚多糖SDa，為β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖轉移酶2(Beta-1,4-N-acetylgalactosaminyltransferase2，β4GALNT2)編碼基因的產物[25]。SDa抗原的去除可明顯降低供體豬的抗原性，從而減輕靈長類動物針對異種抗原的非-Gal抗體的作用[26]。人類白細胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)和豬白細胞抗原Ⅰ類(SLA-Ⅰ)具有的共同表位可能導致人和豬之間的交叉免疫反應。同時，人體內抗-HLA-Ⅱ抗體可交叉結合SLA-Ⅱ抗原。因此，HLA和SLA相關抗原抗體同樣可能介導急性體液性排斥反應[27-28]。然而，如果肝臟移植物或者受體的生存期比較短，血小板持續減少、血栓性微血管病、消耗性凝血異常等問題可以掩蓋抗非-Gal抗體介導的急性體液性排斥反應對移植物或受體的影響[29]。

1.2 固有免疫細胞 固有免疫細胞通過抗體依賴性細胞毒性作用激活、損傷移植物內皮細胞，同樣可以誘發異種移植急性體液性排斥反應，但其重要性目前暫未明確[20, 29]。

巨噬細胞可以被受體體內的抗異種移植物抗體(如抗Gal或抗非-Gal等天然抗體)的Fc以及補體受體激活，活化的巨噬細胞通過分泌各種促炎細胞因子、活性氧等，參與針對移植物的抗體及補體依賴性的急性體液性排斥反應[30-31]。

NK細胞可通過抗體依賴性細胞毒性機制參與異種體液性排斥反應，移植物內皮細胞表面沉積的抗體被NK細胞上的FcγRⅢ識別，通過導致異種移植物內皮細胞表面黏附分子表達增加，誘導免疫細胞浸潤及炎癥因子釋放，促使異種移植物細胞凋亡[32]。NK細胞還可以通過CD40-CD154途徑與受體脾臟邊緣區B淋巴細胞相互作用，促進抗體介導的急性體液性排斥反應[33]。

在異種移植中,中性粒細胞最早浸潤到移植物內，移植物內存在抗體及補體的沉積促進中性粒細胞粘附并激活內皮細胞，通過抗體依賴性的體液性免疫反應介導異種移植物損傷[34-35]。

2 急性體液性排斥反應的防治

2.1 供受體移植前嚴格配型 前期研究[18-36]表明，抗非-Gal抗體仍然是誘導異種肝移植術后急性體液性排斥反應的主要原因，且Gal、Neu5Gc、Sda抗原均敲除的基因工程豬作為供體，抗非-Gal抗體介導的急性體液性排斥反應仍然無法完全避免。

因此，嚴格的移植前供受體交叉配型(包括針對供體的抗原抗體結合試驗以及補體依賴性的供體細胞殺傷試驗)，篩選最佳匹配的供受體組合，可以盡量減少異種肝移植術后抗Gal或非Gal抗體介導的急性體液性排斥反應的發生。

2.2 基因工程技術 通過基因工程技術敲除豬移植物內的相關抗原并修飾補體調節蛋白等，是防止或減輕異種肝移植體液性排斥反應的主要手段。Gal基因的敲除以及CD46、CD55、CD59等補體調節蛋白修飾的基因工程豬的肝移植物，可以防止HAR的發生，有效控制急性體液性排斥反應[11, 34]。GTKO/CD46基因型豬肝移植物在非人靈長類動物體內維持基本的肝功能7 d，移植物內未發現明顯移植排斥反應[11]。GTKO基因型豬肝移植物作為異位輔助性供體，最長可在非人靈長類動物體內存活15 d，不出現嚴重的急性體液性排斥反應[14]。在異種原位肝移植模型中，GTKO基因型豬肝移植物可維持受體存活時間達29 d，且無明顯移植排斥反應[17]。然而，13個基因編輯(PERV-KO/3-KO/9-TG)的基因型豬肝移植物在術后26 d的病理檢查中發現了明顯的體液性排斥反應[18]。

通過基因工程技術敲除抗原、修飾相關蛋白可顯著防止異種肝移植急性體液性排斥反應的發生，但并不是基因的敲除及修飾的基因數量越多，急性體液性排斥反應發生的概率越小。因此，通過實驗研究，進一步明確不同基因編輯組合供體(包括針對固有免疫細胞介導的免疫反應的基因編輯)在防止肝移植急性體液性排斥反應中的作用，更精準地進行基因敲除或修飾，優化供體的基因編輯組合，是預防異種肝移植急性體液性排斥反應的關鍵所在。

2.3 藥物處理 異種肝移植受體接受免疫抑制及相關輔助藥物的足量處理，是減少移植術后體液和細胞性排斥反應，減輕移植物損傷的主要方法。其中，眼鏡蛇毒因子和激素分別通過作用于補體系統激活和移植術后炎性反應、炎癥因子風暴，抑制急性體液性免疫反應的發生[36]。此外，針對B淋巴細胞的抗CD20單克隆抗體(aCD20mAb，Rituxan)在減輕異種肝移植術后急性體液性排斥反應方面也具有一定的作用[37]，但其重要性有待進一步明確。

3小結

抗體介導和固有免疫細胞參與的急性液性排斥反應是基因工程豬-非人靈長類動物異種肝移植研究中需要特別注意的問題。急性體液性排斥反應可以快速導致異種移植物失功，并可能是阻礙進一步延長異種肝移植受體存活時間的關鍵因素。通過移植術前嚴格的供受體交叉配型、選擇合適的基因工程豬供體基因型以及眼鏡蛇毒因子和激素等藥物的規范足量使用，是目前減輕或避免基因工程豬-非人靈長類動物異種肝移植術后急性體液性排斥反應的主要方法。然而，受體固有免疫細胞參與的異種肝移植急性體液性排斥反應的機制以及防治策略，亟需更深入的研究探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：章忠強、梁碩洲負責撰寫論文；司中洲、齊海智負責寫作思路，指導撰寫、修改文章并最后定稿。