突破供肝短缺難題： 異種肝移植的發展與創新

李 霄， 竇科峰

空軍軍醫大學西京醫院 肝膽外科， 全軍器官移植研究所， 西安 710032

2021年10月19日和2022年1月7日，美國相繼完成以基因編輯小型豬為供體的異種腎移植和心臟移植的臨床試驗并獲得成功[1-2]，自此，以豬為供體的異種移植迅速占據全球生命科技領域的中心，成為全人類關注的焦點。近期，美國食品藥物監督管理局宣布正在制訂計劃，即將允許對豬器官移植開展大規模的臨床試驗。TheNewEnglandJournalofMedicine、Nature等權威期刊近期連續發表專家述評[3-4]，一致認為異種移植將很快走向臨床實用，有望徹底解決供體器官短缺的難題。

隨著基因工程技術的不斷發展，以基因編輯豬為供體的異種肝移植穩步進展，雖與腎移植、心臟移植和胰島移植相比尚有差距，但目前豬肝移植的最長存活時間也已延長至1個月[5]，為臨床利用異種肝移植作為暴發性肝功能衰竭的“橋接移植”提供了可能。異種肝移植即將走向臨床實用。

1 異種肝移植發展簡史

“異種移植一定會不斷發展進步”，國際肝移植先驅Thomas Starzl教授曾在討論異種移植時這樣說，“但在這個領域開展的一切都是非常艱難的，我們付出了很多努力。然而這并沒有引起什么確切改變。我甚至并不看好它的前景(我們還有太多的東西需要去探索)，但我認為它遲早會完成的……”。

1992年，第一個移植了狒狒肝臟的患者死亡之后(移植肝存活70 d)，Starzl教授等肝移植專家推進了一系列狒狒肝臟到人的原位移植計劃。1993年，Starzl教授團隊又對另1例患者實施狒狒肝移植，但該患者在術后26 d因系統性感染而死亡。由于臨床效果不理想，Starzl教授團隊停止了使用狒狒肝臟這一臨床研究計劃。同年，美國學者Makowka等對1例26歲的自身免疫性肝炎女性患者實施世界第一例臨床異種豬肝移植。該患者因自身免疫性肝炎導致暴發性肝昏迷入院，而供體是一頭野生型大白豬。手術的目的是通過移植豬肝暫時代償肝功能而保證患者存活，直到有人類供體的肝臟可用為止。術后6 h后見金黃色膽汁不斷流出，患者血清AST、ALT及乳酸等含量持續減少，提示移植肝在患者體內發揮生理生化功能；同時，受體顱內壓持續下降，凝血功能也逐漸轉向正常。然而，在移植后3 h便檢測到了移植物排斥反應，并在移植后34 h進展為缺血性壞死。最終，患者因不可逆的腦損傷于2 d內死亡。

1995年，美國學者Wakowka等對1例因自身免疫性肝炎導致暴發性肝功能衰竭的3～4級肝昏迷患者實施輔助性肝移植，供肝同樣來自野生型大白豬。術前采用血漿洗脫法和特異性抗體移出法對患者進行預處理，清除了受體循環血液中90%的抗豬天然抗體，減輕超急性排斥反應。術后采用“環孢素A+環磷酰胺+前列環素E1+硫唑嘌呤”的四聯免疫抑制治療方案。最終，供肝功能存活20 h，受體存活34 h。尸檢發現肝臟存在由抗體介導的超急性排斥反應所致的大面積梗死，提示受體循環血液內的異種抗體清除后可迅速回升。

在臨床初步嘗試失敗后，異種肝移植研究轉向基礎研究，試圖尋找導致移植失敗的原因及解決方法。2002年和2003年，美國2個研究團隊先后在Science上報道培育出α-1,3-半乳糖苷轉移酶基因敲除小型豬(GTKO豬)。隨后全世界開展了一系列以GTKO豬為供體，非人靈長類動物為受體的異種器官移植實驗，取得了重大進展。2017年，中美兩國科學家聯手采用CRISPR/cas9技術，將豬體內的內源性逆轉錄病毒(porcine endogenous retrovirus, PERV)的62個基因拷貝全部敲除，根除了豬細胞里面所有的內源性病毒活性，并通過核移植克隆技術成功獲得了第一批37頭無病毒活性的試驗豬，為異種移植走向臨床排除了種間交叉感染的風險[6]。目前，異種腎移植最長存活499 d[7]，原位心臟移植最長存活199 d[8]，而異種肝移植進展顯得較為困難，當前最長存活時間為29 d[5]，但已足夠證明豬的肝臟可在人體內發揮一定的代謝功能，能夠為急性肝衰竭患者提供一段時間的肝功能支持，從而起到“橋接”同種肝移植治療的目的[9]。

2 豬-非人靈長類動物肝移植模型研究進展

1968年，Calne等率先利用豬肝開展異種肝移植研究，進行了7例野生型豬-狒狒原位肝移植手術，移植肝和受體最長存活時間3.5 d。隨后，多個研究小組均開展相同的手術實驗，但存活時間均未超過4 d。隨后，隨著GTKO豬及轉人補體調節蛋白豬的問世，多個研究小組嘗試使用轉基因豬的肝臟以提高存活率。然而，所有的手術實驗均發現豬肝在恢復血流灌注后，受體將很快出現嚴重的血小板減少，直至發生致死性凝血功能調節障礙，導致多個部位自發性出血，因而生存時間均<7 d。

起初認為在凝血功能調節障礙過程中，移植物血管內的血栓形成與豬內皮細胞抗凝功能受損有直接關系，而抗體和補體介導的內皮細胞激活則促使內皮細胞由抗凝狀態向促凝狀態轉化。但實際研究發現，預清除天然抗體并中和受體補體后，并不能完全阻止凝血調節功能障礙的發生。Ekser等[10]和Ezzelarab等[11]的研究發現，受體死亡后，在對移植肝標本行電鏡檢查時，發現肝血竇內有大量的血小板、炎性細胞和纖維蛋白沉積，人和非人靈長類動物血小板可能被豬肝移植物識別為“外來物”，并被豬Kupffer細胞和肝血竇內皮細胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)吞噬而遭到大量破壞。這種吞噬作用與靈長類動物血小板表面表達的CD47，與豬Kupffer細胞、LSEC等表面表達的信號調節蛋白-α(SIGNAL regulatory protein-α，SIRPα)之間的不相容性有關。有學者提出將hSIRPα編碼基因轉入小型豬，使其LSEC和Kupffer細胞表達hSIRPα，以消除對人血小板的吞噬作用。但實驗中發現hSIRPα與豬CD47的結合力顯著高于hCD47，因而并不能誘導出抑制性酪氨酸磷酸化信號，沒有得到理想的干預效果。此外，SIRPα并非只表達于Kupffer細胞和肝內皮細胞，循環中的巨噬細胞也有表達。因此，循環中的巨噬細胞需要與內皮細胞或其他細胞表面的CD47結合才能阻止其激活和吞噬，有效的策略可能是同時轉入hSIRPα和hCD47[12]。

其他可能介導凝血調節功能障礙的因素包括：(1)免疫反應導致供肝LSEC激活，進而細胞內P-選擇素、E-選擇素、組織因子(tissue factor，TF)等表達上調，觸發外源性凝血途徑。(2)受體血小板和外周血單核細胞內組織因子表達上調。(3)微循環內白細胞-血小板聚集體的形成。(4)豬的TF途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)和人TFPI之間存在結構性差異，導致豬TFPI和人TFPI的功能不兼容，因而豬TFPI不能有效抑制人TF途徑的激活[13]。

考慮到原位肝移植帶來嚴重的凝血調節功能障礙，那么能否將GTKO豬肝作為輔助移植物植入非人靈長類動物體內以減輕對受體血小板的破壞？從1968年到2016年，豬到非人靈長類動物肝移植的存活時間從未超過9 d。2013年，筆者團隊在國際上首次嘗試異種脾窩輔助性肝移植研究。實驗過程中，首先切除受體的脾臟，而后將部分GTKO豬的供肝(約120 g)植入脾窩，術后受體存活時間延長至14 d。尸檢病理學檢查證實移植肝內存在一定程度的血栓性微血管病，但術后嚴重血小板丟失現象并未出現，其計數始終維持在50 000/mm3以上，未出現致死性的血小板匱乏[14]。隨后美國麻省總醫院借鑒該術式，也完成了全美首例異種異位輔助性肝移植術，移植肝和受體最長存活15 d[15]，但凝血問題始終沒有得到解決。

針對異種肝移植術后受體出現致死性血小板減少的問題，美國麻省總院的肝移植團隊，分別于2016年和2017年在2例GTKO豬-狒狒的肝移植術后，持續給予受體輸注外源性人凝血酶原復合物(human prothrombin concentrate complex，hPCC)，并檢測外周血液循環中維生素K依賴凝血因子和非維生素K依賴凝血因子的活動度。結果發現，移植肝可合成并分泌凝血因子，且受體出血異常得到明顯改善。最終，2例受體存活時間分別延長至25 d[16]和29 d[5]，這也是目前以GTKO豬為供體的異種原位肝移植受體的最長存活時間記錄。

2020年，杭州啟函生物科技有限公司和云南農業大學動物醫學院在國際上首次成功培育出基因改造程度最大的PERV敲除豬，實現了“13種基因編輯”，即PERV-KO/GalT-KO/β4GalNT2-KO/CMAH-KO/hCD46/hCD55/hCD59/hβ2M/hHLA-E/hCD47/hTHBD/hTFPI/hCD39(PERV-KO/3-KO/9-TG)。該基因編輯小型豬除了完全敲除PERV，還敲除了誘發異種超急性排斥反應的3個主要抗原α-Gal、β4GalNT2和CMAH，并導入了9個人源化基因以抗急性排斥。隨后，筆者團隊將其作為供體，實施了豬-恒河猴異種心臟、肝臟和腎移植的臨床前研究，探索了此種類型供體豬在異種器官移植中的臨床應用前景。心臟采用腹部異位心臟移植術；肝臟采用脾窩異位輔助性肝移植術；腎臟采用臨床常規的左髂窩腎移植術，并切除受體自身的雙側腎臟。免疫抑制方案為：術前抗胸腺細胞球蛋白+眼鏡蛇毒因子+CD20抗體+CD40抗體，術后CD40抗體+嗎替麥考酚酯+他克莫司+甲基強的松龍。手術過程順利，各移植物血流恢復后均顯示顏色紅潤、質地柔軟、血流灌注狀態良好。其中，移植心臟即刻復跳，搏動規律有力；移植肝臟有金黃色的膽汁從膽管流出；移植腎可見尿液從輸尿管中流出。心臟、肝和腎移植受體的存活時間分別為7、26和1 d，分別死于下腔靜脈血栓形成、凝血紊亂所致低血壓和嚴重心律失常。尸檢后的病理檢查結果顯示，在移植終點，移植心臟和腎組織結構接近正常，而移植肝臟表現為片狀壞死，肝組織結構出現紊亂，并伴有明顯炎癥損傷、間質出血和血栓性微血管病。上述實驗在世界范圍內首次實現了PERV敲除聯合3種主要異種抗原基因敲除(GalT、β4GalNT2、CMAH)，以及抑制補體活化(hCD46、hCD55、hCD59)、調節凝血紊亂(hTHBD、hTFPI、hCD39)、抗炎抗吞噬(hB2M、hHLA-E、hCD47)的9種人源化基因轉入，是目前基因改造程度最大、人源化程度最高的供體豬類型。理論上，該類供體既可解決異種器官移植后PERV交叉感染及超急性排斥反應的問題，也可以降低異種器官移植術后急性排斥反應和凝血功能紊亂等問題。研究結果顯示，移植物再灌注后顏色紅潤、質地柔軟、血流灌注狀態良好，提示GalT、β4GalNT2、CMAH敲除可抑制異種移植超急性排斥反應，與其他學者前期的研究結果一致。但是，隨著受體生存期延長，移植肝臟出現明顯的體液性排斥反應，表現為片狀壞死，肝組織結構出現紊亂，并伴有炎癥損傷、間質出血和血栓性微血管病等，提示供體豬9種人源化基因的轉入并不能完全避免異種移植物損傷。該研究中，肝移植受體突破了豬-猴輔助性肝移植國際同類術式最長存活時間記錄，在一定程度上證實了PERV-KO/3-KO/9-TG豬在改善移植排斥反應、受體凝血異常等方面仍有自身優勢，但其能否作為臨床異種器官移植的潛在供體仍需進一步評估[17]。此外，PERV敲除理論上可阻斷病毒跨物種傳播。該研究也提示PERV不會傳播到受體血液或組織中，但PERV監測仍然是一個值得關注的問題，尤其是在長期存活的受體當中。

3 異種肝移植臨床試驗受體選擇標準探討

考慮到長期療效和當前公眾對異種移植的接受程度，筆者建議以豬為供體的異種肝移植的初步臨床試驗，應側重于暴發性肝衰竭、急性肝衰竭、慢加急性肝衰竭和原發性同種異體肝移植失敗等患者。這些情況下，患者往往由于缺少有效的替代療法，且無法及時獲得同種供肝而死亡。此時，可考慮應用異種肝移植作為一種“橋接治療”的方式，支持患者渡過最危險的時刻，直至自身肝功能恢復或等到獲得同種供肝進行移植。如果此類臨床試驗獲得成功，再加上對供體豬進行更為完善、全面的基因修飾改造，有理由相信，以豬為供體的異種肝移植有望成為有效的臨床治療方式。

美國學者Horslen等[18]最早提出以下標準，可考慮應用異種肝移植作為橋接治療：(1)急性肝衰竭患者在ICU持續治療后病情進一步惡化；(2)適合行同種異體肝移植的患者；(3)肝性腦病，并進展為Ⅳ級昏迷；(4)已行氣管內插管且短期內無法拔除；(5)顱內壓監測中出現極端腦灌注壓；(6)缺少合適的同種異基因供肝。

英國國民健康服務(National Health Service，NHS)肝臟咨詢小組為急性肝衰竭患者制定了一套超緊急的選擇標準(其中至少1項必須滿足)(表1)[19]。該標準可以被考慮用于選擇患者行原位豬肝移植，再“過渡”到同種異體移植的臨床試驗。

表1 英國NHS急性肝衰竭超緊急選擇標準

總的來講，在異種肝移植開始臨床試驗之前，選擇最佳患者對于試驗能否取得成功至關重要。目前最妥善的方案是將受試者范圍定為具有嚴重或危及生命疾病的受者，這類患者需要立即接受器官移植治療，但因缺少捐贈器官，無法及時得到恰當的治療而死亡[20]。這些患者不符合接受同種異體移植的標準，例如高齡(>65歲)、骨骼肌減少癥、慢加急性肝衰竭和同時患有其他重大疾病等，并被判定為“因病重而無法移植”。利用異種肝移植的“橋接治療”，可能延長此類晚期患者的生存期，延長“移植窗口期”，促進同種異基因肝移植的成功，并降低死亡率。

4 小結

盡管凝血功能障礙仍然是一個巨大的挑戰，但基因編輯豬的肝臟已經能夠在非人靈長類動物體內有功能存活近30 d，這為異種肝移植進入臨床試驗奠定了重要基礎。同時，PERV-KO/3-KO/9-TG豬在克服超急性排斥反應、緩解體液性排斥反應及凝血紊亂方面具有一定優勢，是當前臨床異種器官移植最有價值的潛在供體。然而，異種器官移植臨床前研究實施難度大，受體依從性差，給藥窗口窄，用藥、護理等術后管理也十分困難。這些問題，需要多學科通力合作去解決。隨著異種移植研究事業的推進，相信異種移植終將走向臨床實用，徹底解決供體短缺的難題，造福人類！

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李霄負責文獻檢索，撰寫論文；竇科峰負責指導撰寫文章并最終定稿。