魚油DHA脂質體的制備及穩定性

楊水兵，劉 麗，易國富，余海霞

（1.滁州學院生物與食品工程學院，安徽 滁州 239000；2.浙江大學舟山海洋研究中心，浙江 舟山 316021）

我國魚油資源豐富，近幾年年產量維持在大約3 萬t。 魚油是從魚類或其加工副產物中提取的脂質成分，富含-3多不飽和脂肪酸，主要包含二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）。其中DHA主要存在于視網膜和大腦皮層中，具有促進嬰幼兒大腦發育、保護視力、預防心腦血管疾病、抗炎癥等功能，已引起食品、保健品等領域研究人員的廣泛關注。但由于DHA含有6 個雙鍵，導致其易受到如光、熱、氧等外環境的影響，且其氣味、水溶性和流動性較差，極大限制了其應用。

脂質體是由磷脂雙分子層組成的具有類生物膜結構的囊泡，可包裹水溶性和脂溶性的芯材，以達到對包埋營養物的緩控釋、靶向等作用，在農業、食品工業及醫藥等領域顯示出廣闊的應用前景。針對脂溶性魚油DHA的生理功能及脂質體的特性，采用運載包埋技術將魚油DHA制備成脂質體，可有利于快速發揮它的功能作用。

常用的制備脂質體的方法有薄膜法、逆向蒸發法、乙醇注入法及高壓乳勻法等。薄膜法適用于脂溶性物質的包覆，但一般粒徑較大。動態高壓微射流（dynamic high pressure microfluidization，DHPM）技術是一種連續化處理手段，由于其強剪切、高速撞擊、氣蝕、振蕩和膨化等作用，在運載體系的均質、細化和乳化等過程中有重要應用。因此，本研究以脂溶性魚油DHA為原料，分別采用薄膜分散法及薄膜分散法聯合DHPM技術制備包載魚油DHA的粗脂質體（crude liposomes-DHA，CLs-DHA）和納米脂質體（nanoliposomes-DHA，NLs-DHA），以平均粒徑、多分散指數（polydispersity index，PDI）、Zeta電位等為評價指標，考察不同方法制備的魚油DHA脂質體的pH值和貯藏穩定性；并通過差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法分析不同方法制備的魚油DHA脂質體的熱穩定性差異。旨在開發一種低粒徑、穩定性好的脂質體運載體系，以方便在實際生產中使用，擴大DHA魚油的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

10/70 EE-DHA魚油（DHA含量70%，2021年10月18日 制備，食品級），來源于鳀魚廢棄物提取，舟山新諾佳生物工程有限責任公司提供。

無水乙醇（分析純） 國藥集團化學試劑有限 公司；大豆卵磷脂（純度＞92%） 北京美亞斯磷脂技術有限公司；膽固醇（分析純） 北京奧博星生物技術責任有限公司；吐溫-80（分析純） 上海申宇醫藥化工有限公司。

1.2 儀器與設備

RE-5205旋轉蒸發器、SHZ-Ⅲ循環水真空泵 上海亞榮生化儀器廠；Nicomp 380 ZLS超細微粒粒度分析儀 美國Santa Barbara公司；T6紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Microfluidizer Processor M-700微射流儀 美國Microfluidics公司；DSC 7000X DSC儀 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 魚油DHA脂質體的制備

采用薄膜分散法制備CLs-DHA，將大豆卵磷脂、膽固醇、吐溫-80和10/70 EE-DHA魚油按質量比15∶3.75∶5∶5混合，在40 ℃水浴中溶于一定量的無水乙醇中，然后旋轉蒸發除去乙醇，形成脂質薄膜，加入磷酸鹽緩沖液（pH 7.4，0.05 mol/L），在減壓條件下充分旋轉洗膜，獲得CLs-DHA懸液。將CLs-DHA懸液加入DHPM均質機中，在120 MPa下處理2 次，得到均勻的NLs-DHA。NLs-DHA外觀透亮、均勻、無沉淀，而 CLs-DHA呈現出乳白色的外觀。

1.3.2 平均粒徑、PDI、Zeta電位測定

將待測脂質體懸液稀釋至一定濃度，采用激光納米粒度儀在25 ℃下測定平均粒徑、PDI和Zeta電位，每個樣品平行測定3 次。

1.3.3 DHA脂質體的穩定性測定

1.3.3.1 pH值穩定性

參考付咪等的方法并做適當修改，將CLs-DHA和NLs-DHA分別調節pH值至1.5、4.0、5.5及7.4，并于4 ℃冷藏放置7 d，考察CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑、PDI和Zeta電位的變化。

1.3.3.2 貯藏穩定性

將CLs-DHA和NLs-DHA置于4 ℃冷藏放置95 d，間隔取樣測定CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑、PDI和Zeta電位的變化。

1.3.4 DHA脂質體的DSC分析

用DSC儀對CLs-DHA和NLs-DHA的相變溫度進行測定。取8.0 mg CLs-DHA和NLs-DHA凍干樣品放入密閉鋁坩堝底部，在加熱溫度20～200 ℃條件下掃描樣品，設定升溫速率為10 ℃/min，以空白坩堝作為對照。

1.4 數據處理

采用Microsoft Office Excel 2010軟件進行數據處理，本研究所列數據為3 個試樣的平均值，以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 魚油DHA脂質體的pH值穩定性

PDI是反映膠體體系中粒徑分布的指標，PDI＜0.4表明體系粒徑分布均勻，PDI越小說明粒徑分布的范圍越小，體系中顆粒的規整度越好，分散度越均勻。Zeta電位是表征脂質體穩定性的一個重要物理特性。Zeta電位絕對值越高，脂質體相互凝聚而沉降的阻力越大， 越穩定。環境pH值會影響磷脂的水解，改變脂膜的通透性，同時會對粒子表面電荷產生影響，引起聚集，影響脂質體的穩定性。

圖2 pH值對CLs-DHA和NLs-DHA PDI的影響Fig. 2 Effect of pH value on PDI of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖1～2可知，隨著pH值逐漸增大，NLs-DHA的平均粒徑和PDI均呈下降趨勢，平均粒徑從172.4 nm降至124 nm左右，PDI從0.349降至0.269，粒徑分布比較均一，體系相對穩定，尤其在pH 7.4時NLs-DHA有較好的穩定性。隨pH值升高，CLs-DHA的平均粒徑和PDI均呈先上升后下降的趨勢，不同pH值處理組之間的平均粒徑差異也較明顯。pH值對脂質體穩定性影響較大，pH值越低，H濃度增加，H會穿透雙分子層膜，造成雙分子層膜被破壞，脂質體越不穩定，越容易發生絮凝和沉淀。

圖1 pH值對CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑的影響Fig. 1 Effect of pH value on average particle size of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖3可知，隨著pH值逐漸增大，CLs-DHA和NLs-DHA的Zeta電位絕對值均逐漸升高，在接近中性pH值（7.4）條件下Zeta電位絕對值最大，脂質體貯藏穩定性較好，而當脂質體處于強酸（pH 1.5）環境下，其Zeta電位絕對值大幅下降，接近于0 mV，變得很不穩定；總體來說，CLs-DHA的Zeta電位絕對值略低于NLs-DHA，NLs-DHA表現出更好的穩定性。江連洲等制備的大豆蛋白-磷脂酰膽堿魚油納米乳液在酸性條件下不穩定，堿性條件下穩定，不同魚油運載體系的穩定性受乳化劑種類和濃度的影響，pH值會影響大豆蛋白的電離程度和乳化性，從而影響體系的穩定性，而pH值對吐溫穩定的魚油運載體系的平均粒徑影響不大。

圖3 pH值對CLs-DHA和NLs-DHA Zeta電位絕對值的影響Fig. 3 Effect of pH value on absolute value of zeta potential of CLs-DHA and NLs-DHA

2.2 魚油DHA脂質體的貯藏穩定性

圖5 貯藏時間對CLs-DHA和NLs-DHA PDI的影響Fig. 5 Effect of storage time on PDI of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖4～5可知，在貯藏95 d過程中，CLs-DHA粒徑變化幅度相對較大，平均粒徑大致呈先下降后升高的趨勢，貯藏66 d之后平均粒徑明顯上升，從（368.4±4.4） nm增加至（394.0±3.7） nm。這可能是因為在前期制備的脂質體發生了重組，粒徑變小，隨著貯藏時間的延長，脂質體出現顆粒聚集、破裂等物理不穩定現象，引起粒徑和粒徑分布范圍增大；NLs-DHA的平均粒徑和PDI變化幅度相對較小，平均粒徑為88 nm左右，PDI波動也較?。?.220～0.246），粒徑分布較均勻，分散體系較為穩定。

圖4 貯藏時間對CLs-DHA和NLs-DHA平均粒徑的影響Fig. 4 Effect of storage time on average particle size of CLs-DHA and NLs-DHA

由圖6可知，2 組樣品Zeta電位絕對值均呈降低趨勢，NLs-DHA的Zeta電位變化小于CLs-DHA，也表明NLs-DHA的長期穩定性優于CLs-DHA，適度的DHPM技術處理可增強脂質體的穩定性。邰克東等采用傳統薄膜水化法輔助高壓均質制備脂質體，也發現均質壓力和均質次數的增加可明顯降低脂質體囊泡的粒徑并提高其離心物理穩定性。

圖6 貯藏時間對CLs-DHA和NLs-DHA Zeta電位絕對值的影響Fig. 6 Effect of storage time on absolute value of zeta potential of CLs-DHA and NLs-DHA

2.3 魚油DHA脂質體的DSC分析

脂質體雙層膜的性質與介質溫度密切相關。當介質溫度升高時，脂質雙分子層中?；鶄孺湉挠行蚺帕凶兂蔁o序排列，引起脂膜的物理性質產生一系列變化，可由“膠晶態”變成“液晶態”，膜的橫切面增加，厚度減小，流動性增加，發生這種轉變時的溫度稱為相變溫度（）。可用來評估脂質體的熱穩定性，脂質體膜的剛性或流動性密切影響脂質體的穩定性，從而影響脂質體的載體性質。一般來說，越大，焓值越小，物質狀態會越好，完整度加大，產品的熱穩定性越好。

圖8 CLs-DHA的DSC曲線Fig. 8 DSC profile of CLs-DHA

圖9 NLs-DHA的DSC曲線Fig. 9 DSC profile of NLs-DHA

由圖7～9可知，CLs-DHA的為126.37 ℃，NLs-DHA的為133.73 ℃，均比大豆卵磷脂的（125.19 ℃）高。其中CLs-DHA的接近于磷脂。將大豆卵磷脂制備成魚油DHA脂質體后，有所升高，原因可能是膽固醇增加了磷脂雙分子層膜的剛性，降低了膜流動性，從而使上升，穩定性增加。NLs-DHA的較CLs-DHA上升較大，膜的穩定性更大，可能是因為DHPM技術處理的高速撞擊、高速剪切、瞬時壓降、高頻振蕩和氣穴作用有效提高了脂質體的，對脂質體膜的流動性產生一定的影響，增強脂質體的穩定性，與前面pH值和貯藏穩定性的結果一致。Wang Qianqian等通過DSC分析儀測得制備的魚油粗脂質體為56.17 ℃，低于本研究中制備的DHA魚油脂質體的。不同脂質體制備相關研究中的差異可能是由于制備時使用的磷脂等不同導致的。

圖7 大豆卵磷脂DSC曲線Fig. 7 DSC profile of soybean lecithin

3 結 論

本研究分別采用薄膜分散法及薄膜分散法聯合DHPM技術制備包載魚油DHA的CLs-DHA和NLs-DHA，以平均粒徑、PDI、Zeta電位為主要評價指標，考察 CLs-DHA和NLs-DHA的pH值穩定性和貯藏穩定性，并通過DSC儀分析其熱穩定性。結果表明：NLs-DHA表現出更好的pH值和貯藏穩定性；通過DSC分析表明，與未經DHPM均質處理的脂質體CLs-DHA相比，NLs-DHA 具有較高的，也表明適度的DHPM技術處理可增強魚油DHA脂質體的穩定性。本研究結果表明，相比于 CLs-DHA，NLs-DHA具有更優良的穩定性。