馬鈴薯帚頂病毒基因組克隆與侵染性克隆構建

劉 野，高艷玲，劉佳慧，方 月，馬廷帥，毛彥芝，張麗莉，白艷菊，程曉非*

（1.寒地糧食作物種質創(chuàng)新與生理生態(tài)教育部重點實驗室/東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，黑龍江 哈爾濱 150086）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是世界第四大糧食作物，2019年全球馬鈴薯產(chǎn)量高達3.68億t，中國是馬鈴薯產(chǎn)量最大的國家，年產(chǎn)量為9 000萬t[1]。病毒病是影響馬鈴薯產(chǎn)量與品質的重要因素之一，也是馬鈴薯種薯退化的主要原因。據(jù)報道有40余種植物病毒可侵染馬鈴薯，并造成危害[2]。馬鈴薯帚頂病毒（Potato mop-top virus，PMTV）是帚狀病毒科（Virgaviridae）馬鈴薯帚頂病毒屬（Pomovirus）的代表成員[3]。感染PMTV的馬鈴薯植株上部葉片出現(xiàn)倒V型黃化斑紋，基部葉片出現(xiàn)不規(guī)則黃色斑塊或線狀紋，塊莖出現(xiàn)壞死弧紋或條紋，嚴重影響馬鈴薯的產(chǎn)量、品質及商業(yè)價值[4]。PMTV主要通過塊莖、粉痂菌（Spongospora subterranea）傳播，也可通過機械摩擦傳播[5]。PMTV曾在廣東、云南和四川等地的塊莖中被零星檢測到，但尚無在中國馬鈴薯產(chǎn)區(qū)大面積流行和傳播的報道[6-8]。鑒于該病毒的強致病性和危害性，中國已將其列入進境植物檢疫禁止進境物名錄。PMTV的病毒粒子為直桿狀，基因組由三條正義單鏈RNA組成，根據(jù)長度分別命名為RNA1、RNA2和RNA3[7]。三條RNA的3′末端沒有mRNA類似的多聚腺苷酸尾巴，但含有一個類似tRNA的結構[9]。RNA1長約6.1 kb，編碼兩個復制相關蛋白；RNA2長約3.1 kb，編碼兩個病毒外殼蛋白（Coat protein，CP）；RNA3長約2.9 kb，編碼四個閱讀框（Open reading frame，ORF），其中ORF1-3部分重疊，組成保守的三基因盒（Triplegene block，TGB），編碼3個運動蛋白，ORF4編碼一個具有RNA沉默抑制子功能的富含半胱氨酸蛋白（Cysteine-rich protein，CRP）[10]。本研究報道了一株采自河北省馬鈴薯塊莖的PMTV全基因組序列，對其遺傳進化進行了分析，并構建了其侵染性克隆，以期為研究PMTV的致病和傳播機制、馬鈴薯的抗病機制以及建立科學防控策略提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

感染PMTV的馬鈴薯塊莖采自河北省張北縣（由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院克山分院馬鈴薯資源研究所提供）。

1.1.2 菌株與載體

大 腸 桿 菌（Escherichia coli）DH5α、酵 母（Saccharomyces cerevisiae）Y2H Gold、農(nóng)桿菌（Agrobacterium rhizogenes）GV3101均 由 本 實 驗 保存；pCB301-2u-HDV載體來自浙江大學[11]。

1.1.3 培養(yǎng)基與生化試劑

本研究所用培養(yǎng)基及普通生化試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 植物培養(yǎng)條件

野生型本氏煙（Nicotiana benthamiana）種植于植物生長箱中，溫度為白天25℃，夜間18℃，相對濕度50%和光周期16∶8（光照∶黑暗）。接種病毒以后，N.benthamiana置于溫度18℃的植物生長箱，濕度和光周期不變。馬鈴薯品種‘大西洋’‘中薯5號’和‘Favorita’組培苗在16℃無菌操作間培養(yǎng)，組培苗移至土里后在23℃的植物生長箱中，相對濕度50%和光周期16∶8。

1.2.2 植物總RNA提取

采用普洛麥格（北京）生物技術有限公司的Eastep?Super總RNA提取試劑盒進行，具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。

1.2.3 引物設計

從GenBank下載已報道的PMTV全基因組序列，用Clustal Omega[12]進行多序列比對，根據(jù)比對結果在保守位置設計引物（表1）。

1.2.4 cDNA合成、PCR擴增與克隆

反轉錄采用南京諾唯贊生物科技股份有限公司HiScriptⅢ1stStrand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper），具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。PCR擴增采用50 μL體系，包括25 μL的2×Phanta高保真DNA聚合酶（用于目的片段擴增）或2×Taq Plus Master Mix（用于菌落鑒定），10 mmol/L上下游引物各1 μL，cDNA 1 μL。PCR程序設為95℃預變性3 min，30個熱循環(huán)（95℃變性30 s，60℃退火15 s，72℃延伸時間為：15 s每1 kb），72℃延伸7 min。pCB301-2μ-HDV載體的線性化PCR后，加入1 μLDpnI（NEB北京有限公司），混勻，37℃處理1 h，以降解模板質粒。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit回收擴增片段，回收的片段插入北京全式金（Transgen）生物技術有限公司pEASY-Blunt Zero載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，PCR鑒定陽性菌落，用南京諾唯贊生物科技股份有限公司的FastPure Plasmid Mini Kit提取質粒，并送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定，每個擴增片段最少測序4個克隆。

1.2.5 序列分析

克隆的DNA片段用Lasergene DNAstar7.0軟件包（DNAstar公司）Seqman Pro7.1.0進行拼接，用Seqbuilder Pro7.1.0進行ORF預測和蛋白翻譯。系統(tǒng)進化樹采用MEGA-X軟件中的最大似然法（Maximum-likelihood method），分支支持率采用1 000次重復檢測。

1.2.6 酵母同源重組

將線性化的pCB301-2μ-HDV載體與目的片段以等摩爾比混合后，用北京酷來搏科技有限公司的畢赤酵母感受態(tài)制備與轉化試劑盒轉化酵母。轉化產(chǎn)物經(jīng)低速離心后，全部涂布于缺色氨酸的SD固體培養(yǎng)基，用Parafilm封好口后，倒置于30℃培養(yǎng)2～4 d。

1.2.7 酵母質粒提取

采用北京酷來搏科技有限公司酵母質粒小提試劑盒進行，具體操作根據(jù)產(chǎn)品說明書進行。

1.2.8 農(nóng)桿菌轉化與侵染

將pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3通過電擊法分別轉入農(nóng)桿菌GV3101。取15 μL轉化產(chǎn)物，涂布于含有50 μg/mL卡那霉素（Kanamycin）和50 μg/mL利福平（Rifampicin）的LB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)2 d；挑取單克隆進行菌落PCR驗證。用槍頭將含有正確質粒的農(nóng)桿菌用牙簽接種于3 mL含有50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL利福平的LB液體培養(yǎng)基中，28℃搖床中120 r/min過夜培養(yǎng)；室溫下，9 000 r/min離心1 min收集菌體。用1 mL浸潤緩沖液（10 mmol/L MES，pH 5.6；10 mmol/L MgCl2；100 μmol/L乙酰丁香酮）懸浮菌體，9 000 r/min離心1 min收集菌體；再用1 mL浸潤緩沖液懸浮與離心一次，用可見分光光度計將農(nóng)桿菌稀釋至OD600=0.5；取等量含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌懸浮混勻后，用1 mL無針頭注射器注射接種本氏煙草與馬鈴薯葉片。

2 結果與分析

2.1 全基因組克隆與同源性分析

研究所用的馬鈴薯塊莖品種未知，內(nèi)部呈現(xiàn)壞死弧紋癥狀，經(jīng)ELISA檢測為PMTV陽性。根據(jù)GenBank中PMTV的序列設計表1引物以擴增該PMTV分離物的全基因組。經(jīng)克隆、測序和拼裝發(fā)現(xiàn)該PTMV的RNA1全長6 042 nt，RNA2全長3 134 nt，RNA3全長2 964 nt（GenBank序列號為OP221272-OP221274）。RNA1-3的編碼框與報道完全一致，但RNA3編碼的CRP前兩個密碼子分別為GTG和GTG。分析發(fā)現(xiàn)，GenBank中所有33條PMTV全長RNA3僅有3個PMTV分離物（Sw、Yunnan和C52_P11）編碼CRP的第二個密碼子為ATG，而非GTG，因此CRP可能通過非ATG起始翻譯。將本PMTV的RNA1、RNA2和RNA3分別與GenBank數(shù)據(jù)庫中不同PMTV分離物的相應RNA片段進行多序列比對，并分析計算同源性。結果發(fā)現(xiàn)，本PMTV的RNA1與RNA2和中國Yunnan分離物的核苷酸同源性最高，分別為99.80%和99.90%，RNA3與哥倫比亞的CO3核苷酸同源性最高，為99.90%（表2）。

表2 河北分離物與其他分離物核苷酸序列同源性Table 2 Nucleotide sequence identities between Hebei and other PMTV isolates

2.2 系統(tǒng)進化分析

為明確該PMTV分離物與其他PMTV分離物的系統(tǒng)進化關系，從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載了所有PTMV RNA1、RNA2和RNA3全長序列（表1），并構建了RNA1、RNA2以及RNA3的最大似然系統(tǒng)進化樹。結果發(fā)現(xiàn)，PMTV的RNA1可明顯分為兩個分支，本PMTV分離物的RNA1處于第一個分支中，與PMTV云南分離物關系最近（圖1A）；RNA2分為三個分支，絕大多數(shù)分離物處于第一分支，而分支III僅包括秘魯?shù)腏20_J203一個分離物，本PMTV分離物的RNA2處于第一個分支中，與中國Yunnan、日本Hiroshima、丹麥54-8、54-11、54-21以及54-26聚于同一小分支（圖1B）；RNA3分為四個分支，分支III包括瑞典Sw和云南分離物，而分支IV僅包括秘魯?shù)腏20_P157一個分離物，本PMTV分離物的RNA3處于第一個分支中，與丹麥Rn23分離物關系最近（圖1C）。

圖1 PMTV最大似然系統(tǒng)進化樹Figure 1 Maximum likelihood phylogenetic trees of PMTV

表1 試驗所用引物序列Table 1 Primers used in the study

2.3 侵染性克隆構建

根據(jù)PMTV RNA1、RNA2和RNA3的5′和3′最末端非編碼區(qū)的保守序列，設計引物以直接擴增RNA2和RNA3全長序列，RNA1分為2個約3 000 bp的片段（分別記為RNA1-F1和RNA1-F2）擴增（圖2A）。用引物RZ-F和CaMV 35S-R，以pCB301-2μ-HDV為模板，進行PCR擴增，獲得線性化的pCB301-2μ-HDV載體（圖2A）。所有片段兩端與載體含有20 bp左右的同源臂。將線性化的pCB301-2μ-HDV載體分別與RNA2、RNA3、以及RNA1-F+RNA1-F2共轉化酵母。用引物35SF和RNA1-5360R對隨機選擇的15個轉化RNA1-F+RNA1-F2的酵母克隆進行菌落PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)有6個克隆能擴增到5 000 bp大小的目的條帶（圖2B），用引物RNA2-620F和NOS-R對隨機選擇的15個轉化RNA2的酵母克隆進行菌落PCR檢測，結果表明其中有5個克隆能擴增到2 500 bp左右的目的條帶（圖2C），用引物RNA3-800F和RNA3-2200R對隨機選擇的15個轉化RNA3的酵母克隆進行菌落PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)有13個克隆能擴增到1 400 bp左右的目的條帶（圖2D）。分別選取PCR擴增條帶最亮的3個克隆，提取酵母質粒，直接轉化E.coliDH5α。經(jīng)再次菌落PCR驗證后，提取質粒送于公司測序，獲得含有PMTV河北省馬鈴薯分離物RNA1、RNA2和RNA3的質粒，并命名為pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTV-RNA2和pCB301-PMTV-RNA3。

圖2 PMTV侵染性cDNA克隆的構建Figure 2 Construction of PMTV infectious cDNA clone

2.4 PMTV侵染性克隆在本氏煙上的侵染性測定

用本氏煙驗證所構建PMTV侵染性克隆的活性。將含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTVRNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌菌液等比例混合后，注射6株4周大小的本氏煙。接種后9 d時，本氏煙的系統(tǒng)葉片開始出現(xiàn)褪綠癥狀，隨著時間的延長，癥狀逐漸加重，并出現(xiàn)明顯的花葉和葉片輕微皺縮的癥狀（圖3A）。在接種14 d，采集本氏煙帶有癥狀的葉片，提取總RNA，分別用引物RNA1-730F+RNA1-5360R、RNA2-620F+RNA2-2800R、RNA3-800F+RNA3-2200R進 行RT-PCR，以 檢 測RNA1、RNA2和RNA3。RT-PCR結果顯示，在6株本氏煙葉片中均可以檢測到病毒RNA1、RNA2和RNA3的存在（圖3B～D），表明PMTV的侵染效率達到100%（圖3B～D）。

圖3 PMTV侵染性cDNA克隆在本氏煙上的侵染性測定Figure 3 Infectivity analysis of PMTV infectious cDNA clone on N.benthamiana

2.5 PMTV侵染性克隆在馬鈴薯上的侵染性測定

將含有pCB301-PMTV-RNA1、pCB301-PMTVRNA2和pCB301-PMTV-RNA3的農(nóng)桿菌菌液等比例混合后，分別注射‘大西洋’‘中薯5號’和‘Favorita’無毒組培苗（每個品種各6株），以進一步檢測PMTV侵染性克隆對馬鈴薯的侵染能力。接種20 d后，‘大西洋’葉片出現(xiàn)輕微的黃化，而‘費烏瑞它’和‘中薯5號’沒有明顯癥狀（圖4A）。接種20 d時，采集組培苗上部帶有癥狀的葉片，提取6株混合樣的總RNA，用引物RNA2-1230F與RNA2-2800R進行RT-PCR檢測，結果發(fā)現(xiàn)‘大西洋’中可以擴增到PMTV RNA2的目的片段，而‘費烏瑞它’和‘中薯5號’中不能擴增到預期大小的目的片段（圖4B）。分別提取接種PMTV的6株‘大西洋’總RNA，用引物RNA2-1230F與RNA2-2800R進行RT-PCR檢測，以分析PMTV的侵染效率。結果發(fā)現(xiàn)4株‘大西洋’可以檢測到病毒的存在，發(fā)病率為66.67%（圖4C）。

圖4 PMTV侵染性cDNA克隆在馬鈴薯上的侵染性測定Figure 4 Infectivity analysis of PMTV infectious cDNA clone on potato

3 討論

本研究從一個采自河北省張北縣的馬鈴薯薯塊上克隆了一株PMTV的全基因組序列，多序列比對和系統(tǒng)進化樹分析表明，PMTV的RNA1與此前報道一致分為兩個分支[13,14]，RNA2分為3個分支，該分離物的RNA1與RNA2均與國內(nèi)報道的云南分離物關系最近，說明本研究所用馬鈴薯上的PMTV有可能通過云南與河北之間的種薯調運而來，但還需進一步研究確定。值得注意的是，系統(tǒng)進化分析發(fā)現(xiàn)該分離物的RNA3與來自瑞典的Rn23關系最近而與云南馬鈴薯分離物的進化關系較遠，說明本試驗克隆的PMTV的RNA3曾與其他分離物的RNA3發(fā)生過重配，但是重配發(fā)生的時間及地點未知。

PMTV侵染性克隆之前已有報道[15]。本試驗構建的PMTV侵染性克隆與之相比，具有不需要依賴于體外轉錄的優(yōu)點。此外，本侵染性克隆來自于中國本土發(fā)生的帶病馬鈴薯，而不是PMTV代表株系Sw。侵染性試驗表明本分離在本氏煙上造成花葉的癥狀，而Sw造成黃花葉的癥狀[15]，說明兩者在致病性方面存在明顯差異。馬鈴薯侵染試驗表明，在本試驗的條件下，該侵染性克隆能侵染‘大西洋’，但不能引起明顯的癥狀，也不能侵染‘中薯5號’與‘費烏瑞它’，說明本侵染性克隆在不同的馬鈴薯品種上侵染力不同。溫度在PMTV致病過程中具有重要的作用，低溫有利于病癥的發(fā)展和顯現(xiàn)[16]。本研究未能在‘大西洋’上觀察到癥狀，可能是由于溫度等條件所限。而不能侵染‘中薯5號’與‘費烏瑞它’的原因未知，還需進一步試驗驗證。

PMTV為三分體病毒，成功侵染需要3條RNA在同一細胞表達。本試驗所構建的侵染性克隆雖然在本氏煙上實現(xiàn)100%的侵染效率，但侵染‘大西洋’時只有66.67%（4/6）的侵染率，后續(xù)可考慮將病毒的兩條RNA整合到一個質粒中，以提高馬鈴薯的侵染效率。本試驗構建的侵染性克隆成功在煙草與馬鈴薯建立侵染，為進一步開展PMTV與寄主互作的研究，揭示其分子致病機制奠定基礎。