非小細胞肺癌腦轉移患者肺癌組織Nrf2基因和蛋白表達及對腦轉移預測價值

周壇雷，張淑平，趙振翔，趙 嬌，齊 光，李建峰

肺癌為全球范圍內癌癥死亡的首要原因，非小細胞肺癌(NSCLC)為肺癌最常見類型，發生率約為肺癌的80%，腫瘤局部復發或遠處轉移為影響NSCLC長期生存的首要原因，其中顱腦為NSCLC患者最常累及且最嚴重的轉移部位[1]。NSCLC患者腦轉移發生和發展十分隱蔽，出現癥狀后治療十分困難，因此判斷NSCLC腦轉移高發人群并找出預測腦轉移發生、發展的生物學指標，一方面可對高危人群進行預防以減少腦轉移的發生，另一方面可早期診斷腦轉移并及時進行治療以改善患者預后[2-3]。隨著醫學技術的不斷發展，人們對NSCLC的研究逐漸深入至基因遺傳組學和分子生物學，腫瘤標志物被廣泛應用于疾病診斷和預后評估中[4]。核轉錄因子紅系2相關因子2(Nrf2)是一種堿性亮氨酸拉鏈轉錄因子，可在氧化和外源性應激刺激下通過調節細胞適應性來保護細胞，維持細胞氧化還原穩態，其表達情況與惡性腫瘤發生和發展關系密切，但臨床關于其在NSCLC腦轉移中的表達及意義研究較少[5-6]。本研究對NSCLC腦轉移患者Nrf2基因和蛋白表達情況進行分析，探討其對NSCLC腦轉移患者的影響及預測價值。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 將我院2019年9月—2021年9月收治的NSCLC腦轉移65例作為腦轉移組，另將同期于我院治療的NSCLC非腦轉移65例作為非腦轉移組。納入標準：符合NSCLC診斷標準[7]，并經病理組織學確診；原發性NSCLC；腦轉移組經頭顱影像學檢查證實存在腦轉移；年齡≥18歲；簽署知情同意書。排除標準：伴有其他惡性腫瘤；合并嚴重心、肝、腎等功能障礙；免疫缺陷、血液系統疾病；有肺部手術史；合并嚴重肺源性心臟病、慢性支氣管炎等疾病。本研究獲我院醫學倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1基礎資料收集：收集入院時2組性別、年齡、腫瘤原發部位、病理類型、組織學分級、T分期、N分期資料。其中腫瘤原發部位包括主支氣管、肺上葉、肺中葉、肺下葉；病理類型分為腺癌、非腺癌(包括肺泡癌、低分化癌、大細胞癌、鱗癌、腺鱗癌等)；腫瘤分期參照美國癌癥聯合委員會(AJCC)的TNM分期手冊(第七版)[8]：T分期分為T1～T3期、T4期，N分期分為N0～N1期、N2～N3期。

1.2.2Nrf2基因和蛋白表達檢測：①應用患者入院時取得的肺癌病理組織，采用全基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)提取RNA，以熒光實時定量反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)擴增，試劑盒購自Takara公司，取擴增反應液5 μl，2%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，使用凝膠成像系統拍照，以Quantity One軟件分析圖像，比較各泳道PCR產物和β-actin光密度之比，作為Nrf2 mRNA表達量，核酸序列參照美國國家生物技術信息中心網站的人類基因參考序列，引物序列(5'-3')：上游：AGCCCAGCACATCCAGTCAG，下游：TGCATGCAGTCATCAAAGTACAAAG。②免疫組織化學法檢測Nrf2蛋白：患者入院時取肺癌組織，常規石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，置于烤箱中在60 ℃下烤片6 h，采用鏈霉素標記的辣根過氧化物酶和生物素標記的第2抗體及底物色素混合液測定組織中的抗原，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，滴加抗原修復液(北京索萊寶科技公司)，將一抗以適宜比例稀釋，滴加適量稀釋后一抗至組織切片上，放置4 ℃冰箱過夜，后于室溫37 ℃下孵育30 min，PBS沖洗3次，每次5 min，滴加二抗(武漢博士德生物有限公司)，37 ℃下孵育30～60 min，PBS沖洗3次，每次5 min，DAB(試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司,貨號:ZLI-9018)顯色5 min，光學顯微鏡下觀察組織切片，以半定量積分法分析切片結果，結果評分由著色強度水平和著色的陽性細胞數決定，著色強度：無染色為0分，淺黃色為1分，黃褐色為2分，棕黃色為3分；陽性細胞數：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。著色強度水平和著色的陽性細胞數相加所得為染色總分，總分1分為陰性，2～6分為陽性。

1.3觀察指標 比較2組入院時肺癌組織的Nrf2 mRNA和蛋白表達情況；分析Nrf2 mRNA對NSCLC患者發生腦轉移的預測價值；分析NSCLC患者發生腦轉移的危險因素。

2 結果

2.1基礎資料 2組性別、腫瘤原發部位、組織學分級比較差異無統計學意義(P>0.05)；腦轉移組年齡≥60歲、腺癌、T分期為T4期、N分期為N2～N3期、Nrf2蛋白陽性表達患者占比高于非腦轉移組，Nrf2 mRNA表達水平高于非腦轉移組(P<0.01)。見表1。

表1 腦轉移與非腦轉移NSCLC患者基礎資料比較

2.2Nrf2 mRNA預測NSCLC患者發生腦轉移的價值 經ROC曲線分析，Nrf2 mRNA預測NSCLC患者發生腦轉移的曲線下面積、敏感度、特異度分別為0.829、0.785、0.769。見圖1。

2.3NSCLC患者發生腦轉移的影響因素 將單因素分析差異有統計學意義的指標納入多因素Logistic回歸分析模型，行量化賦值，因變量為NSCLC患者是否發生腦轉移(是=1，否=0)，自變量為年齡(≥60歲=1，<60歲=0)、病理類型(腺癌=1，非腺癌=0)、T分期(T4期=1，T1～T3期=0)、N分期(N2～N3期=1，N0～N1期=0)、Nrf2 mRNA(≥1.149=1，<1.149=0)、Nrf2蛋白表達(陽性=1，陰性=0)。經多因素Logistic回歸分析，年齡≥60歲、腺癌、T分期為T4期、N分期為N2～N3期、Nrf2 mRNA≥1.149、Nrf2蛋白陽性表達是NSCLC患者發生腦轉移的危險因素(P<0.05,P<0.01)。見表2。

表2 NSCLC患者發生腦轉移的多因素Logistic回歸分析

3 討論

腦轉移瘤為成人最常見顱內腫瘤，其發病率約為顱內原發性腫瘤的4～5倍，腦轉移瘤三大原發性惡性腫瘤依次為肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤，而NSCLC患者中約有30%會發生腦轉移，該部分患者預后差，生存率低[9-12]。由于血腦屏障的存在，傳統化療藥物治療腦轉移瘤效果有限，放療成為腦轉移瘤主要治療方式，但患者生存時間仍不足1年，因此找到可預測NSCLC患者腦轉移發生和發展的指標，對臨床早期篩查、診斷和治療腦轉移瘤具有重要意義[13]。隨著醫療診斷技術的不斷發展，各種腫瘤標志物逐漸在臨床推廣應用，其不僅可用于NSCLC患者診斷和預后評估，而且在預測和治療腦轉移瘤中的應用價值也值得探討[14]。

本研究中，腦轉移組年齡≥60歲、腺癌、T分期為T4期、N分期為N2～N3期、Nrf2蛋白陽性患者占比高于非腦轉移組，Nrf2 mRNA表達水平高于非腦轉移組。提示上述因素可能為NSCLC患者發生腦轉移的影響因素。既往已有報道指出年齡為NSCLC患者發生腦轉移的獨立危險因素[15]。此外，NSCLC腺癌主要以浸潤式生長為主，且易出現血行轉移，中樞神經系統轉移發生率較高[16]；T分期、N分期越高的患者腫瘤細胞分化程度越低，惡性程度越高，癌細胞侵襲性越強，腦轉移可能性越高[17-18]。

Nrf2是細胞氧化應激反應中關鍵轉錄因子，可維持細胞氧化還原平衡穩態，形成細胞自我保護機制，發揮抗損傷效果，其高表達可降低細胞氧化應激和親電性應激導致的細胞損傷[19]；Nrf2可對抗腫瘤形成初期細胞內外壓力，在一定程度抑制細胞癌變，但腫瘤發生后，Nrf2異常活化，癌細胞可利用Nrf2對細胞的保護機制來排除惡性增殖過程中產生的有害物質，促進腫瘤細胞增殖，并幫助腫瘤細胞抵抗放化療造成的有毒有害物質，降低放化療效果[20]；Nrf2活性受胞質蛋白(Keapl)負調控，通常情況下Keap1功能區將泛素連接酶E3復合物與Nrf2結合，Nrf2活化后，Nrf2與Keapl解離進入細胞核，在核內與Maf蛋白形成異二聚體，后與抗氧化反應元件靶基因啟動子結合，調控下游Ⅱ相解毒酶和抗氧化蛋白表達，介導信號通路炎癥、癌細胞生存和增殖等病理過程，促進腫瘤發展[21]。也有研究指出Nrf2蛋白表達與腫瘤浸潤深度、臨床分期、病變直徑、組織分化具有明顯相關性，Nrf2高表達患者癌細胞增殖能力較強，侵襲程度較高，出現轉移風險較高[22]。

本研究多因素Logistic回歸分析證實，年齡≥60歲、腺癌、T分期為T4期、N分期為N2～N3期、Nrf2 mRNA≥1.149、Nrf2蛋白陽性表達是NSCLC患者發生腦轉移的危險因素。因此對具有上述特征的患者臨床應密切監測并及時進行干預，以降低腦轉移發生風險，控制患者病情發展。

綜上，年齡≥60歲、腺癌、腫瘤分期越高的NSCLC患者發生腦轉移風險越高，Nrf2 mRNA、Nrf2蛋白表達情況與腦轉移發生密切相關。