自噬在脂多糖誘導的A549細胞炎癥反應中的作用及機制研究

時佳 陶慧嫻 郭艷 鄒蕓蘇 王木子 盧志濤 丁溢芳 許衛東 周曉光

（1.南京醫科大學附屬兒童醫院新生兒醫療中心，江蘇南京 210008；2.張家港市第一人民醫院新生兒科，江蘇張家港 215600）

急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是機體在遭受各種病理刺激（如缺氧、感染、休克等）后發生的一種急性肺損傷（acute lung injury，ALI），是新生兒臨床常見的危重癥。其特征是肺泡-毛細血管膜屏障遭到破壞，從而增強炎癥細胞的遷移能力和促炎細胞因子的產生，使炎癥反應失控［1］。迄今為止，ARDS的發病率和病死率一直居高不下。因此，迫切需要闡明新生兒ARDS的發病機制以制訂相應的防治措施。

自噬是一種古老的、進化保守的細胞內消化和再循環途徑，主要包括巨自噬、微自噬和分子伴侶介導的自噬3種類型，對于維持細胞的正常功能及細胞穩態具有重要作用。巨自噬以其處理大型細胞內結構的能力著稱，雙膜囊泡結構的自噬體也成為其區別于另外兩種自噬形式的特征。自噬參與人類多種疾病的發生、發展過程，本研究主要對巨自噬（以下簡稱“自噬”）進行研究。自噬被認為是應對炎癥的一種基本細胞反應，其相關途徑（如微管相關蛋白輕鏈3相關吞噬作用和非常規分泌等）是免疫和炎癥的核心穩態機制［2］。一般來說，自噬有助于宿主激活免疫以控制感染，同時限制有害的、不受控制的炎癥反應。在先天免疫系統中，Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4） 是一種重要的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR），PRR 通過識別病原體相關分子模式或危險相關分子模式，調節先天免疫或炎癥過程［3］。TLR4 也是第1 個被證明參與自噬 過 程 的 受 體［4］。 TLR4 經 脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）激活后產生的細胞因子參與病原體的清除，對機體有益；但當該過程失調時，可能會導致危及生命的病理生理改變，如新生兒ARDS［5］。因此，TLR4 被認為是一個重要的藥理學靶點。目前有關自噬與新生兒ARDS發病關系的研究報道極少，自噬在新生兒ARDS炎癥反應所致肺損傷中的作用與機制尚不明了。本實驗利用LPS 誘導人肺泡上皮A549 細胞（簡稱“A549細胞”）炎癥反應來模擬新生兒ARDS發病過程中失控的炎癥反應與肺損傷變化，旨在探討自噬在炎癥反應導致肺損傷過程中的作用及其機制，為新生兒ARDS的防治提供新的途徑和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人肺泡上皮細胞株A549（上海中喬新舟生物科技有限公司）；DMEM 高糖培養基（Gibco，美國）；磷酸緩沖鹽溶液、內參β-actin（武漢賽維爾生物科技有限公司）；胎牛血清（PAN，德國）；LPS、兔抗LC3B、P62 抗體（Sigma，美國）；兔抗Beclin-1 抗體（Abcam，英 國）；兔抗NLRP3、TLR4抗體（北京博奧森生物技術有限公司）；兔抗Caspase-1、ASC 抗體、內參GAPDH（武漢三鷹生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG抗體（南京巴傲得生物科技有限公司）；3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）、雷帕霉素（rapamycin，RAPA）（MCE，美國）；CCK-8 試劑盒 （Dojindo， 日 本）； LipofectamineTM2000（Invitrogen Life Technologies，美國）；人源TLR4 過表達載體質粒、TLR4 siRNA（均由南京銳博生物科技有限公司設計）；RIPA裂解液（上海碧云天生物技術有限公司）。

1.2 A549細胞培養及實驗分組

向人肺泡上皮細胞株A549 細胞中施加含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養基，置于37℃、5%CO2的培養箱中培養。當細胞密度長至90%后棄培養液，磷酸緩沖鹽溶液清洗2 次，以0.25%EDTA 胰酶消化細胞，調整細胞密度接種于細胞培養板中，培養至細胞穩定貼壁。

（1）濃度梯度分組：加入不同濃度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS 工作液，刺激12 h；時間梯度分組：加入濃度為1 μg/mL 的LPS 工作液，刺激不同的時間（0、4、8、12、24 h）。收樣前0.5 h加入三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）（濃度為5 mmol/L）。收集各組細胞沉淀，用于后續蛋白檢測。

（2）細胞自噬抑制實驗分為：對照組、LPS組、3-MA組、3-MA+LPS組。3-MA組和3-MA+LPS組加入濃度為5 mmol/L 的自噬抑制劑3-MA 與細胞共培養12 h。細胞自噬激動實驗分為：對照組、LPS 組、RAPA 組、RAPA+LPS 組。RAPA 組 和RAPA+LPS 組加入濃度為100 nmol/L 的自噬激動劑RAPA 與細胞共培養12 h。LPS 的處理濃度為1 μg/mL，處理時間為12 h。收樣前0.5 h加入ATP。收集各組細胞沉淀，用于后續蛋白檢測。

（3）細胞轉染實驗分兩部分，每部分各分4組：TLR4 過表達對照組、TLR4 過表達組、TLR4過表達對照+LPS 組、TLR4 過表達+LPS 組；TLR4沉默對照組、TLR4 沉默組、TLR4 沉默對照+LPS組、TLR4沉默+LPS組。

1.3 細胞轉染

將細胞接種至6 孔板中，待細胞密度長至40%～60%時進行轉染。轉染前2 h 對細胞進行換液。通過構建質粒載體過表達TLR4，使用siRNA沉默TLR4，針對質粒和siRNA 進行轉染工作液的配制：將4 μg 的TLR4 過表達/空載質粒DNA 和10 μL 濃 度 為20 μmol/L 的TLR4 siRNA 及 其 對 照siRNA 加至250 μL 的無血清培養基中，混勻，再將5～10 μL 的LipofectamineTM2000 加至另外250 μL的無血清培養基中，混勻，室溫靜置5 min，再將兩者混合，室溫靜置20 min。從每孔中吸出500 μL培養基棄去，再按每孔500 μL 將上述配制的混合液加入，混勻，4～6 h 后換液，轉染48 h。收樣前0.5 h 加入ATP（濃度為5 mmol/L）。收集各組細胞沉淀，用于后續蛋白檢測。

1.4 CCK-8法檢測細胞存活率

將細胞接種于96孔板中培養12～24 h。以濃度為0、1、5、10 μg/mL 的LPS 刺激12 h；以濃度為1 μg/mL的LPS分別刺激0、4、8、12、24 h，收樣前0.5 h 加入ATP，后每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，1～4 h 后應用酶標儀檢測450 nm 處各孔吸光度。實驗獨立重復3次。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

采用RIPA 裂解液提取細胞總蛋白，并經二喹啉甲酸法測定蛋白質濃度。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白后轉移到PVDF 膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別孵育相應抗體：微管相關蛋白1 輕鏈3B （microtubule associated protein 1 light chain 3 beta， MAP1LC3B， LC3B） 、 Beclin-1、 P62、NLRP3、Caspase-1、ASC、TLR4（均為1∶1 000配制），4℃過夜。TBST 洗膜（10 min×3 次），室溫 孵 育 二 抗 （1∶5 000） 1 h， TBST 洗 膜（10 min×3 次），用ECL 發光劑熒光顯色，在化學發光凝膠成像系統曝光觀察蛋白條帶。以GAPDH（1∶5 000）或β-actin（1∶1 000）作為內參，分析各條帶灰度值。實驗獨立重復3次。

1.6 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 進行分析和統計。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用兩樣本t檢驗，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LPS刺激對A549細胞存活率的影響

在培養的A549 細胞中以不同濃度（0、1、5、10 μg/mL） 的LPS 刺 激12 h， 與0 μg/mL 組（100.0%±0.0%） 相 比， 1 μg/mL 組（86.0%±1.2%），5 μg/mL組（72.8%±1.9%）和10 μg/mL組（63.6%±1.0%）的細胞存活率隨LPS 濃度的增加逐漸降低；以1 μg/mL的LPS在A549細胞中刺激不同 的 時 間（0、4、8、12、24 h），與0 h 組（100.0%±0.0%） 相比，細胞存活率在4 h 組（97.67%±0.23%）、8 h 組（94.21%±0.65%） 及12 h 組（95.15%±0.59%）僅有輕微降低，24 h 組（72.33%±1.59%）則明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 不同LPS 的刺激濃度和時間對A549 細胞存活率的影響

2.2 LPS對A549細胞炎癥水平的影響

在培養的A549 細胞中以不同濃度（0、1、5、10 μg/mL） 的LPS 刺 激12 h，炎 癥 指 標NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表達水平在1 μg/mL組升高并達到高峰，與0 μg/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；以1 μg/mL 的LPS 在A549 細胞中刺激不同的時間（0、4、8、12、24 h），炎癥指標NLRP3、Caspase-1 和ASC 蛋白表達水平均在12 h組升高并達到高峰，與0 h組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2及表1～2。

圖2 LPS對A549細胞炎癥蛋白表達的影響

2.3 LPS對A549細胞自噬水平的影響

在培養的A549 細胞中以不同濃度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS 刺激12 h，自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和P62 的表達水平均在1 μg/mL 組升高并達到高峰，與0 μg/mL組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）；以1 μg/mL 的LPS 在A549 細胞中刺激不同的時間（0、4、8、12、24 h），自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和P62 的表達水平均在12 h組升高并達到高峰，與0 h組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3及表1～2。

圖3 LPS對A549細胞自噬相關蛋白表達的影響

表1 不同濃度LPS刺激各組炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

表1 不同濃度LPS刺激各組炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

注：a示與0 μg/mL組比較，P＜0.05。

組別NLRP3 Caspase-1 ASC LC3B-Ⅱ/ⅠBeclin-1 P62 0 μg/mL組1 μg/mL組5 μg/mL組10 μg/mL組F值P值0.557±0.006 96.67＜0.001 0.848±0.038a 24.16＜0.001 0.603±0.112 5.26 0.027 4.592±0.115 5.40 0.025 1.090±0.088 4.70 0.036 0.636±0.098 6.78 0.014 0.945±0.011 1.046±0.022a 0.774±0.035 0.546±0.026 1.033±0.051a 0.552±0.069 0.836±0.016 1.113±0.044a 0.917±0.138 4.371±0.509 6.395±0.036a 5.277±0.583 1.158±0.037 1.464±0.085a 1.293±0.083 0.880±0.031 1.258±0.044a 0.859±0.164

表2 LPS刺激不同時間各組炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

表2 LPS刺激不同時間各組炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

注：a示與0 h組比較，P＜0.05。

組別NLRP3 Caspase-1 ASC LC3B-Ⅱ/ⅠBeclin-1 P62 0 h組4 h組8 h組12 h組24 h組F值P值6.07 0.010 5.37 0.014 10.92 0.001 5.95 0.010 3.97 0.035 8.41 0.003 0.60±0.07 0.75±0.09 0.76±0.04 1.07±0.04a 0.72±0.10 0.475±0.005 0.661±0.105 0.643±0.092 1.002±0.123a 0.577±0.046 0.435±0.066 0.502±0.109 0.672±0.058 0.949±0.022a 0.815±0.028a 2.653±0.213 3.033±0.624 2.986±0.543 5.079±0.182a 4.146±0.306a 0.789±0.053 0.750±0.121 0.978±0.038a 1.045±0.036a 0.779±0.047??0.537±0.119 0.949±0.070a 1.110±0.077a 1.263±0.018a 0.928±0.136

2.4 LPS對A549細胞TLR4蛋白表達水平的影響

在培養的細胞中以不同濃度（0、1、5、10 μg/mL）的LPS 刺激12 h，TLR4 蛋白表達水平在1 μg/mL 組（0.585±0.054）升高并達到高峰，與0 μg/mL 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）；以1 μg/mL 的LPS 在A549 細胞中刺激不同的時間（0、4、8、12、24 h），TLR4 蛋白表達水平在12 h組（1.090±0.031）升高并達到高峰，與0 h 組比較，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。

圖4 LPS對A549細胞TLR4蛋白表達的影響

2.5 自噬對炎癥的影響

2.5.1 自噬抑制劑3-MA對炎癥及自噬相關蛋白表達水平的影響 在自噬抑制劑3-MA 的處理下，自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達水平明顯降低，P62 蛋白表達水平明顯升高；而炎癥指標NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平明顯升高，與對照組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。經LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，3-MA+LPS 組自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達仍呈降低趨勢，P62蛋白表達進一步升高；炎癥指標NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平則進一步升高，與LPS組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖5和表3。

表3 自噬抑制劑3-MA干預后炎癥及自噬蛋白表達的比較 （±s，n=3）

表3 自噬抑制劑3-MA干預后炎癥及自噬蛋白表達的比較 （±s，n=3）

注：a示與對照組比較，P＜0.05；b示與LPS組比較，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［3-MA］3-甲基腺嘌呤。

組別對照組LPS組3-MA組3-MA+LPS組F值P值NLRP3 0.604±0.050 0.825±0.008a 0.956±0.108a 1.201±0.032b 16.29 0.001 Caspase-1 0.616±0.015 0.855±0.029a 0.687±0.006a 1.030±0.040b 50.51＜0.001 ASC 0.395±0.045 0.806±0.075a 0.839±0.109a 1.194±0.060b 18.35＜0.001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ1.109±0.036 1.317±0.057a 0.645±0.073a 0.926±0.055b 25.28＜0.001 P62 0.790±0.120 1.210±0.046a 1.550±0.064a 1.497±0.088b 17.10＜0.001

2.5.2 自噬激動劑RAPA對炎癥及自噬相關蛋白表達水平的影響 在自噬激動劑RAPA 的處理下，自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平明顯升高，P62蛋白表達水平明顯降低；而炎癥指標NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平明顯降低，與對照組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05）。經LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，RAPA+LPS 組自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達進一步升高，P62蛋白表達則仍然是降低的；炎癥指標NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表達水平仍呈降低趨勢，與LPS組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖5和表4。

表4 自噬激動劑RAPA干預后炎癥及自噬蛋白表達的比較 （±s，n=3）

表4 自噬激動劑RAPA干預后炎癥及自噬蛋白表達的比較 （±s，n=3）

注：a示與對照組比較，P＜0.05；b示與LPS組比較，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［RAPA］雷帕霉素。

組別對照組LPS組RAPA組RAPA+LPS組F值P值NLRP3 0.525±0.057 0.735±0.022a 0.143±0.017a 0.358±0.013b 59.26＜0.0001 Caspase-1 0.795±0.031 0.948±0.018a 0.570±0.075a 0.573±0.085b 9.61 0.005 ASC 0.722±0.027 0.944±0.027a 0.247±0.038a 0.349±0.065b 58.79＜0.0001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ2.111±0.078 4.845±0.446a 11.700±0.507a 8.001±0.621b 80.56＜0.0001 P62 0.906±0.026 1.066±0.029a 0.432±0.109a 0.452±0.142b 12.29 0.0023

圖5 自噬抑制劑/激動劑對炎癥及自噬蛋白表達的影響

2.5.3 自噬抑制/激動劑對TLR4 蛋白表達水平的影響 在自噬抑制劑3-MA 的處理下，3-MA 組（0.531±0.036）較對照組（0.325±0.042）TLR4蛋白表達上調；經LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，3-MA+LPS 組（0.620±0.018）較LPS 組（0.475±0.032）TLR4蛋白表達水平進一步增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；在自噬激動劑RAPA 的處理下，RAPA 組（0.392±0.088）較對照組（0.825±0.039） TLR4 蛋白表達下調；經LPS （1 μg/mL，12 h）刺激后，RAPA+LPS 組（0.445±0.129）較LPS 組（1.003±0.046）TLR4 蛋白表達水平降低，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖6。

圖6 自噬抑制/激動劑對TLR4 蛋白表達的影響

2.6 TLR4對A549細胞炎癥及自噬水平的影響

2.6.1 過表達TLR4 對A549 細胞炎癥及自噬水平的影響 過表達TLR4 后，自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達明顯降低，P62蛋白表達明顯升高；炎癥指標Caspase-1、ASC 的蛋白表達水平呈升高趨勢，與TLR4過表達對照組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。 經LPS （1 μg/mL， 12 h） 刺 激 后，TLR4過表達+LPS組自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達仍是降低的，P62蛋白表達則進一步升高；炎癥指標Caspase-1、ASC 蛋白表達水平進一步升高，與TLR4過表達對照+LPS組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖7和表5。

表5 TLR4過表達后炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

表5 TLR4過表達后炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

注：a示與TLR4過表達對照組比較，P＜0.05；b示與TLR4過表達對照+LPS組比較，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［TLR4］Toll樣受體4。

組別TLR4過表達對照組TLR4過表達組TLR4過表達對照+LPS組TLR4過表達+LPS組F值P值TLR4 0.552±0.014 0.634±0.020a 0.951±0.072a 1.236±0.056b 44.39＜0.001 ASC 0.662±0.017 0.920±0.089a 0.739±0.013a 0.980±0.063b 7.29 0.011 Caspase-1 0.425±0.030 0.512±0.009a 0.623±0.063a 0.869±0.048b 20.40＜0.001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ6.075±0.321 4.962±0.196a 7.597±0.433a 5.153±0.519b 9.68 0.005 P62 0.198±0.004 0.233±0.008a 0.843±0.046a 1.011±0.033b 211.90＜0.001

圖7 TLR4 過表達/沉默對A549 細胞中炎癥及自噬蛋白表達的影響

2.6.2 沉默TLR4 對A549 細胞炎癥反應及自噬水平的影響 沉默TLR4 后，自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達升高，P62 蛋白表達下降；而炎癥指標Caspase-1、ASC 蛋白表達水平明顯降低，與TLR4沉默對照組比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。經LPS（1 μg/mL，12 h）刺激后，TLR4 沉默+LPS組自噬相關蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達進一步升高，P62蛋白表達水平降低；炎癥指標Caspase-1、ASC的蛋白表達水平進一步降低，與TLR4 沉默對照+LPS 組比較，差異均具有統計學意義（P＜0.05），見圖7和表6。

表6 TLR4沉默后炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

表6 TLR4沉默后炎癥及自噬相關蛋白表達的比較 （±s，n=3）

注：a示與TLR4沉默對照組比較，P＜0.05；b示與TLR4沉默對照+LPS組比較，P＜0.05。［LPS］脂多糖；［TLR4］Toll樣受體4。

組別TLR4沉默對照組TLR4沉默組TLR4沉默對照+LPS組TLR4沉默+LPS組F值P值TLR4 0.831±0.038 0.563±0.087a 0.990±0.040a 0.756±0.062b 8.63 0.007 Caspase-1 1.024±0.026 0.900±0.023a 1.107±0.009a 0.982±0.042b 9.93 0.005 ASC 0.612±0.037 0.369±0.058a 0.794±0.037a 0.560±0.026b 18.07＜0.001 LC3B-Ⅱ/Ⅰ4.185±0.155 8.890±1.185a 11.660±0.723a 30.010±5.661b 15.05 0.001 P62 0.842±0.009 0.699±0.020a 0.997±0.040a 0.765±0.031b 21.75＜0.001

3 討論

ALI/ARDS 的病理生理特點是破壞肺泡毛細血管膜屏障，導致過度炎癥反應和肺功能障礙［6］。因此，抑制炎癥對ALI/ARDS 至關重要。LPS 是革蘭陰性菌細胞壁的主要成分，可刺激機體產生一系列炎癥反應。特別是當LPS影響肺部時，會誘發ALI，嚴重時可發展為ARDS。因此，LPS被廣泛用于ALI/ARDS臨床相關動物或細胞模型的建立［7-8］。Ⅱ型肺泡上皮細胞的炎癥損傷是ALI/ARDS發病過程中的主要病理生理變化，LPS暴露可導致這一變化［9］。而人肺泡上皮細胞株A549 與Ⅱ型肺泡上皮細胞特征最為相似，是體外構建ALI/ARDS炎癥模型使用最為廣泛的細胞系［10-11］。因此，本實驗采用A549 細胞培養模擬LPS 誘導的炎癥反應及肺損傷，是常用的替代原代細胞培養的方法。

在 本 研 究 中，A549 細 胞 經LPS （1 μg/mL，12 h）刺激后，炎癥指標NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表達水平均升高并達到高峰。這些結果表明由LPS 誘導的A549 細胞炎癥反應模型成功建立。同樣條件下，自噬指標LC3B-Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1 和P62蛋白表達水平也升高達到高峰，這表明LPS雖然誘導自噬產生，但自噬流受到阻滯。自噬過程涉及幾個步驟：啟動和成核、擴增、自噬體形成、自噬體-溶酶體融合和降解。成核階段磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）復合物的核心成分Beclin-1被激活以調節自噬體的大小和數量［12］。成核后，LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺結合，形成僅在成熟的自噬體上表達的LC3-Ⅱ形式。LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉化的增加是自噬體形成的指標［13］。自噬體與溶酶體的融合是自噬貨物降解的關鍵事件［14］。P62/SQSTM1作為一種機制來傳遞泛素化的蛋白質，通過與LC3相互作用靶向物質于自溶酶體處降解［15］。當自噬被抑制時P62 會積累，而當自噬被誘導時可以觀察到P62 水平降低。因此，P62常用作研究動態自噬流的標志物。自噬流始于自噬體的形成，并以溶酶體的底物降解結束，LC3B 代表自噬流啟動，而P62 代表自噬流終止，完整通暢的自噬流才能使自噬真正發揮作用，達到降解物質的目的。本研究CCK-8 實驗結果顯示，LPS濃度過高或者刺激時間過長都會對細胞造成較大的損害，影響各實驗指標的表達。因此，結合上述實驗結果，我們認為1 μg/mL 濃度的LPS 刺激12小時是誘導A549細胞炎癥反應模型，探究自噬作用的最適條件。

為進一步探究自噬和炎癥反應之間的關系，我們選擇在細胞模型上調節自噬來觀察炎癥反應的變化。3-MA 是一種PI3K 抑制劑，通過阻止PI3KC3與beclin-1結合形成自噬體來抑制自噬，是常用的自噬抑制劑。RAPA通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）復合物的活性來激活自噬，是常用的自噬激動劑。在3-MA（5 mmol/L，12 h）的處理下，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達減少，P62表達增加，自噬受到抑制且自噬流受阻，而炎癥指標NLRP3、Caspase-1和ASC蛋白表達水平升高；在此基礎上，LPS的刺激使P62蛋白表達水平進一步升高，自噬流進一步受到阻滯，同時，NLRP3、Caspase-1 和ASC 蛋白表達水平也進一步升高。而當RAPA 激活自噬后，自噬流恢復通暢，炎癥反應減輕。這些結果說明自噬流對炎癥反應起到負調控的作用。這與許多研究結果一致，表明維持正常的自噬流具有潛在的抗炎作用，比如谷胱甘肽S-轉移酶P1 通過抑制PI3K-Akt-mTOR通路促進自噬流通暢對LPS誘導的炎癥反應發揮保護作用［16］；雌激素相關受體α 通過增加自噬流和控制宿主腸道微生物群來改善結腸炎癥反應，從而充當腸道穩態的關鍵調節劑［17］；LPS可誘導自噬流阻塞而促發炎癥反應，褪黑激素通過促進自噬流而具有有效的抗炎作用［18］。這也說明，維持一定水平的自噬是必要的，自噬在炎癥反應中可起到一定的細胞保護作用。

TLR4被稱為自噬的環境傳感器［19］。在本研究中，LPS的刺激和3-MA的自噬阻斷均可引起TLR4蛋白表達上調，而RAPA 的自噬激活則引起TLR4蛋白表達下調。為了確定TLR4對自噬及炎癥反應的影響，我們使用TLR4 過表達/空載質粒和針對TLR4的siRNA/陰性對照siRNA轉染A549細胞，用LPS 處理細胞并評估自噬流。研究結果顯示，TLR4過表達組，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達減少，P62表達升高，自噬水平降低，自噬流阻滯；TLR4 沉默組，LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達升高，P62表達減少，自噬水平升高，自噬流通暢，表明TLR4對自噬流具有負調控作用。在LPS 的刺激下，TLR4 過表達+LPS 組LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達仍是降低的，P62表達則進一步升高，自噬流進一步受到阻滯；而沉默TLR4+LPS組自噬水平進一步升高，自噬流通暢，說明LPS 經TLR4 對自噬流具有負調控作用。同時我們發現，當自噬流阻滯時，炎癥反應進一步升高；當自噬流通暢時，炎癥反應減輕。自噬被認為是炎癥反應的主要負調節因子［20］。本研究證明TLR4介導自噬流在LPS 誘導的A549 細胞炎癥反應中發揮負調控作用。自噬對細胞的保護作用是建立在自噬流通暢的基礎上，自噬流的通暢性抑制了LPS引起的炎癥級聯反應，這可能為ARDS有效的抗炎治療提供一種新方法。

本實驗仍有不足之處。在細胞系選擇方面，沒有使用原代肺泡上皮細胞，研究的借鑒意義相對受限，另外尚未進行在體動物實驗驗證，有待下一步深入研究。自噬流的檢測方法除了免疫印跡法，還有自噬mRFP-GFP-LC3雙標示蹤法等，均有待后續補充。本研究中，我們對自噬的研究著眼于自噬流這一關鍵點，初步闡述自噬對ARDS中炎癥反應的調控機制，這可能僅僅是自噬復雜調控網絡中的一小部分，關于肺上皮細胞自噬的上游信號或調節因子我們依然知之甚少。自噬在肺損傷中扮演著“雙刃劍”的角色，值得我們進行更多地探索。新生兒作為一個特殊的階段，新生兒疾病的防治一直在不斷更新與完善。通過自噬來了解和重新認識新生兒ARDS是一個新角度，可能為新生兒ARDS防治找到新的突破口，為降低新生兒疾病的發生率、病死率等作出貢獻。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。