MicroRNA-196a靶向調節HDAC9對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

李華峰 張廣鳳 張旭 鞠文文 王婧婷 吳桐

1.深圳大學附屬華南醫院內分泌與代謝病科，廣東 深圳 518111 2.深圳市第三人民醫院放射科，廣東 深圳 518111 3.中山市人民醫院內分泌與代謝病科，廣東 中山 528402 4.齊齊哈爾醫學院附屬第三醫院內分泌與代謝病科，黑龍江 齊齊哈爾 161000 5.齊齊哈爾醫學院精神衛生學院，黑龍江 齊齊哈爾 161000

骨質疏松由機體骨量減少所致，是導致老年人骨折及骨折后不愈合的重要原因[1]，因此，探究成骨細胞介導的骨形成機制，有利于尋找促進骨形成的有效策略。成骨細胞在成骨分化過程中表現出各種特征，包括堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性增加，細胞外基質合成增加，礦化程度增加等[2]。這些過程涉及多種基因的激活或抑制，MicroRNA(miRNA)是單鏈小RNA，通過介導mRNA降解或翻譯抑制實現對靶基因表達的抑制[3]，敲除miRNA生成所必需的Dicer酶，可顯著抑制骨祖細胞向成骨細胞分化，影響胚胎存活[4]。近期報道[5]稱miRNA-196a對成骨細胞的分化具有正向調節作用，然而具體機制待研究。本研究在Targetscan網站預測到組蛋白去乙酰化酶9(histone deacetylase 9，HDAC9)可能是miR-196a的靶基因，且已有研究顯示HDAC9抑制劑可通過改善內源性間充質干細胞的成骨能力，促進小鼠骨量恢復[6]，推測miR-196a可能靶向下調HDAC9表達，促進成骨分化。基于此，本研究采用miR-196a mimics和miR-196a inhibitor處理MC3T3-E1細胞，初步探究miR-196a在MC3T3-E1細胞成骨分化中與HDAC9的調控關系及作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1細胞：小鼠MC3T3-E1細胞，購自中國醫學科學院細胞資源中心。

1.1.2試劑：α-MEM培養基、胎牛血清(FBS)(Gibco公司)；地塞米松、甘油磷酸鈉、抗壞血酸(Sigma公司)；RNA試劑盒(Omega Bio-Tek公司)；反轉錄、TB Green?定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；miR-196a-mimics及miR-196a-mimics-NC、miR-196a-inhibitor及miR-196a-inhibitor-NC、pCMV-HDAC9及pCMV-HDAC9-NC(上海吉瑪公司)；礦化結節(茜素紅)染色試劑盒(碧云天)；ALP檢測試劑盒(日本WAKO公司)；Histone H3、Histone H3(acetyl K9)、Histone H3(acetyl K14)、Anti-Histone H3(acetyl K23)、HDAC9、Runt相關轉錄因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)、ALP、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、膠原蛋白 I(collagen I，COL1)抗體，(Abcam公司)；引物(上海生工公司)，等。

1.1.3儀器：定量PCR儀(ABI公司)；CO2培養箱、自動酶標儀(Thermo公司)；倒置顯微鏡(Olympus公司)；電儀及轉膜裝置(BioRad公司)，等。

1.2 方法

1.2.1細胞培養和分組：MC3T3-E1細胞采用α-MEM培養基+10 % FBS培養，隔天換液，取對數期細胞進行實驗。隨機分組為：對照組(control，Cont)組(未轉染，未誘導)、誘導組(未轉染，進行成骨誘導)、miR-196a-mimics-NC組(轉染miR-196a-mimics-NC后，進行成骨誘導)、miR-196a-mimics組(轉染miR-196a-mimics后，進行成骨誘導)、miR-196a-inhibitor-NC組(轉染miR-196a-inhibitor-NC后，進行成骨誘導)、miR-196a-inhibitor組(轉染miR-196a-inhibitor后，進行成骨誘導)、miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC組(共轉染miR-196a-mimics和pCMV-HDAC9-NC后，進行成骨誘導)，miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9組(共轉染miR-196a-mimics和pCMV-HDAC9后，進行成骨誘導)。采用α-MEM培養基+10 % FBS培養至MC3T3-E1細胞貼壁24 h后，換為無血清α-MEM培養基，使用Lipofectamine 3000試劑盒將RNA序列和或pCMV-質粒轉染進各組細胞中，6 h后更換α-MEM培養基+10 % FBS培養12 h，再加入10-7mol/L地塞米松、10 mmol/L甘油磷酸鈉和50 μg/L抗壞血酸[7]進行成骨誘導，培養72 h檢測。

1.2.2定量熒光PCR(qRT-PCR)檢測：使用RNA試劑盒提取MC3T3-E1細胞中總RNA。核酸檢測儀分析A260/A280比率和RNA質量后，反轉錄合成cDNA。按照TB Green?PCR試劑盒說明書分別對miR-196a和HDAC9進行qRT-PCR擴增，讀取各基因和內參的循環數(Ct值)，以GAPDH和U6為內參根據2-ΔΔCt公式計算HDAC9和miR-196a的表達量。miR-196a F：5’-UAGCAGCACAGAAAUAUU GGC-3’，miR-196a R：采用mRQ 3’引物；U6 F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、U6 R：5’-AACGCTT CACGAATTTGCG-3’；HDAC9 F：5’-TGCATCGG AAGCCTGCATAA-3’、HDAC9 R：5’-CGGTCTCT GTCTCCTCTTGC-3’；GAPDH F：5’-GGAGAGTGTTT CCTCGTCCC-3’、GAPDH R：5’-ACTGTGCCGTT GAATTTGCC-3’。

1.2.3ALP活性檢測：收集1.2.1中MC3T3-E1細胞，加入150 μL曲拉通X裂解細胞，凍融兩次后離心收集上清。取20 μL上清樣品和100 μL底物緩沖液混勻，孵育15 min，加入100 μL終止液停止反應，震蕩混勻后測量405 nm處光密度(OD)，根據標準曲線計算ALP活性。

1.2.4礦化程度檢測：收集1.2.1中MC3T3-E1細胞，PBS清洗后加入2 mL 4 %甲醛固定20 min，換為1 mL茜素紅溶液染色15 min，吸取200 μL上述混合液加入96孔板，測量540 nm處OD值，礦化程度以相對OD表示。棄去剩余混合液后在倒置顯微鏡下拍照。

1.2.5雙熒光素酶報告實驗：構建包含miR-196a結合位點的HDAC9 3’UTR序列(WT)或其突變(MUT)的重組質粒，即為pGL3-HDAC9 3’UTR-WT和pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT。MC3T3-E1細胞分組為pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+mimics-NC組、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+mimics-NC組、pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+miR-196a mimics組、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+miR-196a mimics組，將pGL3-HDAC 3’UTR-WT或pGL3-HDAC 3’UTR-MUT與mimics-NC或miR-196a mimics共轉染至以上4組MC3T3-E1細胞中，6 h后換為α-MEM培養基+10 % FBS培養，48 h后測定熒光素酶活性，相對熒光素酶活性用海腎熒光素酶活性標準化。

1.2.6Western blot檢測：使用RIPA裂解液裂解1.2.1中各組MC3T3-E1細胞并提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取30 μg蛋白進行電泳，電轉印到PVDF膜，與5 %脫脂奶粉封閉液孵育后，加入1∶500或1∶1 000稀釋的HDAC9、GAPDH、ALP、Runx2、COL1、OPN、Histone H3、Histone H3(acetyl K9)、Histone H3(acetyl K14)、Anti-Histone H3(acetyl K23)抗體4 ℃過夜，換為1∶2 000稀釋的HRP標記二抗室溫孵育1 h，ECL發光液避光顯色后采集圖像并分析條帶灰度。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 miR-196a和HDAC9在MC3T3-E1細胞中表達情況

與Cont組相比，誘導組、miR-196a-mimics-NC組和miR-196a-inhibitor-NC組MC3T3-E1細胞中miR-196a表達增高(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)；與miR-196a-mimics-NC組和誘導組相比，miR-196a-mimics組MC3T3-E1細胞miR-196a表達增高(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表達降低(P<0.05)；與miR-196a-inhibitor-NC組和誘導組相比，miR-196a-inhibitor組miR-196a表達降低(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表達增高(P<0.05)，見圖1、表1。

圖1 Western blot檢測HDAC9在各組MC3T3-E1細胞中表達Fig.1 The expression of HDAC9 of MC3T3-E1 cells in each group detected with Western blotting

表1 miR-196a和HDAC9在MC3T3-E1細胞中表達情況

2.2 miR-196a對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

與Cont組相比，誘導組、miR-196a-mimics-NC組和miR-196a-inhibitor-NC組MC3T3-E1細胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表達、ALP活性及礦化程度增加(P<0.05)；與miR-196a-mimics-NC組和誘導組相比，miR-196a-mimics組MC3T3-E1細胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表達、ALP活性及礦化程度增加(P<0.05)；與miR-196a-inhibitor-NC組和誘導組相比，miR-196a-inhibitor組MC3T3-E1細胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表達、礦化程度及ALP活性降低(P<0.05)，見圖2，表2。

注：A：Western blot檢測ALP、Runx2、COL1、OPN在各組MC3T3-E1細胞中表達。B：茜素紅染色各組MC3T3-E1細胞(Scale bar=200 μm)。圖2 miR-196a對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響Fig.2 Effects of miR-196a on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

2.3 miR-196a可靶向調節MC3T3-E1細胞中HDAC9的表達

Targetscan網站預測顯示，HDAC9 3’UTR區存在miR-196a的結合位點，見圖3。雙熒光素酶報告實驗發現，pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+mimics-NC組、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+mimics-NC組、pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+miR-196a mimics組、pGL3-HDAC9 3’UTR-MUT+miR-196a mimics組相對熒光素酶活性為(0.99±0.05)、(1.01±0.08)、(0.39±0.04)、(1.03±0.09)，pGL3-HDAC9 3’UTR-WT+miR-196a mimics組顯著低于其他三組(均P<0.05)。

圖3 Targetscan預測HDAC9 3’UTR與miR-196a的結合位點Fig.3 The binding site of HDAC9 3’UTR and miR-196a predicted with Targetscan

2.4 miR-196a對MC3T3-E1細胞Histone H3乙酰化水平的影響

與Cont組相比，誘導組、miR-196a-mimics-NC組和miR-196a-inhibitor-NC組MC3T3-E1細胞Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平增加(P<0.05)；與miR-196a-mimics-NC組和誘導組相比，miR-196a-mimics組MC3T3-E1細胞Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平增加(P<0.05)；與miR-196a-inhibitor-NC組和誘導組相比，miR-196a-inhibitor組MC3T3-E1細胞Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平降低(P<0.05)，見圖4，表3。

圖4 Western blot檢測各組MC3T3-E1細胞中Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平Fig.4 The acetylation levels of Histone H3 K9, K14, and K23 sites of MC3T3-E1 cells in each group detected with Western blotting

表3 各組MC3T3-E1細胞中Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平的比較

2.5 共轉染miR-196a mimics和pCMV-HDAC9對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響

與miR-196a-mimics組和miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9-NC組比較，miR-196a-mimics+pCMV-HDAC9組MC3T3-E1細胞ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表達、ALP活性及礦化程度降低(P<0.05)，見圖5、表4。

注：A：Western blot檢測ALP、Runx2、COL1、OPN在各組MC3T3-E1細胞中表達。B：茜素紅染色各組MC3T3-E1細胞(Scale bar=200 μm)。圖5 共轉染miR-196a mimics和pCMV-HDAC9對MC3T3-E1細胞成骨分化的影響Fig.5 Effects of co-transfection of miR-196a mimics and pCMV-HDAC9 on osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells

3 討論

miRNA表達失調可能影響成骨細胞分化和骨形成，如miR-219a-5p在老年人骨組織中表達降低，過表達miR-219a-5p可增加ALP表達和活性，增強成骨活性[8]；miR-335-5p在小鼠胚胎的成骨細胞中高表達，過表達miR-335-5p可誘導小鼠的成骨分化和骨形成，促進顱面骨缺損的修復[9]；miR-664-3p在MC3T3-E1細胞成骨分化過程中表達下調，過表達miR-664-3p在體外可抑制成骨細胞活性和基質礦化，在體內則損害骨形成并引起骨量減少[10]。本研究發現，miR-196a在成骨誘導的MC3T3-E1細胞中表達增加，且高表達miR-196a后，MC3T3-E1細胞miR-196a表達、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表達、ALP活性及礦化程度增加；低表達miR-196a則可顯著降低MC3T3-E1細胞miR-196a表達、ALP、Runx2、COL1、OPN蛋白表達、ALP活性及礦化程度。成骨細胞是骨形成的主力細胞，首先合成并釋放COL1累積大量細胞外基質，進一步成熟并發生礦化形成骨結節，最終實現骨量的增加[11]。Runx2為早期成骨細胞標志物，COL1為胞外基質中主要膠原成分，OPN、ALP為成熟成骨細胞標志物，其表達水平可反映成骨細胞的分化能力[12]。提示miR-196a在MC3T3-E1細胞中發揮促成骨分化作用。

miRNA主要通過與內源性mRNA競爭性結合，減少翻譯蛋白質的mRNA數量或者抑制翻譯，從而抑制蛋白表達[3]。如miR-143可通過靶向HDAC7抑制成骨細胞分化[13]；miR-27a可直接抑制PR結構域蛋白16基因(TGF-β信號通路的負調節因子)表達，進而調節TGF-β信號通路促進骨細胞分化[14]。本研究預測發現，miR-196a與HDAC9 3’UTR存在結合位點，且熒光素酶報告實驗顯示，miR-196a mimics可顯著降低pGL3-HDAC9 3’UTR-WT的熒光素酶活性，進一步證實miR-196a與HDAC9 3’UTR存在特異性結合。本研究還發現，miR-196a-mimics可顯著降低MC3T3-E1細胞中HDAC9表達并增加Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平，而miR-196a-inhibitor則明顯增加MC3T3-E1細胞中HDAC9表達，同時降低Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平，提示miR-196a可靶向負調控HDAC9表達。HDAC9屬于Ⅱ類HDAC，通過移去組蛋白和/或其他蛋白質中賴氨酸側鏈上的乙酰基來控制基因轉錄[15]。最近證據顯示，HDAC是骨形成和重建的關鍵調節劑，其中HDAC3促進骨形成[16]，而HDAC4[17]、HDAC8[18]和HDAC9[6]抑制骨形成。組蛋白乙酰化后構象發生改變，釋放其聚合的DNA，有利于轉錄因子與DNA的結合，激活基因轉錄[19-20]，而HDAC可降低組蛋白的乙酰化水平，維持DNA-組蛋白復合物的穩定，阻止轉錄因子對基因轉錄的激活[21]。推測轉染miR-196a-mimics后，HDAC9蛋白水平降低，其調控的去乙酰化作用減弱，使得Histone H3 K9、K14和K23位點乙酰化水平升高，有利于DNA從組蛋白復合物中釋放并與Runx2等轉錄因子結合，啟動ALP、COL1、OPN等基因表達，促進成骨分化。

綜上所述，miR-196a可靶向下調HDAC9表達，增加組蛋白乙酰化水平，促進MC3T3-E1細胞成骨分化。本研究僅在細胞層面探究了miR-196a的促成骨分化作用，接著將進行動物實驗，從組織學角度探究miR-196a對成骨分化的作用。