KISS-1、P16和SCC-Ag在宮頸癌組織中的表達(dá)及意義

楊弋弋 周新歡 鄒 科 倪 鳴 孫君華

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，也是女性癌癥相關(guān)死亡的第四大原因[1-2]。宮頸癌患者的臨床管理包括實(shí)施適當(dāng)?shù)闹委熀驮缙诩膊〉膹?fù)發(fā)監(jiān)測(cè)[3-4]。宮頸癌復(fù)發(fā)對(duì)預(yù)后有顯著影響，早期發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)可能會(huì)提高患者的總體生存率[5]。轉(zhuǎn)移抑制基因(KISS-1)能夠調(diào)節(jié)一些癌細(xì)胞的行為，可能通過(guò)誘導(dǎo)自噬和細(xì)胞凋亡來(lái)抑制其增殖[6]。作為一種腫瘤抑制因子，KISS-1主要通過(guò)下調(diào)NFkB信號(hào)、MMP9因子及其他下游靶點(diǎn)，對(duì)轉(zhuǎn)移性癌癥的擴(kuò)散起到抑制作用[7]。最近的研究表明KISS-1參與了腫瘤血管生成、自噬和細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)的機(jī)制，這表明它可能在限制癌細(xì)胞侵襲方面發(fā)揮作用[8]。抑癌基因P16作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物(CDK4-CDK6)結(jié)合來(lái)抑制成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白的磷酸化，從而導(dǎo)致細(xì)胞停滯在G1期[9]。以前的研究表明，P16是有效的總生存率的獨(dú)立預(yù)后因素[10]。然而，P16的陽(yáng)性表達(dá)是否可以作為宮頸癌患者臨床預(yù)后的有力判斷因素，目前還沒(méi)有確定，有必要進(jìn)行更精細(xì)的研究，以確定P16是否可以作為有效的預(yù)后指標(biāo)。鱗狀細(xì)胞癌抗原(SCC-Ag)是腫瘤相關(guān)抗原TA-4的亞組分，其特征是分子量為48,000 D的糖蛋白，由2個(gè)同源基因編碼，SCCA1和SCCA2參與腫瘤發(fā)展過(guò)程[11]。盡管文獻(xiàn)中關(guān)于宮頸癌患者隨訪期間血清SCC-Ag分析的陰性和陽(yáng)性預(yù)測(cè)價(jià)值的數(shù)據(jù)有限，但在恢復(fù)期的患者中，96%的病例SCC-Ag水平正常，而復(fù)發(fā)病例中，85%的患者SCC-Ag水平升高[12]。前面的研究表明血清SCC-Ag水平升高與治療效果差以及生存和預(yù)后不良有關(guān)[13]。本研究通過(guò)探討KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)，分析其與臨床病理特征的關(guān)系以及與患者預(yù)后的關(guān)系，為臨床診斷和治療提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年2月至2018年3月診治的150例宮頸癌患者作為研究對(duì)象，患者的年齡>50歲41例，≤50歲109例；鱗癌123例，腺癌27例；腫瘤大小>4 cm有66例，≤4 cm有84例；TNM分期：T1期23例，T2期62例，T3期44例，T4期21例；浸潤(rùn)深度>1/2肌層有49例，≤1/2肌層有101例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移23例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移127。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)影像學(xué)和臨床病理學(xué)檢查，確診為宮頸癌；行宮頸癌根治手術(shù)；臨床資料及隨訪資料完整；患者年齡>18歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：入院前3個(gè)月內(nèi)接受過(guò)放療和或化療；合并其他腫瘤；處于妊娠期或者哺乳期。

1.2 方法

將福爾馬林固定和石蠟包埋宮頸癌組織和癌旁正常組織，切成4 μm的薄片，用1%的H2O2孵育10 min。然后在37 ℃下用胰蛋白酶進(jìn)行抗原修復(fù)處理30 min，再用檸檬酸鹽緩沖液浸泡微波加熱20 min。分別用KISS-1多克隆抗體、P16多克隆抗體、SCC-Ag多克隆抗體對(duì)標(biāo)本進(jìn)行免疫組化(SP)染色，所用抗體和試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司。著色評(píng)分：棕褐色3分，黃色2分，淺黃色1分，無(wú)色0分。染色評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞比例<1%為0分；陽(yáng)性細(xì)胞比例1%～25%為1分；陽(yáng)性細(xì)胞比例>25%～50%為2分；陽(yáng)性細(xì)胞比例>50%為3分。將著色評(píng)分及染色評(píng)分相加即為總得分，總得分≥1分為陽(yáng)性表達(dá)，<1分為陰性[14]。

1.3 觀察指標(biāo)

(1)統(tǒng)計(jì)分析宮頸癌組織及癌旁正常組織KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)。(2)統(tǒng)計(jì)分析KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，包括年齡、病理類型、腫瘤大小、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。(3)統(tǒng)計(jì)分析KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。(4)統(tǒng)計(jì)分析KISS-1、P16和SCC-Ag表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究使用SPSS 18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)數(shù)以百分?jǐn)?shù)(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料采用秩和檢驗(yàn)，生存曲線用Kaplan-Meier法計(jì)算，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)情況

宮頸癌組織中的P16和SCC-Ag陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁正常組織，KISS-1陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁正常組織，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)情況(例，%)

2.2 KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

KISS-1、P16和SCC-Ag的陽(yáng)性表達(dá)與年齡、病理類型無(wú)關(guān)(P>0.05)，與腫瘤大小、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 KISS-1、P16和SCC-Ag的陽(yáng)性表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

2.3 KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

生存曲線分析顯示，KISS-1陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率為78.05%，高于其陰性表達(dá)患者的59.63%；P16陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率為60.17%，低于其陰性表達(dá)患者的81.25%；SCC-Ag陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率為60.18%，低于其陰性表達(dá)患者的78.38%，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.254，P<0.05；χ2=4.605，P<0.05；χ2=4.041，P<0.05)，見表3，圖1、2、3。

表3 KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系(例，%)

圖1 KISS-1表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系

圖2 P16表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系

圖3 SCC-Ag表達(dá)與患者生存預(yù)后的關(guān)系

2.4 KISS-1、P16和SCC-Ag的表達(dá)的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)結(jié)果顯示，KISS-1表達(dá)與P16、SCC-Ag的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(γ=-0.510；γ=-0.668，P<0.05)，P16的陽(yáng)性表達(dá)與SCC-Ag的表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.373，P<0.05)。

3 討論

盡管已經(jīng)開發(fā)出有針對(duì)抑癌性HPV類型的有效預(yù)防性疫苗，但目前仍然只有少數(shù)人接種了疫苗[15]。即使可以通過(guò)手術(shù)阻止早期宮頸癌，轉(zhuǎn)移性宮頸癌也無(wú)法治愈[16]。因此，迫切需要開發(fā)一種能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)疾病結(jié)果的方法，以便早期識(shí)別治療失敗風(fēng)險(xiǎn)較高的患者。

KISS-1最初是通過(guò)使用cDNA減法雜交被確定為人類黑色素瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，將KISS-1轉(zhuǎn)染到轉(zhuǎn)移性人類黑色素瘤細(xì)胞系中，可抑制其在無(wú)胸腺裸鼠中的轉(zhuǎn)移[6]。KISS-1可能作為癌癥疾病進(jìn)展的有效生物標(biāo)志物，因?yàn)樗谋磉_(dá)不僅可以在癌組織中檢測(cè)到，而且可以在血液中檢測(cè)到[17]。本研究結(jié)果表明，癌組織中KISS-1陽(yáng)性表達(dá)低于癌旁正常組織(P<0.05)，與Li等的研究結(jié)果一致。然而，在非小細(xì)胞肺癌或前列腺癌癥臨床癥狀發(fā)展期間對(duì)血漿中KISS-1的進(jìn)一步評(píng)估顯示，KISS-1血液水平與癌癥進(jìn)展沒(méi)有相關(guān)性，盡管在胰腺癌和胃癌患者中與健康患者相比，KISS-1的水平顯著更高[18-19]。KISS-1的陰性表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，提示KISS-1在抑制癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)，有研究發(fā)現(xiàn)KISS-1血液水平因化療而降低[20]。KISS-1陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率為78.05%，高于其陰性表達(dá)患者的59.63%，提示KISS-1的高表達(dá)可以反映預(yù)后較好。因此，對(duì)宮頸癌患者的KISS-1及時(shí)監(jiān)測(cè)有助于早期復(fù)發(fā)的診斷和進(jìn)行早期適當(dāng)治療。

P16的表達(dá)受RB1基因產(chǎn)物的負(fù)調(diào)控，在正常細(xì)胞中的濃度非常低，而在HPV相關(guān)腫瘤中過(guò)度表達(dá)，其中RB已被hrHPV E7癌蛋白功能性滅活[21]。因此，P16過(guò)表達(dá)可被視為HPV感染的標(biāo)志物，并激活病毒癌基因的表達(dá)和病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞周期失調(diào)[22]。目前，在宮頸活檢或切除樣本中進(jìn)行的P16免疫染色可作為一種輔助診斷方法，以提高宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)診斷的準(zhǔn)確性[23]。結(jié)果表明，宮頸癌組織中的P16陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁正常組織(P<0.05)，且P16的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，表明P16過(guò)表達(dá)與宮頸癌前病變的腫瘤進(jìn)展有關(guān)。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)P16通過(guò)CDK6-HuR-IL1A軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，表明了P16不僅是宮頸癌形成的診斷標(biāo)志物，也是宮頸癌細(xì)胞存活所必需的蛋白[24]。此外，P16陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率低于其陰性表達(dá)患者，提示P16的陽(yáng)性表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)。

作為鱗狀細(xì)胞癌的腫瘤標(biāo)志物，SCC-Ag在大多數(shù)正常組織中表現(xiàn)出低表達(dá)水平，但在惡性腫瘤或鱗狀上皮內(nèi)病變中高度表達(dá)[25]。結(jié)果顯示，宮頸癌組織中的SCC-Ag陽(yáng)性表達(dá)高于癌旁正常組織(P<0.05)；SCC-Ag的陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，提示SCC-Ag可作為宮頸癌診斷的生物標(biāo)志物，并且可以反映腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移的進(jìn)展。SCC-Ag的表達(dá)水平隨著宮頸癌的發(fā)展而升高，表明SCC-Ag可能在宮頸上皮內(nèi)瘤變和宮頸癌的診斷中具有臨床作用[26]。SCC-Ag陽(yáng)性表達(dá)患者3年生存率低于其陰性表達(dá)患者，提示SCC-Ag可輔助診斷宮頸癌患者的預(yù)后。

Spearman秩相關(guān)結(jié)果顯示，KISS-1表達(dá)與P16、SCC-Ag的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，P16表達(dá)與SCC-Ag的表達(dá)呈正相關(guān)，提示在宮頸癌前病變過(guò)程中，可能存在KISS-1功能喪失使細(xì)胞周期紊亂，引起P16和SCC-Ag反饋性高表達(dá)，且RB功能性失活，P16的高表達(dá)同時(shí)可促進(jìn)SCC-Ag表達(dá)升高。

綜上所述，P16和SCC-Ag在宮頸癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)升高，KISS-1陽(yáng)性表達(dá)降低，三者的表達(dá)具有一定的內(nèi)在相關(guān)性，且能夠反映癌細(xì)胞浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移，可作為宮頸癌前病變?cè)\斷及預(yù)后的生物標(biāo)志物。