吉西他濱聯合放射對人胰腺癌CFPAC-1細胞株裸鼠移植瘤EphB4、Caspase3表達的影響

李芬芬 季 斌

外科手術切除被認為唯一治愈可能，手術切除后5年生存率仍然很低，在15%～30%[6-8]，可能提示早期胰腺癌患者在最初診斷時不能單純從手術中獲益，可能與術前影像學檢查中看不到的微轉移有關。在二十多年的時間里，單一吉西他濱(GEM)是唯一被批準并廣泛使用的藥物[9]。與5-氟尿嘧啶(5-FU)相比，吉西他濱治療患者的中位總生存率(5.65 vs 4.41個月)和1年生存率(18% vs 2%)顯著改善[10]。回顧性數據表明，對于無法切除的局部晚期胰腺癌，增加放療劑量提高生存率。

Caspases通常在細胞凋亡的早期階段被激活[11]。Caspase-3被稱為家族的主要劊子手，通過裂解細胞底物，在細胞凋亡死亡中發(fā)揮重要作用[12]。caspase-3的表達水平是一種已知的評估誘導凋亡機制的方法[13]。EphB4通過其相應的配體EphrinB2激活，控制細胞與細胞之間的相互作用、血管生成、腫瘤生長和轉移[14-15]。有報道稱，高表達EphB4可促進胰腺癌、結腸直腸癌和甲狀腺乳頭狀癌的生長和遷移，而這種作用可通過下調EphB4逆轉，使EphB4成為癌癥治療的一個有希望的靶點[16-18]。

1 材料與方法

1.1 材料

吉西他濱粉劑、MTT試劑盒購自江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司。mRNA分析試劑焦碳酸二乙酯(diethy pyrocarbonate，DEPC)、Trizol總RNA提取試劑盒購自美國Invitrogen公司；SYBR試劑盒由瑞士Roche公司提供。兔抗人EphB4,Caspase3一抗均購自英國Abcam公司。直線加速器購自美國瓦里安公司。實驗動物：BALB/c-nu/nu裸小鼠36只，4～5周齡，雄性，18～20 g，由中國科學院上海實驗動物中心提供，無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級。

1.2 細胞株及其培養(yǎng)

人胰腺癌CFPAC-1細胞株由中國科學院上海細胞生物學研究所提供，使用含有10%胎牛血清、IMDM培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)。細胞株呈貼壁上皮細胞，待細胞融合度>70%時，進行清洗、消化、傳代。取對數生長期的細胞為實驗所用。

1.3 MTT法檢測人胰腺癌CFPAC-1細胞增殖

將CFPAC-1細胞約為1×104/ml，每組設置4個復孔，每孔100 μl細胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)到細胞單層鋪滿孔底。加藥組：對照組、1 μg/ml、2.5 μg/ml、5 μg/ml、7.5 μg/ml、10 μg/ml吉西他濱加入后細胞培養(yǎng)24 h、48 h；放射組：細胞置于直線加速器6MV-X線下，照射線劑量分為0 Gy，2 Gy，4 Gy，6 Gy，8 Gy，以400 cGy/min的速率不同照射劑量照射后，細胞培養(yǎng)24 h、48 h。篩選出最佳的放射劑量后，加入吉西他濱各劑量組24 h后，細胞培養(yǎng)48 h。得出最佳放射劑量后，加入吉西他濱各個劑量組，細胞培養(yǎng)48 h。待三個96孔板實驗孔每孔加入5 g/l的MTT20 μl溶液，避光繼續(xù)培育4 h后加入150 μl DMSO后平板搖床搖10 min，結晶物充分溶解，在酶標儀上測550吸光值值，實驗重復三次。繪制藥物劑量-抑制率曲線圖后，計算IC50值，細胞增殖存活率=(實驗組A值-空白組A值)/(對照組A值-空白組A值)×100%。

1.4 人胰腺癌CFPAC-1細胞株裸小鼠移植瘤建模及分組

在無菌空氣層流室內，裸小鼠先飼養(yǎng)適應7天。PBS把細胞制成單細胞懸液，用臺盼藍拒染法計數活細胞在95%以上，細胞濃度調為 1×107/ml，36只BALB/c-nu/nu裸小鼠每只左下肢外側偏背部接種0.2 ml(2×106個細胞)，約5～8 d成瘤，待腫瘤長到大小約1 cm時進行干預。36只裸小鼠全部成瘤，隨機分為6組：A組：生理鹽水腹腔注射(按鼠重計算)；B組：單次照射15 Gy；C組：腹腔注射吉西他濱25 mg/kg；D組：腹腔注射吉西他濱50 mg/kg；E組：腹腔注射吉西他濱25 mg/kg，24 h后單次照射15 Gy；F組：腹腔注射吉西他濱50 mg/kg，24 h后單次照射15 Gy。照射方法：每次1只裸小鼠，四肢固定，采用直線加速器6MV-X線15 Gy照射，只把左下肢外側偏背側腫瘤置于放射野中，瘤體上放置1.5 cm濕紗布，其它部位用鉛橡皮遮蔽。

1.5 人胰腺癌CFPAC-1細胞株裸小鼠移植瘤體積、體重測量及標本處理

六組進行細胞種植后，于第1、5、11、17、23、28天測量每只裸鼠的體重及瘤體積變化情況，使用游標卡尺來測量腫瘤的長徑(a)、短徑(b)，腫瘤體積(V)的計算公式：V=a×b2/2。共觀察28天，觀察結束后處死裸鼠，立即剔除其他組織，剝離取出瘤塊稱重。腫瘤抑制率=(對照組平均腫瘤重量-實驗組平均腫瘤重量)/對照組平均腫瘤重量×100%。

1.6 RT-PCR檢測組織中EphB4、Caspase3基因表達

用Trizon試劑提取組織總RNA并檢測總RNA的濃度及純度。首先取500 ng總RNA與1 μl引物、無核酸酶的高純水混合至12 μl ，65 ℃ 5 min，將下列組分按照順序加入以上混合液中5X反應緩沖液4 μl、RiboLockTMRNA酶抑制劑1 μl、10 mM dNTP Mix 2 μl、RevertAidTMM-MuLV 逆轉錄酶1 μl，總體積20 μl，42 ℃ 60 min，70 ℃ 5 min，第一鏈cDNA合成；DNA為模板進行RT-PCR并以GAPDH進行擴增，引物設計運用Primer Premier 5.0軟件進行，見表1。

初中函數是初中階段教學的重點難點。初中函數是一個全新的概念，函數的學習與數列、排列組合、方程、不等式等知識點都有著重要的聯系，初中數學普遍存在脫離現實生活、教學方法單一的特點，以至于學生學習函數時興趣不高，課堂氛圍不夠活躍。教師在函數教學過程中會遇到很多難題，以及函數對邏輯思維能力要求比較高，影響了初中數學函數教學的質量。因此，初中教師應積極豐富初中函數的教學方式，改變傳統(tǒng)的教學模式，培養(yǎng)學生的函數解題思維，重視函數的實際應用，擺脫初中數學函數教學的困境，提升初中階段函數教學的質量。

表1 EphB4、Caspase3、GAPDH引物序列

將FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)10 μl 、forward primer(5 μM)1.2 μl、reverse primer(5 μM)1.2 μl、ddH2O 6.6 μl，總體積20 μl混勻后加入2 μl模板DNA；PCR反應條件：50 ℃ 2 min、95 ℃ 10 min、95 ℃15 s(或10 s)40 cycles，58 ℃～60 ℃ 60 s(或30 s)，開始運行程序。

1.7 裸小鼠移植瘤組織HE染色

取腫瘤組織塊固定之后石蠟包埋，5 μm切片。低濃度至高濃度酒精脫水-二甲苯中透明-蘇木精染色5 min，自來水沖洗1 h，鹽酸乙醇分化30 s，自來水浸泡15 min，伊紅液2 min，脫水透明，中性樹脂封固。

1.8 免疫組化檢測裸小鼠移植瘤中EphB4、Caspase3蛋白表達的變化

玻片處理，修組織塊，包埋組織，切片，撈組織，脫蠟，檸檬酸緩沖液修復抗原，血清封閉，滴加一抗(多克隆抗體EphB4,Caspase3工作濃度為1∶150)，加二抗，加堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，生物素復合物，加顯色劑，蘇木精復染，脫水，封片。陰性對照是用PBS緩沖液來代替一抗。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 吉西他濱、放射、聯合組處理對裸小鼠皮下移植瘤的影響

對照組(A組)、放射組(B組)、用藥組(C組、D組)、聯合組(E組、F組)六組干預后觀察28 天后裸小鼠未發(fā)生死亡，大體形態(tài)學觀察六組裸小鼠外觀上有較大的差異，其中對照組裸小鼠最早出現行動不便、意識遲緩、體型消瘦等現象。移植瘤切面觀呈白色、質脆，六組移植瘤體重大體觀呈腫瘤結節(jié)簇生。與A組相比較， C組、D組腫瘤體積和重量明顯降低(P<0.01)，并且C組、D組之間有差異(P<0.05)；E組、F組比B組的腫瘤體積和重量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，并且E組、F組兩組間有差異(P<0.05)；E組、F組比B組、C組和D組腫瘤的體積和重量明顯下降(P<0.05)；見表2。六組的抑瘤率(表3)，F組裸小鼠的皮下移植瘤的體積最小、腫瘤重量最輕，抑瘤率最高。

表2 各組裸小鼠皮下移植瘤體積

表3 各組裸小鼠瘤重量和抑瘤率(n=6)

2.2 人胰腺癌CFPAC-1細胞株增殖活力的測定(MTT)

單純吉西他濱兩組、單純放射兩組對人胰腺癌CFPAC-1細胞株生長有明顯抑制作用，呈劑量、時間依賴的趨勢。隨著吉西他濱濃度的升高、放射劑量的增加、作用時間的延長，細胞存活率逐漸降低，表明細胞的生長抑制作用逐漸增強；得出6MV-X線直線加速器照射8 Gy放射劑量為最佳放射劑量，在不同劑量吉西他濱下培養(yǎng)細胞24 h后6MV-X線直線加速器照射8 Gy放射劑量后對細胞有比單純用藥組、單純放射組更為明顯的抑制作用，呈劑量依賴的趨勢，細胞存活率逐漸降低更明顯。

2.3 EphB4基因、Caspase3基因在人胰腺癌細胞株CFPAC-1裸鼠移植瘤中的表達

EphB4受體、Caspase3受體mRNA在六組腫瘤組織中均有表達。與對照組相比較，EphB4受體在單純用藥組表達明顯降低(P<0.05)，并且聯合組表達最低(P<0.01)；C組、D組兩組比較有明顯下降(P<0.05)；E組、F組兩組比較有明顯下降，并且比B組顯著下降(P<0.05)。Caspase3基因表達與EphB4基因相反。

2.4 EphB4受體、Caspase3受體在人胰腺癌細胞株CFPAC-1裸鼠移植瘤的表達

EphB4、Caspase3抗體的陽性染色主要分別位于細胞膜和細胞質內，呈棕褐染色，陰性、陽性的表達根據細胞染色的強度以及染色細胞所占的面積這兩者積分之和來判斷。染色強度積分判斷：無染色為0分，輕度染色為l分，中度染色為2分，強染色為3分；染色面積積分判斷：無細胞染色為0分，<25%細胞染色為l分，25%～50%細胞染色為2分，>50%細胞染色為3分。胰腺癌細胞的染色強度及染色面積兩者積分相加，依次為：(-)：0；(+)：l～2；(++)：3～4；(+++)：5～6；兩者積分之和>2為表達陽性，≤2為表達陰性。組織切片于400倍光鏡下隨機選取10個視野，同一條件下拍照攝片。EphB4蛋白染色：與A組相比，C組、D組明顯降低(P<0.05)，E組、F組降低最為明顯(P<0.01)； E組、F組與B組、C組、D組相比，表達明顯降低(P<0.05)，F組表達為最低。Caspase-3蛋白染色：與EphB4蛋白相反。

3 討論

胰腺癌是美國第四大癌癥死亡原因，5年生存率為3%[19]。GLOBALCAN數據庫顯示胰腺癌是全球男性和女性第7死亡原因[20]，預計在歐盟國家胰腺癌超過乳腺癌成為第3死亡原因[21]。可切除胰腺導管腺癌(PDAC)目前的治療標準是先手術后輔助化療[22]。然而，由于缺乏適當的早期檢測和篩查方法，大多數胰腺癌患者被診斷為晚期或轉移性疾病。只有15%～20%的胰腺癌患者在確診時接受手術治療，即使是已經接受手術切除的患者，因為大多數患者會在一年內出現疾病復發(fā)[23]。這些令人沮喪的結果的根本原因與輔助手術治療的不良療效、未檢測到的微轉移和化學耐藥性的發(fā)展有關。即使是R0切除患者的5年生存率仍然很低，約為20%。胰腺癌是一種全身性疾病，因為即使是早期疾病的大多數患者最終也會發(fā)展為轉移。盡管吉西他濱具有一定的抗腫瘤活性并提高輔助治療的生存率，但迄今為止，大多數胰腺癌患者的治療重點仍然是姑息性的。

凋亡是一種程序性細胞死亡，對于維持體內生長、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)至關重要[24]。

不管凋亡是如何啟動的，一個半胱氨酸導向的蛋白酶家族，即caspases，會從非活性的酶原樣狀態(tài)被系統(tǒng)激活，并在成熟后，針對大量的細胞蛋白進行水解。由于其活性的性質，Caspases是高度調控的蛋白，因為不適當的活化會產生毀滅性的影響。凋亡caspases一般分為“啟動子”和“劊子手”。caspases的關鍵生物學功能與凋亡和程序性死亡有關[25-26]，也與非細胞死亡功能的炎癥、樹突、細胞分化和遷移中有關[27]，分為兩個不同的途徑[28]。Caspase-3通過結構蛋白的切割導致核包膜的破壞和基因組DNA的破壞。低水平的caspase-3活性對幾種細胞的關鍵發(fā)育過程是必要的[29]。

增殖信號的持續(xù)刺激和相關監(jiān)測機制的失調是腫瘤形成的重要原因。生長因子可以激活生長因子受體，產生細胞內級聯信號，調節(jié)腫瘤細胞的增殖。EphB4是受體酪氨酸激酶家族的重要成員，在各種癌癥中過表達并促進腫瘤生長和遷移[30-31,17]。EphB4在正常和惡性細胞中都有促進細胞遷移潛能的報道[32]。

本實驗通過構建人胰腺癌裸小鼠移植瘤模型來觀察在無干預(A組)、干預組(B組、C組、D組、E組、F組)情況下生存28天后，在宏觀上，觀察長徑、短徑以及瘤重的變化，并從微觀上熒光定量PCR檢測組織中EphB4、Caspase3基因表達、免疫組織化學染色法觀察EphB4、Caspase3蛋白形態(tài)的變化，論證一定劑量的吉西他濱對局部胰腺癌具有放射治療的效果。

本實驗結果初步顯示，25 mg/kg吉西他濱+放射聯合組、50 mg/kg吉西他濱+放射聯合組的腫瘤體積、重量明顯小于其它組，而且50 mg/kg吉西他濱+放射聯合組的抑瘤率最高；在微觀上觀察干預組的(B組、C組、D組、E組、F組)EphB4、Caspase3的表達較對照組(A組)明顯增加，聯合組表達(E組，F組)強于其它單純放射組(B組)和用藥組(C組、D組)，F組的表達最強，各干預組之間具有顯著的差異。實驗結果表明一定劑量的吉西他濱用藥對于放射有增敏療效，對局部放射治療有明顯效果，為指導胰腺癌的治療提供了科學依據。

盡管胰腺癌的治療已經取得了進展，但吉西他濱仍然是晚期PDAC新輔助、輔助和姑息治療的基礎。為了獲得有效的治療方案，臨床醫(yī)生主要依靠平衡抗腫瘤作用和對正常組織的毒性。吉西他濱分子的許多化學修飾和封裝設計的已經提出克服耐藥性機制。通常，保護胺功能(4-(N)位)的前藥物會阻斷cda誘導的吉西他濱失活，而將吉西他濱包封到脂質體和NPs等膠體系統(tǒng)中，可以改善其藥代動力學特征，從而改善生物分布和位點特異性給藥。