基于網絡藥理學和數據分析方法研究中藥調控冠心病發展的鐵死亡關鍵基因※

胡泰然 李雪苓

(1.安徽中醫藥大學2019級碩士研究生，安徽 合肥 230000；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院心血管內科，安徽 合肥 230000)

冠心病是動脈粥樣硬化導致器官病變的最常見類型，是全球人類死亡的首要原因[1]。在我國，2018年以來，冠心病的死亡率更是超過了腫瘤等其他疾病而位居首位，且呈逐年升高趨勢[2-3]。冠心病主要的病理變化是動脈粥樣斑塊的形成及發展。研究表明，鐵死亡的機制與心血管疾病的發生發展密切相關。細胞鐵死亡是鐵依賴途徑的脂質過氧化[4]，是區別于細胞凋亡、壞死和自噬的新型細胞程序性死亡方式。2003年最早由美國Stockwell B團隊在研究抗癌藥物時發現，并在隨后的研究中命名為“ferroptosis(鐵死亡)”。其產生的作用機制主要有2種[5]，一種是細胞內的游離鐵離子通過芬頓反應(fenton reaction)與過氧化氫相互作用，發生脂質過氧化從而產生過多的不飽和脂肪酸，造成細胞的程序性死亡，可能與谷胱甘肽(GSH)合成減少有關；另一種是鐵蛋白的轉換異常，使細胞外的鐵離子數量異常升高，也稱“鐵過載”。近年來，隨著鐵死亡研究的進展，其與冠心病的關系也有了更加合理的解釋[6]。在冠心病發展的早期，氧化應激是其主要的病理因素之一，過氧化酶(POD)會導致細胞器脂質過氧化，同時介導炎性反應而導致炎癥介質沉積，加速冠狀動脈粥樣硬化的發展。隨著病情的進展，鐵死亡等其他細胞程序性死亡廣泛發生，并誘導斑塊的不穩定、破裂，是影響冠心病中晚期發展的關鍵因素[7]。

中藥治療冠心病療效確切，具有多靶點、多途徑、經濟成本低等優勢，中藥中的多種成分也已經被證明具有抑制脂質過氧化的作用[8]。本研究結合網絡藥理學技術[9]和數據分析方法，以鐵死亡為分析方向，篩選中藥調控冠心病的關鍵靶點，為中藥治療冠心病提供新思路。

1 材料與方法

1.1 鐵死亡相關基因和冠心病相關基因的獲取 鐵死亡相關基因通過搜索檢索詞“ferroptosis”從FerrDb數據庫(http://www.zhounan.org/ferrdb)獲取，并選擇“Driver”“Suppressor”“Marker”模塊，下載鐵死亡相關基因文件，再通過檢索文獻，補充未收錄的鐵死亡相關基因，去除重復值后獲得鐵死亡相關基因。登錄OMIM(https://omim.org)、GeneCards(https://www.genecards.org)、DurgBank(https://www.drugbank.com)、Disgenet(https://www.disgenet.org)數據庫，搜索指令設置為“Coronary Heart Disease”，物種設置為“human”，檢索冠心病相關基因，去除重復值及轉換、規范基因名后獲得冠心病相關基因。

1.2 “鐵死亡-冠心病”交集基因獲取及蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡的構建 將篩選得到的鐵死亡相關基因和冠心病相關基因數據導入Excel表格中，合并成一列后選擇“條件格式—突出顯示單元格—重復值”，得到的重復值即為“鐵死亡-冠心病”交集基因，并通過微生信(http://www.bioinformatics.com.cn)平臺制作韋恩圖展示。將交集基因導入STRING(https://string-db.org)數據庫，最高置信度設置為0.7，去除游離沒有關聯的蛋白，下載得到PPI文件。文件導入Cytoscape 3.8.2軟件進行可視化處理，構建“鐵死亡-冠心病”PPI網絡，選擇“Cytohub”插件分析節點連接度值(Degree值)、節點介度和節點緊密度，并根據Degree值的大小設置網絡圖的節點(node)、邊(edge)、顏色(colour)，最終分析得到Degree值排名前20的基因為“鐵死亡-冠心病” 關鍵基因靶點。

1.3 基因本體(GO)功能和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 為分析鐵死亡蛋白的生物功能、細胞組成和化學成分，以及其所涉及的信號通路，將“鐵死亡-冠心病”交集基因導入Metascape平臺(https://metascape.org)，得到GO功能和KEGG通路富集分析文件，將文件轉換后導入R軟件，利用“ggplot”包構建富集分析圖，并分別制作GO氣泡圖和KEGG柱狀圖。

1.4 含有“鐵死亡-冠心病”關鍵基因的關鍵中藥獲取 將Degree值排名前20的“鐵死亡-冠心病” 關鍵基因分別導入UniProt(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)數據庫，物種設置為“human”，相關研究設置為“已驗證”，獲取蛋白名全稱。將蛋白全稱輸入中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com)，得到含有“鐵死亡-冠心病”關鍵基因的相關中藥。為明確每個中藥中所包含的“鐵死亡-冠心病”關鍵基因的多少，將相關中藥按照關鍵基因名分組，此處假設得到了X個關鍵基因，即分為X組，并全部導入Excel表格中，合并為一列,先將所有組合并為一列,通過選擇“條件格式—突出顯示單元格—重復值” 篩選出的重復值即為包含所有關鍵基因(X個)的中藥。按照此法，依次遞減(每次遞減一組)需要合并為一列并篩選重復值的組數，得到包含X-1、X-2、X-3、X-4……個關鍵基因的中藥，最終將包含10個及以上關鍵基因的中藥為關鍵中藥，并作為本研究的對象。它們即包含了多種鐵死亡基因，又有作用于冠心病的靶點。

1.5 “中藥-成分-靶點”網絡構建及“中藥-冠心病”PPI網絡構建 將篩選得到的關鍵中藥導入TCMSP，設置篩選條件為口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18，得到中藥活性成分及其作用的靶點，靶點轉換、規范基因名，并運用Cytoscape 3.8.2軟件制作“中藥-成分-靶點”網絡圖。然后將所得的中藥靶點基因和冠心病疾病基因導入Excel中，通過選擇“條件格式—突出顯示單元格—重復值”篩選交集基因，并將交集基因導入STRING數據庫進行分析，結果再次導入Cytoscape 3.8.2軟件，構建“中藥-冠心病”PPI網絡，并通過“Cytohub”插件分析拓撲學參數，篩選得到Degree值排名前10的基因為“中藥-冠心病”核心基因靶點。

1.6 中藥調控冠心病相關鐵死亡關鍵基因的獲取 將“鐵死亡-冠心病”核心基因與“中藥-冠心病”關鍵基因取交集，得到中藥調控冠心病相關鐵死亡的關鍵基因，并通過微生信平臺制作韋恩圖展示。

2 結果

2.1 鐵死亡相關基因和冠心病相關基因的獲取 從FerrDb數據庫不同模塊中和文獻檢索共得到383個鐵死亡相關基因靶點，除去重復值后得到259個鐵死亡相關基因。從OMIM、GeneCards、DurgBank、Disgenet數據庫中共得到7717個冠心病疾病相關基因，去除重復值后得到955個疾病相關基因。

2.2 “鐵死亡-冠心病”交集基因獲取及PPI網絡構建 將篩選得到的259個鐵死亡基因和955個冠心病基因取交集,最終得到161個“鐵死亡-冠心病”交集基因(見圖1)。利用Cytoscape 3.8.2軟件制作“鐵死亡-冠心病”PPI網絡圖(見圖2)，結果顯示共有153個節點，1587條邊，顏色越深的節點代表Degree值越高，互作關系越強。通過“Cytohub”插件篩選得到Degree值排名前20的基因為“鐵死亡-冠心病”關鍵基因靶點(見表1)。

圖1 “鐵死亡-冠心病”交集基因韋恩圖

圖2 “鐵死亡-冠心病”PPI網絡圖

表1 “鐵死亡-冠心病”關鍵基因

2.3 GO功能和KEGG通路富集分析 GO功能富集分析共獲得201個搜索結果，其中生物過程(BP)有68個結果，主要涉及化學應激、活性氧化物的代謝過程、細胞死亡的調節、氧化水平的反映、多細胞有機體的形成、超氧化物的代謝、炎癥反應；細胞組分(CC)有53個結果，主要涉及氧化酶復合物、次生溶酶體、轉移酶復合物、內分泌囊泡、細胞膜筏；分子功能(MF)有80個結果，主要涉及氧化酶活性、蛋白質韌帶結合、轉錄因子綁定、鐵離子結合、p53綁定、線粒體蛋白激酶結合。按照P值由大到小排序，對排名前20的結果制作氣泡圖進行展示(見圖3)。KEGG通路富集分析共得到40條通路，主要涉及流體剪應力和動脈粥樣硬化通路、自噬相關通路、鐵死亡通路、叉頭轉錄因子O亞族(FoxO)信號通路、自噬-動物信號通路、晚期糖基化終末產物(AGE) -晚期糖基化終末產物受體(RAGE)信號通路，提示鐵死亡可能通過這些通路影響冠心病的發展。按基因富集的數量由大到小排序，對排名前13的通路制作柱狀圖進行展示(見圖4)。

圖3 GO功能富集分析氣泡圖

續圖3 GO功能富集分析氣泡圖

圖4 KEGG通絡富集分析柱狀圖

2.4 含有“鐵死亡-冠心病”關鍵基因的關鍵中藥獲取 將2.2項獲得的20個“鐵死亡-冠心病”關鍵基因靶點分別導入UniProt數據庫，轉換成基因全稱后結果導入TCMSP平臺，發現有5個基因未篩選到相關中藥，最終有15個“鐵死亡-冠心病”關鍵基因共得到498種中藥。通過分析發現，不同基因所相關的中藥數量是不同的(見圖5)。同時根據Excel數據分析結果顯示，包含10種及以上關鍵基因的中藥共有7味，分別為麻黃、芫荽、余甘子、黃芩、丹參、青蒿、葛根，其中青蒿、葛根所包含的基因數最少，為13種，麻黃、芫荽、余甘子、黃芩、丹參均為14種(見圖6)，沒有得到包含所有關鍵基因的中藥。其余的中藥因包含的關鍵基因數量過少，故排除。

圖5 15個“鐵死亡-冠心病”關鍵基因所含中藥數

圖6 含“鐵死亡-冠心病”關鍵基因最多的前7味中藥

2.5 “中藥-成分-靶點”網絡構建及“中藥-冠心病”PPI網絡構建 選取中藥麻黃、芫荽、余甘子、黃芩、丹參、青蒿、葛根通過TCMSP數據庫，篩選得到62種活性成分和356個靶點。將結果導入Cytoscape 3.8.2軟件構建“中藥-成分-靶點”網絡(見圖7)，共有361個節點，1731條邊，顏色越深、節點越大、透明度越高的節點Degree值越高。將356個中藥靶點基因與955個冠心病疾病基因取交集，得到129個交集基因。將129個交集基因導入STRING平臺，并利用Cytoscape 3.8.2軟件構建“中藥-冠心病”PPI網絡(見圖8)。通過“Cytohub”插件分析Degree值排名前10的基因為“中藥-冠心病”核心基因靶點(見表2)。

圖7 “中藥-成分-靶點”網絡圖

圖8 “中藥-冠心病”PPI網絡圖

表2 “中藥-冠心病”核心基因靶點

2.6 中藥調控冠心病相關鐵死亡關鍵基因的獲取 將2.2項篩選得到的20個“鐵死亡-冠心病”關鍵基因與2.5項篩選得到的10個“中藥-冠心病”核心基因取交集，最終獲得8個交集基因靶點(見圖9)，即TP53、MAPK1、MAPK8、Jun、IL-6、STAT3、VEGFA、MAPK3。其中Jun是轉錄因子復合物激活蛋白-1(AP-1)的主要成分，主要參與細胞增殖、分化和凋亡，以及人類不同的腫瘤細胞的生長、增殖[10]，由于缺乏實驗驗證其與冠狀動脈粥樣硬化的相關，故排除。同時，文獻檢索發現，PTGS2與鐵死亡和冠狀動脈粥樣硬化的相關性較強[11]，可作為關鍵基因靶點。這些基因靶點既是鐵死亡在冠心病中的關鍵位點，也是中藥調控鐵死亡的關鍵靶點，是本研究分析得到的中藥調控冠心病發展的鐵死亡關鍵基因。

圖9 “鐵死亡-冠心病”關鍵基因

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化導致的冠心病，特別是急性冠狀動脈綜合征，是威脅人類生命，造成全球死亡率升高的主要原因之一[12]。鐵死亡是導致多種疾病發生發展的新的病理機制。目前已經有研究發現，鐵死亡在抗癌藥物的研發、帕金森的治療、肺部疾病、急性腎損傷中具有重要作用[13-17]，但在冠心病發展中的作用尚缺乏相關研究，特別是在斑塊的形成、破裂及管腔狹窄方面。

本研究通過相關數據庫和文獻搜索、PPI網絡構建，篩選出鐵死亡在冠心病中的關鍵基因靶點，通過GO和KEGG分析顯示鐵死亡基因在冠心病的發展中主要參與氧化反應、炎性反應及細胞的代謝過程，這可能與鐵死亡脂質過氧化的發生機制有關。Su L J等[18]研究顯示，脂質過氧化介質會促進細胞釋放高遷移率族蛋白B1(HMGB1)而誘導炎性反應，在用亞硝酸鈉(谷胱甘肽過氧化物酶4激活劑)后，小鼠的炎癥因子IL-1、IL-6水平顯著降低，說明鐵死亡可能是炎癥的起始因素，具有促炎作用。KEGG通路富集分析顯示，排名前3名的通路為流體剪應力和動脈粥樣硬化通路、自噬相關通路及鐵死亡通路。流體剪應力是血流在血管內流動時產生的摩擦力，與血流速度有關。有研究發現，正常范圍內的血流速度會抑制炎癥信號，激活、穩定血管的通路，而高于或低于正常的血流速度則會誘導炎癥信號，抑制穩定血管的通路[19]。血流紊亂也會通過增加纖維連接蛋白激活氧化的低密度脂蛋白，抑制一氧化氮合酶(eNOS)的激活和一氧化氮(NO)的產生而影響血流狀態，誘導內皮功能障礙，導致動脈粥樣硬化[20]。鐵死亡在血流動力學改變的情況下或許參與了這一過程。自噬和鐵死亡作為不同類型的細胞死亡形式，具有密切聯系，許多鐵死亡調控因子如腫瘤抑制因子p53、熱休克蛋白B1(HSPB1)、重組蛋白因子CDGSH鐵硫結構域1(CISD1)、長鏈酯酰輔酶A合成酶4(ACSL4)已被證實為自噬的潛在調控因子[21]。Kang R等[22]發現，自噬條件下，Fe2+會在溶酶體內降解，隨著Fe2+的減少，Fe3+鐵增多，進而誘導氧化應激的發生，而氧化應激損傷同樣是冠狀動脈粥樣硬化發展的病理因素。

在獲得Degree值排名前20的“鐵死亡-冠心病”關鍵基因后，通過頻數分析得到了與“鐵死亡-冠心病”關鍵基因關聯最密切的7味中藥，分別為麻黃、黃芩、芫荽、余甘子、丹參、青蒿、葛根。其中丹參活血化瘀，祛瘀生新；黃芩清熱燥濕，瀉火解毒；葛根清熱降火，生津止渴；青蒿清濕熱，退虛熱；麻黃發汗解表，宣肺平喘，利水消腫；芫荽發汗透疹，消食下氣，醒脾和中；余甘子清熱涼血，消食健脾，生津止渴。現代藥理研究顯示，丹參的主要成分丹參素具有抗炎、抗血小板聚集、抗冠狀動脈粥樣硬化、保護心肌能量代謝的作用[23]，已廣泛應用于臨床，如中成藥復方丹參滴丸的主要成分即為丹參素，其聯合氯吡格雷片抗血小板聚集的效果明顯優于單用復方丹參滴丸或氯吡格雷片[24]。Zhang Y等[25]研究發現，丹參素可以調控谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)，通過增強GSH-Px的活性來減輕氧化應激損傷，抑制細胞鐵死亡。黃芩的主要成分為黃芩苷，也稱黃芩素，能通過抑制活性氧(ROS)發揮抗氧化作用，進而抑制鐵死亡[26]。葛根的主要成分為葛根素[27]，具有抗炎、抗氧化、改善心肌能量代謝的作用，還能通過上調熱休克蛋白72(HSP72)因子的表達來減緩細胞脂質過氧化和鐵過載[28]。青蒿的主要成分青蒿素具有抗炎、抗腫瘤、抗心律失常的作用[29]，目前青蒿素通常用于鐵死亡的誘導劑參與腫瘤藥物的研發[30]。麻黃、芫荽、余甘子在鐵死亡和心血管病領域的研究較少，其中芫荽為傘狀科植物芫荽的全草和果實，又名胡荽，有研究顯示，其主要成分具有抗氧化的作用[31]，可能通過這一機制抑制細胞鐵死亡。

通過多次取交集及文獻檢索，最終得到了中藥調控冠心病相關鐵死亡的8個關鍵基因，分別為TP53、PTGS2、IL-6、STAT3、VEGFA、MAPK1、MAPK3、MAPK8。Tarangelo A等[32]通過細胞實驗發現, 腫瘤抑制因子TP53可以增強GSH的活性，減少ROS的產生和能量消耗，抑制細胞鐵死亡。Kolovou V等[33]研究顯示，TP53基因頻率越低，發生冠狀動脈疾病和心血管事件的風險性越高。說明TP53不僅在腫瘤疾病中發揮作用，對冠心病的發展同樣具有影響。最新研究發現，PTGS2在冠心病的發展過程中表達上調，是鐵死亡在冠心病發展中的樞紐基因[33]。IL-6、STAT3作為炎癥相關因子，參與炎性反應，而炎性反應產生炎癥介質是冠狀動脈硬化斑塊早期形成的病理因素之一[34]。VEGFA表達降低是導致血管內皮障礙的關鍵因素，這可能與miR-451的調控有關[35]。MAPK1、MAPK3、MAPK8都屬于絲裂原活化蛋白激酶家族分子，可以通過激活ROS參與細胞增殖、分化、死亡等多個細胞過程。Chang W T等[36]發現，細胞鐵死亡同樣可以通過MAPK激活ROS參與細胞過程。

本研究通過網絡藥理學和數據分析的方法構建“鐵死亡-冠心病”PPI網絡及“中藥-冠心病”PPI網絡，篩選分析出“中藥-冠心病-鐵死亡”三者共同的相關基因。結果顯示，麻黃、芫荽、余甘子、黃芩、丹參、青蒿、葛根可能通過調控細胞鐵死亡的途徑參與治療冠心病,具體藥理機制需要進一步的實驗研究。TP53、PTGS2、IL-6、STAT3、VEGFA、MAPK1、MAPK3、MAPK8是本研究得出的中藥從鐵死亡途徑調控冠心病的關鍵基因，這些基因可能是中藥在治療冠心病過程中的重要作用靶點，也可能是參與調節、傳導等，但其具體的通過何種通路治療冠心病有待在后續的研究中驗證。