透邪解毒湯對脂多糖誘導小鼠急性肺損傷的干預效果及機制研究※

占嬈娜 黃桂瓊 陳 洪 袁維蔚 姚志強 楊荃懷 凌家生

(1.廣州中醫藥大學2020級碩士研究生，廣東 廣州 510006；2.廣州中醫藥大學惠州醫院肺病科，廣東 惠州 516001；3.廣州中醫藥大學惠州醫院脾胃病科，廣東 惠州 516001)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是一種破壞性的呼吸系統疾病，其特征是快速肺損傷、嚴重低氧血癥、不受控制的炎性反應和細胞因子積累，可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)[1]。病毒感染如流感病毒、冠狀病毒、腺病毒等是引起ALI和ARDS發病和導致患者死亡的主要原因[2]。越來越多的證據表明，不受控制的炎性反應在ALI的發病和發展中起著至關重要的作用[3]。因此，抑制過度的炎性反應可能有助于ALI治療。中醫藥對ALI具有良好的療效，多種中藥制劑能減輕包括新型冠狀病毒肺炎在內引起的肺部炎性反應和改善疾病預后[4-5]。透邪解毒湯是我們臨床治療肺部疾病的常用方，本研究擬通過脂多糖(LPS)刺激建立膿毒癥ALI小鼠模型，并給予透邪解毒湯干預，研究探討透邪解毒湯治療ALI的作用機制，以進一步明確中醫藥在ALI中的防治作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體(SPF)C57BL6小鼠40只，雄性，6周齡，體質量(20±2)g，于恒溫(25±1) ℃、12 h晝夜交替照明環境下進行飼養，自由飲水飲食，適應性喂養1周后用于實驗，均購自遼寧長生生物技術股份有限公司，動物生產許可證號：SCXK(遼)2020-0001。

1.2 中藥配制 透邪解毒方藥物組成：檳榔12 g，厚樸6 g，草果3 g，知母6 g，白芍6 g，黃芩6 g，甘草3 g，大黃6 g，連翹8 g，薄荷3 g，梔子3 g，芒硝3 g，竹葉5 g。常規煎煮，最終將藥物分別濃縮至相當于生藥含量1、2 g/mL，置于4°C冰箱備用。所有中藥飲片購買自廣州中醫藥大學惠州醫院中藥房。

1.3 主要試劑與儀器

1.3.1 主要試劑 LPS(美國Sigma Aldrich公司)；小鼠磷酸化核因子κB(p-NF-κB)、NF-κB、磷酸化c-Jun氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、JNK、磷酸化絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38)、p38、磷酸化細胞外調節蛋白激酶(p-ERK)、ERK、Toll樣受體4(TLR4)及3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)及IL-1β酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(深圳市達科為生物技術股份有限公司)；RIPA裂解和提取緩沖液、BCA蛋白質檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；寶生物染料法熒光定量試劑盒(日本TAKARA公司)；增強型化學發光檢測試劑盒(上海天能科技有限公司)。

1.3.2 主要儀器 全自動酶標儀、聚合酶鏈式反應(PCR)分析儀(美國Thermo公司)；組織包埋機(德國Leica公司)；倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；蛋白質印跡(Western blot)電泳和轉膜系統(美國Bio-Rad公司)；聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜，美國Millipore公司)

1.4 實驗方法

1.4.1 造模依據 LPS是細菌細胞壁的主要成分，是誘導膿毒癥ALI/ARDS的關鍵因素之一，LPS可導致炎癥細胞滲透，誘導炎癥因子和細胞因子的產生，隨后啟動和傳播ALI/ARDS中的炎性反應[6]。

1.4.2 分組、給藥及造模 將40只小鼠隨機分為對照組、模型組、透邪解毒湯低濃度組及透邪解毒湯高濃度組，每組10只。對照組和模型組每日均予0.9%氯化鈉注射液0.2 mL灌胃，透邪解毒湯低濃度組每日予1 g/mL透邪解毒湯藥液0.2 mL灌胃，透邪解毒湯高濃度組每日予2 g/mL透邪解毒湯藥液0.2 mL灌胃，各組均連續灌胃5 d后，除對照組外，其余3組小鼠分別給予腹腔注射LPS(10 mg/ mL)0.2 mL誘導建立ALI模型，并在LPS注射24 h后進行肺泡灌洗，收集肺泡灌洗液，然后將小鼠處死，摘取全部肺組織，備用。

1.5 觀察指標及方法

1.5.1 肺組織病理學評估 各組取3份肺組織樣品，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，然后進行蘇木精-伊紅(HE)染色，在顯微鏡下觀察各組小鼠肺泡病理改變，并根據肺泡壁厚度、炎癥細胞浸潤、肺泡出血和充血情況，采用半定量評分法評估肺損傷情況[7]。肺損傷程度評分：0分=無損傷；1分=輕度損傷；2分=中度損傷；3分=重度損傷；4分=極重度損傷。

1.5.2 肺水腫程度 各組取3份肺組織樣品，用濾紙將組織表面水分擦除干燥，稱質量后(濕質量)，將肺組織置于60 °C的孵箱中48 h，然后再次稱質量(干質量)。計算肺的濕/干質量比，以反映肺水腫程度。

1.5.3 炎癥因子檢測

1.5.3.1 肺組織 各組取3份肺組織樣品，比較肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA表達情況，采實時熒光定量PCR(Real time-PCR)法檢測。使用Trizol試劑提取肺組織中的總RNA，并通過反轉錄得到互補DNA(cDNA)。cDNA稀釋3倍后按照寶生物染料法熒光定量試劑盒說明書進行Real time-PCR檢測操作。引物通過深圳華大基因股份有限公司進行設計，序列見表1。以GAPDH為內參，并使用2-ΔΔCt法計算樣品的相對表達量。

表1 引物序列

1.5.3.2 肺泡灌洗液 各組取3份肺泡灌洗液樣品，檢測肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β的表達情況，均采用ELISA法檢測，具體操作根據試劑盒說明書進行。

1.5.4 信號通路相關蛋白 各組取3份肺組織樣品，檢測肺組織中TLR4/NF-κB通路相關蛋白TLR4、p-NF-κB及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路相關蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38水平表達情況，均采用Western blot法檢測。將各組樣品用RIPA裂解和提取緩沖液溶解，并使用BCA蛋白質檢測試劑盒進行蛋白定量。然后在10%SDS聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳上分離30 g蛋白，隨后將其轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉膜2 h后，將膜分別與不同的一抗(TLR4、p-NF-κB、NF-κB、p-JNK、JNK、p-p38、p38、p-ERK、ERK及GAPDH，1∶1000)孵育，并置于4 ℃下過夜，接著與二抗在室溫下孵育2 h，使用增強型化學發光試劑盒檢測每個條帶，以GAPDH為參照，計算樣品的相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠肺組織病理學表現情況 對照組小鼠的肺組織結構正常，肺壁薄，毛細血管膜壁完好無損，偶見散發炎癥細胞。模型組小鼠出現廣泛的肺泡壁增厚、炎癥細胞浸潤及間質性水腫，表明LPS導致了肺組織出現破壞性變化。透邪解毒湯高、低濃度組小鼠肺損傷較模型組明顯減輕，肺組織結構更清晰，肺壁相對更厚，散發的炎癥細胞更少，表明透邪解毒湯能減輕LPS誘導的ALI小鼠模型的病理改變。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理學表現情況

2.2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量均降低(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅IL-1β 的mRNA相對表達量降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量均降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量比較

2.3 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較 與對照組比較，模型組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高、低濃度組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均降低(P<0.05)。見表3。

表3 各組小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平比較

2.4 各組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質量比比較 與對照組比較，模型組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質量比均增加(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質量比均減少(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅肺濕/干質量比減少(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質量比均減少(P<0.05)。見表4。

表4 各組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質量比比較

2.5 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κB相對表達量均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κB相對表達量均降低(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅TLR4相對表達量降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織TLR4、p-NF-κB相對表達量均降低(P<0.05)。見圖2、表5。

圖2 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白相對表達

表5 各組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達量比較

2.6 各組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量比較 與對照組比較，模型組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量均升高(P<0.05)。與模型組比較，透邪解毒湯高、低濃度組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量均降低(P<0.05)。與透邪解毒湯低濃度組比較，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量均降低(P<0.05)。見圖3、表6。

圖3 各組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白相對表達

表6 各組小鼠肺組織MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量比較

3 討論

ALI是一種嚴重的呼吸系統疾病，其特征是不受控制的氧化應激、肺水腫、炎性反應及中性粒細胞滲透，并可能導致ARDS的發生，臨床治療以肺保護性機械通氣為主，仍缺乏有效的治療藥物，患者死亡率高達30%～60%[8]。膿毒癥是由細菌等病原微生物侵入機體引起的全身炎性反應綜合征，涉及機體多個系統甚至多個臟器的復雜病癥，肺在其病程發展中是常見的受累器官，可造成病理學層面的小鼠肺組織損傷、促炎因子表達升高，是建立小鼠ALI模型的常用方法[9]。

中醫學雖然無ALI病名的記載，但根據其臨床表現為咳嗽、咳痰、氣促、進行性呼吸因難、喘憋、紫紺等肺氣壅遏癥狀，故可歸屬于“暴喘”“風溫肺熱病”等范疇，主要病機為外感溫熱毒邪犯肺。中醫學認為，肺為嬌臟，清虛嬌嫩，易受邪襲，邪氣入侵，氣滯壅結，上逆則喘，邪熱迫瘀，瘀熱互結，毒邪瘀積，壅滯在肺，則肺氣壅遏。ALI病性的核心在于濕、熱、毒蘊結，且彌漫膜原、三焦，根據《瘟疫論》“邪伏膜原”理論，治療當以透邪解毒、清上利下、通利三焦為原則。透邪解毒湯為達原飲與涼膈散的合方，采用達原飲開達膜原，辟穢化濁，清熱解毒，涼膈散清上利下，通達三焦。方中檳榔辛散濕邪，化痰破結；厚樸芳香化濁，理氣祛濕；草果辛香化濁，宣透伏邪；白芍、知母清熱滋陰，可防諸辛燥藥耗散陰津；黃芩清熱燥濕，清利胸膈之熱；連翹、竹葉輕清透散，清利上焦之熱；梔子通利小便，引火下行，清利三焦之熱；大黃、芒硝清熱瀉火，瀉下攻積；薄荷發散風熱，清利咽喉；甘草清熱解毒，調和諸藥。全方合用，可使穢濁得化，熱毒得清，陰津得復，則邪氣潰散，速離膜原，三焦清利。大量臨床研究也表明，達原飲與涼膈散對多種肺損傷性疾病均具有良好的作用。丁瑞叢等[10]研究表明，達原飲能縮短新型冠狀病毒肺炎患者的發熱時間，減輕肺部炎性反應。Ruan X等[11]通過網絡藥理學探索達原飲治療新型冠狀病毒肺炎的潛在作用機制，發現達原飲的潛在作用靶點包括TNF、IL-6等炎癥因子，并通過ELISA檢測發現達原飲治療后患者血清中的IL-6水平顯著降低。康振朝等[12]研究表明，涼膈散能夠降低放療患者血清中IL-6、轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達水平，降低放療患者放射性肺炎的患病率。Yang H等[13]研究發現，涼膈散能通過上調microRNA-21(miR-21)水平，抑制信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)，減少IL-6等炎癥因子的分泌，抑制LPS誘發的ALI。

炎性反應是一種涉及多個病理過程的先天免疫反應，可防止外部病原體感染和細胞損傷，然而長時間的過度炎性反應刺激會引起組織損傷，在ALI及其他炎性反應性疾病的發病過程中起關鍵作用，TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的過度表達是加重炎性反應程度的關鍵因素[14]。因此，降低促炎因子水平有助于減輕炎性反應，并且是治療ALI等炎癥有關疾病的基礎[15-16]。本研究結果顯示，模型組小鼠鏡下可見廣泛的肺泡壁增厚、炎癥細胞浸潤及間質性水腫，肺損傷評分及肺濕/干質量比均高于對照組(P<0.05)，肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均高于對照組(P<0.05)，提示造模后小鼠肺內促炎因子表達水平明顯升高，過度的炎性反應導致肺損傷明顯；透邪解毒湯高、低濃度組小鼠在給予相應治療后肺損傷較模型組明顯減輕，肺組織結構更清晰，肺壁相對更厚，散發的炎癥細胞更少，透邪解毒湯高濃度組小鼠肺損傷評分及肺濕/干質量比均低于模型組(P<0.05)，肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β的mRNA相對表達量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平均低于模型組(P<0.05)，且上述各個指標均低于透邪解毒湯低濃度組(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅在肺損傷評分、肺組織中IL-1β mRNA相對表達量及肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β水平方面低于模型組(P<0.05)，提示透邪解毒湯能有效減輕LPS誘導的肺組織病理損傷及肺水腫，降低促炎因子水平。

TLR作為Ⅰ型跨膜蛋白受體，在先天免疫的啟動中起著至關重要的作用，正常情況下機體通過少量的LPS來啟動TLR4信號傳導途徑，并因此激活免疫系統抵抗病原體的入侵[17-18]。研究表明，TLR4與它的共受體髓樣分化因子2(MD2)可在細胞表面形成異源二聚體，用于鑒定和啟動LPS信號，TLR4-MD2復合物還可激活NF-κB和MAPK信號通路，促進炎癥基因及炎癥因子的表達，從而引發炎性反應[19-20]。然而過度的炎性反應會引起人體內部環境的失衡，因此抑制TLR4信號通路具有重要意義。NF-κB存在于細胞質中，當外部抗原結合到各自的受體，隨后激活NF-κB并促使其轉移至細胞核中，誘導多種炎癥細胞因子的表達[21]。MAPK中的JNK、p38、ERK可以觸發信號級聯反應，從而產生更多的炎癥因子，在炎癥的發病機制中起著至關重要的作用，同時研究發現抑制MAPK信號通路可以抑制NF-κB的激活[22]。蛋白質磷酸化是調節和控制蛋白質活力和功能最基本、最普遍也是最重要的機制，因此我們選擇相關蛋白的磷酸化指標進行觀察。本研究結果顯示，模型組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達量及MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量均高于對照組(P<0.05)；透邪解毒湯高濃度組小鼠肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4、p-NF-κB相對表達量及MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量均低于模型組(P<0.05)，且均低于透邪解毒湯低濃度組(P<0.05)，透邪解毒湯低濃度組小鼠僅肺組織TLR4/NF-κB信號通路蛋白TLR4相對表達量及MAPK信號通路蛋白p-JNK、p-ERK、p-p38相對表達量低于模型組(P<0.05)。提示透邪解毒湯降低炎性反應可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路及MAPK信號通路有關。現代藥理學研究表明，黃芩的活性成分黃芩苷能通過抑制TLR4/NF-κB信號通路，對LPS致內皮細胞炎性反應發揮抑制作用[23]；芍藥的主要成分芍藥苷能顯著抑制巨噬細胞TLR4信號通路，減少炎癥因子的分泌[24]。這些成分可能是透邪解毒湯發揮抗炎作用的物質基礎。

綜上所述，透邪解毒湯對LPS誘導的ALI小鼠具有確切的治療作用，能夠明顯減輕肺組織損傷，改善肺水腫，抑制炎性反應，并具有一定的劑量依賴性，其作用機制可能與抑制TLR4/NF-κB信號通路及MAPK信號通路有關。