NQO1對膀胱癌的生物學特性和預后的影響

矯賓賓，丁振山，黃 濤，徐 鑫，張 冠*

（1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院泌尿外科，北京 100020；2.中日友好醫院泌尿外科，北京 100029）

在我們前期研究中，基于腫瘤微環境中ROS（活性氧）響應型納米載藥體系在膀胱癌的治療中取得了較好的療效[1]，為進一步探究提升ROS 的水平是否造成腫瘤組織和正常組織中ROS 水平的差異，通過查閱相關文獻我們發現ROS 的產生與基因NQO1（NAD（P）H quinone oxidoreductase 1）的表達密切相關[2～5]。在后期研究中，我們擬通過激活NQO1 提高膀胱癌組織中ROS 水平。NQO1 在膀胱癌中的表達與預后的關系、及其在膀胱癌中的生物學信息尚未闡明，本文就NQO1在膀胱癌中的詳細分子生物信息學特性展開研究，為后續進一步利用其調控ROS 產生的能力設計制備級聯放大效應的ROS 響應性納米藥物在膀胱癌灌注化療中的應用奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 數據收集獲取

本研究從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數據庫（https：//cancergenome.nih.ov/，2022-02-03）下載了433 個BLCA 樣本的mRNA 測序數據，其中19 個樣本是正常樣本。并同時下載了相關臨床數據。本研究的全過程都遵守了TCGA 數據庫的相關準則和政策。

1.2 差異表達和富集分析

通過選取腫瘤組織與正常組織樣本做關于NQO1的差異表達，同時通過配對信息，做腫瘤組與正常組的配對差異分析。對比NQO1的表達差異。

根據NQO1 的表達情況，由高到低排列，選取NQO1 表達的中間值為截斷點，分為高表達組和低表達組。對兩組進行差異分析，通過得到的差異基因進一步行富集分析。

1.3 相關分析

Cox 回歸模型log-rank 檢驗比較高、低表達組膀胱癌患者的總生存期（OS），通過預測網站對比無疾病進展生存期（DFS）有無差異，并計算風險比（hazard ratio，HR）。分析NQO1 與臨床相關信息（年齡、TNM、stage分期）的相關性等。

通過TIMER 軟件做NQO1與免疫細胞標記物及免疫細胞的共表達分析，分析NQO1 在膀胱癌中與免疫浸潤的關系。

1.4 統計學方法

應用統計軟件R 語言（4.0.3 版本）進行數據統計分析。采用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線并通過Log-rank檢驗分析。

2 結果

2.1 NQO1基因在正常膀胱及膀胱癌組織中的表達

通過TCGA 膀胱癌mRNA 的數據，我們共得到433個樣本信息。其中腫瘤樣本424個，正常組織樣本19個。通過樣本名稱匹配，我們得到的19個正常樣本為腫瘤樣本中腫瘤的癌旁正常組織，可以行配對差異分析。NQO1 基因在膀胱癌組織中的表達與對應的正常膀胱組織比較，NQO1 基因在膀胱癌組織中的表達顯著降低，無論是配對對比還是腫瘤樣本與正常組織樣本對比，均差異有統計學意義，即NQO1 在腫瘤組織樣本中存在過表達現象。（圖1）。

圖1 A.腫瘤樣本與正常組織對比；B.配對樣本腫瘤組與癌旁正常組織的對比

2.2 差異分析和功能富集結果

以NQO1的表達量分為高低表達，2組進一步做差異分析和功能富集，NQO1 編碼蛋白主要定位于細胞核，分子生物學功能主要為酶和蛋白結合，生物學過程主要為信號調控。而相關信號通路主要富集于癌癥相關信號通路如細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路等。如圖2所示。

圖2 以NQO1表達量分為高低2組后，差異基因的功能富集分析

2.3 NQO1的表達與臨床信息的相關性分析

我們分別就與年齡、TNM、分期做了進一步分析，發現NQO1與上述無明顯統計學相關。如圖3所示。

圖3 NQO1的表達與臨床信息的相關性

在與預后相關性的研究中，我們基于TCGA發現其表達與總體生存期無明顯相關性。通過網站分析工具（http：//gepia2.cancer-pku.cn/#index）結合TCGA 及GTX 數據庫，在疾病無進展生存期方面，NQO1 與預后有明顯相關性，并對相關臨床因素做了獨立風險因素分析，NQO1 非影響膀胱癌總體生存期的獨立風險因素。需要額外說明的是，因為此網站分析工具是基于TCGA 及GTX 數據庫，所以部分數據可能與TCGA 實時數據庫的信息有少許出入，如圖4所示。

圖4 A.NQO1高低表達2組在膀胱癌中總體生存期的比較；B.NQO1高低表達2組在腫瘤無進展生存期中的比較

2.4 NQO1在膀胱癌中的表達與免疫浸潤的關系

通過線上工具TIMER，我們發現NQO1 的表達與部分免疫細胞存在相關性，如B 細胞（正相關），CD8+T 細胞（負相關），CD4+T 細胞（負相關），與巨噬細胞以及中性粒細胞無明顯相關性；我們進一步探究了NQO1 在膀胱癌中的表達與免疫細胞標記物的共表達分析，我們發現NQO1的表達與大多數各類免疫細胞的標記物存在共表達相關性。具體如下,B 細胞標記物：CD19（負相關），CD79A（負相關）；CD8+T 細胞：CD8A（負相關），CD8B（負相關）；CD4+T 細胞：CD4（負相關）；巨噬細胞：NOS2（負相關），IRF5（正相關），PTGS2（負相關）；中性粒細胞：CEACAM8（負相關），ITGAM（負相關），CCR7（負相關）。如圖5、圖6所示。

圖5 NQO1表達與免疫細胞的關系

圖6 NQO1表達與免疫細胞標記物的關系

3 討論

在我們前期研究中，我們通過設計ROS 響應型的納米載藥體系，在膀胱癌灌注化療中取得了較好的療效，但我們發現僅僅依靠膀胱癌腫瘤組織中自有的較高的ROS 水平來實現腫瘤組織和正常組織的ROS 水平的差異依然相對不足。所以，我們希望通過進一步提高腫瘤組織中的ROS水平擴大與正常組織的差異來實現ROS 響應性藥物對腫瘤組織的高選擇性殺傷。通過查閱相關文獻，我們發現NQO1 與ROS 的產生密切相關。NQO1 是一種黃素蛋白，作為同型二聚體發揮作用，與FAD 結合的每個單體都會催化多種醌的強制性雙電子還原為它們的氫醌形式，會消耗細胞輔助因子NADH或NADPH[6]。這些對氫醌的形式通常非常不穩定，會自發與氧氣反應，并轉化回母體醌。這種無效循環會導致顯著的NAD（P）H 氧化并產生ROS，包括最終導致過氧化氫（H2O2）形成的超氧化物。H2O2的產生會產生氧化應激并促進細胞死亡[7]?；诖?，我們希望通過選擇合適的方法進一步擴大腫瘤組織與正常組織二者之間ROS 水平的差值，增大藥物的治療窗口，實現級聯放大效應。NQO1 底物如蘭雪醌、β-拉帕酮（LAPA）、丹參酮IIA 可通過NQO1 介導的氧化還原循環觸發過量的ROS 形成誘導癌細胞凋亡，并已成為一種有前途的選擇性抗癌療法[8]。有研究指出，在PEG-PMAN 嵌段共聚物膠束中共包封LAPA 和ROS響應前藥BDOX，有效地建立了級聯放大藥物釋放系統[9]。但LAPA 存在藥代動力學弱、生物利用度有限、水溶性差、半衰期短、需要給藥系統等障礙[10～12]。仍需尋找更為合適的NQO1底物。

NQO1 是一類通常在真核細胞中表達的黃素蛋白酶。它通過電子還原反應積極參與各種醌的代謝及其體內生物活化[13]。與正常細胞相比，NQO1 的表達水平在許多實體瘤細胞中高度上調。相對于正常組織樣本，NQO1 水平在多種癌癥類型中表達水平顯著增加，如肺癌、結腸直腸癌和乳腺癌等[14～16]。NQO1 因其在腫瘤中的過表達和生物活性而被認為是候選分子靶標。但NQO1在膀胱癌中的表達情況及生物信息學特性尚未有過較為全面的探究，本文的研究結果為后續實驗奠定理論基礎。

目前對腫瘤微環境相對于正常組織的成分差異目前已成為智能納米藥物的介入點。所以，目標成分在腫瘤組織和正常組織中的顯著差異是產生響應以提高靶向性的前提基礎。在本研究中，通過TCGA 下載的膀胱癌的表達矩陣，無論從腫瘤樣本與正常樣本的常規對比，還是配對對比，均發現NQO1 在腫瘤標本與正常標本之間存在差異性表達，這為ROS 響應性納米藥物基于NQO1 的差異表達在膀胱癌中的應用提供了前提條件，也是本研究關注的主要研究結果。但目前的腫瘤微環境和正常組織中的差異是否足以產生有效的刺激響應有待于進一步實驗探究。

在臨床及預后的相關性研究中，我們發現NQO1 的表達與疾病無進展生存期存在相關性，但與總體生存期無顯著相關性。同時，對于與臨床信息如TNM 分期及分級相關性方面，NQO1 的表達與其無明顯相關性。這可能對設計的納米藥物提出挑戰，是否注重應用NQO1 本身的對膀胱癌細胞的殺傷作用，還是著重對NQO1 本身產生ROS 進行重點設計，需要進一步權衡。NQO1 對疾病的進展相關，且NQO1 的高表達對應更差的疾病進展，基于此，是否可以設計一款針對NQO1的納米藥物，抑制NQO1 的表達，延緩疾病進展，提高預后效果。

目前腫瘤微環境的概念逐漸成為研究熱點，免疫浸潤和腫瘤微環境對各種腫瘤發生、發展起重要作用，腫瘤分子特征和免疫微環境的動態相互作用可產生不同臨床結果。本研究顯示，NQO1與膀胱癌浸潤B細胞、CD8+T細胞、CD4+T細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞顯著相關，即NQO1 的表達水平與免疫標志物CD19、CD79A、CD8A、CD8B、CD4、NOS2、IRF5、PTGS2、CEACAM8、ITGAM、CCR7 等顯著相關，表明NQO1 在腫瘤免疫浸潤細胞中具有重要調節作用，可能與腫瘤免疫逃逸有關。這為后續我們制備納米載藥體系是否可以聯合免疫治療提供一個新思路。

雖然我們在本研究中，對NQO1 在膀胱癌中的生物信息學作用做了比較詳細的研究，但在應用實際臨床樣本進行驗證尚缺部分數據，其次，對于NQO1 與腫瘤的重要預后指標理論上無明顯相關性，這對后期的納米藥物設計的功能偏重方向提出挑戰。

綜上所述，本研究對于NQO1 在膀胱癌中的生物信息學作用進行了較為詳細的闡述，基于NQO1 導致ROS 水平在腫瘤和正常組織的差異，設計制備ROS響應性的納米藥物可行性較高。