外源性透明質酸對人牙周膜細胞增殖及成牙骨質、成纖維分化的影響

金潔琪，光夢凱

（1.首都醫科大學附屬北京友誼醫院口腔科，北京 100050；2.中日友好醫院口腔醫學中心，北京 100029）

透明質酸（hyaluronan，HA）廣泛存在于人體軟組織及結締組織，包括牙周膜組織等的細胞外基質中，其對抗炎、傷口愈合起關鍵作用，目前臨床上應用廣泛[1，2]。內源性HA 作為牙周膜組織的重要組成部分，可以抗炎并促血管生成及傷口愈合[3]，而外源性HA 對牙周組織的應用有待進一步研究。人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）有分化潛能[4]，本實驗旨在研究在HA 的作用下其增殖及分化的情況，為HA 應用于牙周疾病的治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

細胞為慕尼黑大學牙學院基礎實驗室自有hPDLCs 細胞系。成骨誘導（osteogenic stimulation，OS）液：FBS，盤尼西林鏈霉素，地塞米松，L-抗壞血酸，β-甘油磷酸鹽，抗壞血酸等（均來自美國Sigma 公司）加入細胞培養液配成。HA 來自Hyalose 公司。查文獻后選擇分子量3～6Da 的Nano HA 及分子量150K Da 的HA。實驗中HA 濃度為20ng/ml[5]。

1.2 實驗方法

實驗分組：空白對照組（Con）；OS 組（osteogenic stimulation，+OS，陽性對照）；Nano HA 組（+OS+Nano HA）；150K HA組（+OS+150K HA）。

21d 細胞培養：hPDLCs 培養于37℃，5% CO2的恒溫箱中，每周換液2 次。每周同一時間對細胞進行顯微鏡拍照及形態學觀察。

細胞增殖WST-1檢測：將hPDLCs均勻種在4盒48 孔培養皿中，等待48h，細胞完全附著生長后，標記為起點，分別在第0d，7d，14d，21d 進行細胞增殖測驗。WST-1 試劑盒來自Roche 公司，加入培養皿30min后，將細胞進行ELISA測試。

對牙骨質相關的牙骨質附著蛋白（cementum attachment protein，CAP），牙骨質蛋白（cementum protein 1，CEMP1），韌帶相關的Scleraxis（SCX），感染相關的Toll 樣受體（toll like receptor 4，TLR4）基因進行rt-PCR 檢測：將hPDLCs 均勻種在6孔培養皿中，等待48h，細胞完全附著生長后，標記為起點，分別在第0d，3d，7d，21d 刮取細胞，提取RNA，轉化為cDNA 后，進行rt-PCR 試驗。管家基因選擇甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase，GAPDH）。具體基因序列見表1。1.3 統計學方法

表1 rt-PCR檢測的標記物的基因序列

應用Prism 8.0 軟件進行數據分析。兩兩比較采用t檢驗，組間比較采用one-way ANOVA。

2 結果

2.1 hPDLCs21d細胞培養的形態學觀察

由圖1（見封二）可見，A 組空白對照組中hPDLCs 呈梭形生長，隨著培養時間的增加，集落逐漸融合，細胞均勻聚集分布，培養后期細胞逐漸經緯狀交疊，細胞形態尖銳，邊緣伸展（圖A1～A3）。C 組為Nano HA 組（圖C1～C3），D 組為150K HA組（圖D1～D3），細胞形態均較空白對照組較為圓鈍，邊緣收縮，細胞培養后期（21d）時尤為明顯。B 組為成骨誘導的陽性對照組OS 組（圖B1～B3），hPDLCs 形態介于空白對照組及HA 組之間，較空白對照組圓鈍，但細胞收縮程度不如HA組明顯。

圖1 hPDLCs培養7d、14d、21d時顯微鏡下觀察照片（×10）

2.2 HA抑制hPDLCs增殖

實驗初期，各組細胞生長速度接近，組內無統計學差異。從第7d 開始，空白對照組顯著高于OS 組及150K HA 組（P＜0.01）；OS 組顯著高于Nano HA 組（P=0.0009）。第14d 時，hPDLCs 增殖速度空白對照組＞OS 組＞Nano HA 組＞150K HA 組。第21d 時，空白對照組增速顯著高于Nano HA 組及150K HA組（P＜0.01）；OS組細胞增殖速度亦顯著高于Nano HA 組及150K HA 組（P=0.0398，P=0.0057）。Nano HA 與150K HA 兩組之間細胞增殖速度無明顯差異。綜合看來HA 對hPDLCs 增殖明顯有抑制作用，見圖2。

圖2 PDLCs WST-1增殖實驗

2.3 HA抑制hPDLCs表達CAP

圖3A 示，7d 時4 個組的CAP 表達均達到高峰，而21d 時回落至初始線以下。3d 時可見空白對照組比OS，Nano HA 組及150K HA 組都高（P＜0.01）；OS 組亦高于150K HA 組（P=0.0191），可見150K HA 對CAP 表達有抑制作用。7d 時2 個HA組CAP 表達亦低于空白對照和OS 組，Nano HA組更是低于150K HA 組（P=0.0103）。21d 時，HA組的CAP表達亦低于空白對照組，而與OS組無統計學差異。總之HA 基本上抑制hPDLCs 表達CAP。

2.4 HA抑制hPDLCs表達CEMP1

圖3B 示，HA 刺激下，hPDLCs 中CEMP1 的表達與CAP 類似，7d 時均有較高的表達，21d 時回落。3d 時，HA 對CEMP1 的表達有抑制作用，HA組均低于空白對照組和OS 組。7d 時，空白對照組最高，而OS 組，Nano HA 組及150K HA 組內無明顯差異。21d 時，Nano HA 組與空白對照組的CEMP1 表達無明顯差異；而空白對照組的表達高于OS組及150K HA組（P=0.0036，P=0.0004）；Nano HA 組的CEMP1 表達亦高于150K HA 組（P=0.0375）。總之HA，尤其是150K HA抑制hPDLCs表達CEMP1。

2.5 150K HA先促進后抑制hPDLCs表達SCX

圖3C 示，hPDLCs 的表達量很低。前3d 各組之間SCX的表達差異無統計學意義。7d時，OS組和150K HA 組的SCX 表達顯著高于空白對照組，亦顯著高于Nano HA 組（均P＜0.01）。21d 時，空白對照組SCX 表達升高，而150K HA 組表達降低，顯著低于空白對照組，P=0.004）。

圖3 hPDLCs rt-PCR 中CAP、CEMP1、SCX的表達

2.6 HA促進hPDLCs表達TLR4

圖4 示，前期hPDLCs 的TLR4 表達在較低水平，而在21d 時顯著提升。3d 時HA 組TLR4 表達顯著高于空白對照組及OS組；Nano HA組亦高于150K HA 組（P=0.0378）。7d 時各組表達均高于空白對照組，而150K HA 組則低于OS 及Nano HA 組（P=0.0461，P=0.0132）。21d 時各組高于空白對照組，而OS 組、Nano HA 組及150K HA 組之間差異無統計學意義。總之，HA 尤其是Nano HA，促進hPDLCs表達TLR4。

圖4 hPDLCs rt-PCR 中TLR4的表達

3 討論

本實驗細胞形態學觀察中，在Nano HA 和150K HA 刺激下，hPDLCs 形態較空白對照組明顯圓鈍；印證了Al-Rekabi等學者的研究成果：HA可提高hPDLCs 的收縮性，且降低其細胞遷移能力。該實驗中，HA 刺激下的hPDLCs 形態較對照組明顯收縮[6]。HA 對大部分細胞有抑制增殖的作用[7]，在本實驗中亦得到了驗證。不過也有學者研究發現HA 可以促進PDL 細胞增殖[8]，其觀測時間為細胞種植后的3d 和5d，與本實驗不同；且使用的HA 分子量未知，而HA 對細胞的作用與HA的分子量相關，因此與本實驗結論相悖。

牙周附著喪失是牙周炎癥的重要表現。CAP和CEMP1 是牙周附著及牙骨質相關蛋白[9]。hPDLCs是具有分化潛能的細胞，在適當的誘導下可以分化為成牙骨質細胞[10]。可惜在本實驗中，2種HA 都對hPDLCs 的成牙骨質分化起抑制作用。7d 時所有組CAP 及CEMP1 表達均升高而在21d回落，HA 組表達CAP 均低于空白對照組，但無統計學差別；21d 時150K HA 明顯抑制CEMP1 表達。SCX 是調節成纖維細胞形成纖維組織的蛋白，可以促上皮細胞向間充質細胞轉化，對組織愈合纖維形成起關鍵作用[11]。此外SCX還可以機械壓力下促進腱細胞轉化和增殖，從而修復肌腱[12]。本實驗發現150K HA 在7d 可促進SCX 表達，而在21d 時抑制hPDLCs 表達SCX。考慮到牙周組織承受各種咀嚼壓力，因此很有必要進一步研究HA 對SCX 的調節作用。TLR4 是炎癥相關因子，炎癥狀態下可激活組織免疫反應[13]。TLR4 還可以調節hPDLCs 的成骨分化[14]。本實驗中，2 種HA，尤其是Nano HA，在3d 可明顯促進hPDLCs表達TLR4，21d 時OS 組與HA 組間無差異，但亦均明顯高于空白對照組。HA 可誘導受損組織中成纖維細胞和角質細胞分化以修復受損傷的組織[15]。此外HA 還可以誘導軟骨、韌帶的修復及hPDLCs 神經方向的分化[16，17]，且可以促進hPDLCs早期成骨分化[8]。有學者在老鼠牙周炎模型上使用了HA 凝膠，得到很好的骨再生[18]。因此HA在牙周炎患者的臨床應用還是很有前景。