生色底物法測定肝素鈉的效價

郝士婧 張黎 王琪

（上海上藥第一生化藥業有限公司 上海 200240）

肝素是世界上最有效和臨床用量最大的抗凝血藥物，主要應用于心腦血管疾病和血液透析治療，其中，其在血液透析治療中是唯一有效的特效藥物[1-2]。

中國藥典2020年版、美國藥典、歐洲藥典均收錄了生色底物法測定肝素鈉的效價[3-5]，文獻所報道的內容多側重于生色底物法與兔全血法進行方法對比[6-7]，抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子反應特性[8-9]，減少實驗試劑用量的研究[10-12]等。本研究使用兩種不同的測試手段進行生色底物實驗，考察兩種手段的實驗特性，對比實驗結果，給實驗室提供更加合適的實驗方案。

實驗生色底物法利用生色底物在特定可見光下的吸光度來定量反應程度，可見光和吸光度可以由紫外可見分光光度計或酶標儀兩種技術手段提供，由于方法采用了生物檢定量反應的平行線法，考慮酶標儀樣品池恒溫并且一次多量的讀數方式更為便捷，但得到的數據可信限率經常在5%以上[6-7]。采用紫外可見分光光度計需配備另外的恒溫裝置，由于紫外可見分光光度計所需求的待測溶液量較大，操作方法更復雜，相應的實驗成本也較高。實驗室擬考察采用紫外可見分光光度計和酶標儀兩種方法，對比它們的便捷程度、實驗成本、結果可靠信和可信限率。

1 材料和方法

1.1 實驗原理

血液中Ⅱa因子和Ⅹa因子起到了凝血作用的90%以上，生色底物法就是測定肝素鈉抗Ⅱa因子活性和抗Ⅹa因子活性。肝素鈉激活抗凝血酶，被激活的抗凝血酶與加入的凝血酶反應，隨即在體系中加入過量的生色底物，底物與未發生反應的抗凝血酶結合，而體系中剩余的生色底物在一定的波長下有光吸收，可經過測定定量，即可反推出體系中的抗凝血作用量[9-11]。原理示意圖見圖1。

圖1 生色底物實驗原理示意圖

1.2 實驗儀器及試劑

UV2550/UV2700型紫外可見分光光度計（日本島津公司）；Spectra Max M2型酶標儀（美國Molecular公司）；中國藥典生物鑒定統計程序BS2000。

發色底物S-2238和S-2765、抗凝血酶Ⅲ（10 IU）、Ⅹa因子（71 nkat）（Chromogenix公司）；Ⅱa因子（580 IU，Hyphen BioMed公司）；三羥基氨基甲烷（國藥集團化學試劑有限公司-沃凱）；聚乙二醇6000（國藥集團化學試劑有限公司）；肝素鈉原料藥（東營天東制藥有限公司提供）；肝素鈉注射液（上海上藥第一生化藥業有限公司生產）。

1.3 實驗方法

1）紫外可見分光光度法（UV-VIS） 根據CHP2020，抗Ⅱa因子效價測定：樣品與標準品分別配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待測液，抗凝血酶0.25 IU/mL，凝血酶5 IU/mL，底物0.625 mmol/L。使用紫外可見分光光度法，反應在37 ℃恒溫水浴中進行，順次加入標準品/樣品100 μL，抗凝血酶100 μL，凝血酶200 μL，底物 200 μL，反應終止劑50%醋酸200 μL，每隔12 s順次加入反應試劑。在405 nm波長處測定吸光度，需平行測定兩次。

2）酶標儀法（ELIASA） 樣品與標準品分別配置成0.023 0、0.017 2、0.012 9、0.009 7 IU/mL的待測液，抗凝血酶0.25 IU/mL，凝血酶5 IU/mL，底物0.625 mmol/L。使用酶標儀，反應溫度37 ℃，利用酶標儀自帶的加熱搖勻功能混勻。順次加入標準品/樣品25 μL，抗凝血酶25 μL，凝血酶 50 μL（16 IU/mL），底物 50 μL，反應終止劑50%醋酸200 μL，反應試劑的加入采用8通道移液槍差量加入法。在405 nm波長處測定吸光度，平行測定兩次。

3）抗Ⅹa因子效價測定 樣品與標準品分別配置成0.049 0、0.034 3、0.024 0、0.016 8 IU/mL的待測液，抗凝血酶1 IU/mL，Ⅹa因子0.4 IU/mL，底物1 mmol/L。反應方法參考抗Ⅱa因子效價測定方法[3]。

檢測數據通過BS2000統計得出實驗結果，當實驗數據的回歸P值小于0.01，偏離平行P值大于0.05，二次曲線P值大于0.05，反向二次曲線P值大于0.05，且可信限率（FL）小于10%時實驗數據有效。

2 結果

2.1 UV-VIS測定肝素鈉效價

測定了3批原料藥和3批針劑的抗Ⅱa因子效價（表1）和Ⅹa因子效價（表2）。其線性回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線的P值均達到中國藥典2020年版四部通則1431生物檢定統計法可靠性測驗的要求，而可信限率值和相對標準偏差均較小。

表1 UV-VIS測定抗Ⅱa因子效價

表2 UV-VIS測定抗Ⅹa因子效價

2.2 ELIASA測定肝素鈉效價

同樣測定了3批原料藥和3批針劑的抗Ⅱa因子效價（表3）和Ⅹa因子效價（表4）。其線性回歸、偏離平行、二次曲線和反向二次曲線P值均達到要求，可信限率值小于10 %，相對標準偏差小于4 %。

表3 ELIASA測定抗Ⅱa因子效價

表4 ELIASA測定抗Ⅹa因子效價

2.3 兩種方法結果對比

兩種檢測方法所獲數據的對比表明，其所測效價較一致，相對標準偏差在2%左右。UV-VIS的平均相對標準偏差比ELIASA小2%左右，其實驗重現性較好；UVVIS的可信限率較ELIASA小5%，故其實驗數據較準確可信。不過，ELIASA的檢測用時明顯小于UV-VIS（表5）。

表5 兩方法測定肝素鈉效價的比較

3 討論

相較于文獻中使用更多的ELIASA測定法[6-10]，UV-VIS的可信限率明顯更低，實驗數據較準確可信。UVVIS法需按待測順序每隔12 s順次加入反應試劑，并進行手動混均，共計54次，對時間準確性要求和實驗人員操作要求較高。

UV-VIS由于需要的待測溶液量較大，所以實驗成本較高，但在使用了石英黑壁微量比色皿，并在樣品池中加墊片后可大大減少待測溶液用量，大幅降低實驗成本，可彌補UV-VIS試劑成本較高的缺陷。

無論采用UV-VIS還是ELIASA，生色底物法測定肝素鈉效價可獲得較精準的測定數據，所采用的儀器設備和試劑試液相較于生物測定兔全血法更易于操作控制，實驗誤差可控。兩種方法均可獲得可靠有效的檢測數據，有較好的實驗室可行性。同時對兩種實驗方法的不斷優化提出了進一步要求，即進一步降低UV-VIS法操作難度，進一步降低ELIASA測定法的可信限率等。