毛柳苷在腦缺血再灌注后抑制神經(jīng)元自噬及神經(jīng)保護(hù)作用研究

溫少紅，劉寬，趙順英，董雯，陳青芳，陳文濤，葉維貞，姜鳴鈺，劉向榮

卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致人類死亡和殘疾的主要疾病之一，其中缺血性卒中占卒中總數(shù)的87%，嚴(yán)重威脅著人類的健康，同時(shí)也大大增加了醫(yī)療保健的社會(huì)經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-2]。時(shí)間窗內(nèi)溶栓是目前最有效的缺血性卒中再灌注治療方法，但是溶栓治療的時(shí)間窗窄且有出血轉(zhuǎn)化的風(fēng)險(xiǎn)，限制了其應(yīng)用[3]，尋找新的缺血性卒中治療靶點(diǎn)和藥物是目前的研究熱點(diǎn)。

紅景天作為傳統(tǒng)植物藥，已被廣泛用于預(yù)防和治療疲勞、疼痛、阿爾茨海默病、抑郁和焦慮等常見疾病[4]。毛柳苷（salidroside，SAL）是從紅景天中提取的一種苯丙素苷，是紅景天的主要生物活性成分，具有抗炎、抗凋亡、抗缺氧、抗抑郁、抗氧化應(yīng)激等多種藥理作用[5-6]。自噬是一種自我吞噬的細(xì)胞分解代謝途徑，通過降解和回收長(zhǎng)壽命的蛋白質(zhì)、受損的細(xì)胞器和錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和正常的細(xì)胞功能[7-8]。近年來研究發(fā)現(xiàn)自噬在缺血性卒中中發(fā)揮著重要作用[9-12]。本研究旨在探索SAL是否通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元自噬在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物及配制 本研究藥物SAL（Sigma-43866，美國(guó)），規(guī)格25 mg，其分子式為C14H20O7，分子量為300.30。將一支SAL溶于1.25 mL磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），在無(wú)菌環(huán)境中采用0.22 μm一次性針頭式濾器（Millipore，美國(guó)）過濾溶解的藥液以除菌，該貯存液濃度為20 mg/mL（摩爾濃度66.6 mmol/L）。體內(nèi)研究中，小鼠的給藥劑量為10 mg/kg，小鼠體重22±0.5 g，每只小鼠實(shí)際給藥量為0.22 mg，每只小鼠給藥體積為150 μL（139 μL PBS+11 μL貯存液，臨用前現(xiàn)配）。體外研究中，大鼠原代神經(jīng)元的給藥劑量為50 μmol/L，給藥時(shí)每毫升細(xì)胞培養(yǎng)液中加SAL貯存液0.75 μL。大鼠原代神經(jīng)元接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿（Corning，美國(guó)），接種量為6×105個(gè)/皿，每皿細(xì)胞實(shí)際給藥量為0.12 mg。

1.2 體內(nèi)研究

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取8～10周C57BL/6J雄性小鼠36只（購(gòu)于北京華阜康生物科技股份有限公司）。本實(shí)驗(yàn)遵照北京市神經(jīng)外科研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理委員會(huì)要求進(jìn)行（動(dòng)物倫理批號(hào)：201902039），實(shí)驗(yàn)小鼠采用標(biāo)準(zhǔn)飼料和純凈水分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度22～24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h循環(huán)照明。

1.2.2 腦缺血再灌注模型制作與給藥 小鼠稱體重后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（12只）、溶劑組（12只）和SAL組（12只）。異氟烷（瑞沃德，中國(guó)）麻醉小鼠，分離右側(cè)頸總及頸內(nèi)外動(dòng)脈，線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈閉塞模型（middle cerebral artery occlusion，MCAO），線栓（Doccol-602156PK5Re，外徑0.21 mm、硅膠包被長(zhǎng)度5～6 mm，美國(guó)）自頸外動(dòng)脈插入，插栓缺血1 h后，拔栓實(shí)現(xiàn)再灌注，即刻尾靜脈注射150 μL SAL（SAL組）或同體積PBS（溶劑組）進(jìn)行再灌注。假手術(shù)組只分離血管不插栓且不給藥。術(shù)中通過激光多普勒血流儀（瑞沃德，中國(guó)）監(jiān)測(cè)腦血流判斷模型是否成功，體溫維持儀維持小鼠術(shù)中肛溫37±0.5 ℃。

1.2.3 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 缺血再灌注后24 h盲法對(duì)小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分[13]。運(yùn)動(dòng)功能缺損評(píng)分：①提起小鼠尾巴，正常為0分，前肢或后肢彎曲為1分，頭部在30 s內(nèi)向垂直軸方向移動(dòng)＞10°為1分，最高3分；②將小鼠放在地板上，正常行走為0分，不能直線行走為1分，身體向患側(cè)傾斜為2分，身體倒向患側(cè)為3分。感覺功能缺損評(píng)分：①采用尖銳的針尖觸摸小鼠前爪掌區(qū)測(cè)評(píng)其觸覺反應(yīng)，正常為0分，反應(yīng)遲緩為1分，無(wú)反應(yīng)為2分；②用棉簽壓住小鼠一側(cè)頸部來評(píng)估本體感受反應(yīng)，正常為0分，反應(yīng)遲緩為1分，無(wú)反應(yīng)為2分。神經(jīng)功能缺損評(píng)分總分為10分，分值越高，小鼠的神經(jīng)功能缺損越嚴(yán)重。

1.2.4 腦梗死率測(cè)定 缺血再灌注后24 h且神經(jīng)功能缺損評(píng)分結(jié)束后，處死小鼠并取每組12只小鼠全腦進(jìn)行冰凍切片。從前至后每隔1 mm選取20 μm厚的一片切片，使用神經(jīng)元特異核蛋白（neuronal nuclei，NeuN）抗體（Millipore-ABN78，美國(guó)，1∶600）染色，共標(biāo)記7個(gè)層面的神經(jīng)元。通過Vectra Polaris全自動(dòng)成像系統(tǒng)（Perkin-Elmer，美國(guó)）拍攝熒光圖片，并采用ImageJ軟件對(duì)熒光圖片進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。患側(cè)每層神經(jīng)元損傷體積=患側(cè)神經(jīng)元損傷面積×層厚，患側(cè)神經(jīng)元總損傷體積為每層神經(jīng)元損傷體積之和；健側(cè)每層神經(jīng)元體積=健側(cè)神經(jīng)元面積×層厚，健側(cè)神經(jīng)元總體積為健側(cè)每層神經(jīng)元體積之和；小鼠腦梗死率=（患側(cè)神經(jīng)元總損傷體積/健側(cè)神經(jīng)元總體積）×100%（左側(cè)大腦為健側(cè)，右側(cè)大腦為患側(cè)）。

1.2.5 免疫組織熒光染色 選取制備的小鼠全腦冰凍切片進(jìn)行免疫組織熒光染色，切片依次進(jìn)行破膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）封片。①選取溶劑組小鼠全腦冰凍切片，將自噬標(biāo)記物微管相關(guān)蛋白1輕鏈3B（microtubule associated protein 1 light chain 3 beta，LC3B）（CST-83506，美國(guó)，1∶500）分別與NeuN（Millipore-ABN78，美國(guó)，1∶600）、膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）（abcamab68428，美國(guó)，1∶500）免疫熒光共染并標(biāo)記梗死周邊區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞。使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國(guó)）觀察LC3B與神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位情況，以明確缺血再灌注后24 h產(chǎn)生自噬活動(dòng)的主要部位。②每組選取3只小鼠全腦冰凍切片，將其他自噬標(biāo)記物Beclin-1（CST-3495，美國(guó)，1∶200）、自噬相關(guān)蛋白3（autophagy related protein 3，Atg3）（CST-3415，美國(guó)，1∶200）分別與NeuN（Millipore-MAB377，美國(guó)，1∶600）免疫熒光共染，使用激光共聚焦顯微鏡（Carl Zeiss AG，德國(guó)）觀察，使用ImageJ軟件分別對(duì)Beclin-1+/NeuN+細(xì)胞、Atg3+/NeuN+細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 體外研究

1.3.1 大鼠原代神經(jīng)元提取及培養(yǎng) 大鼠原代神經(jīng)元取自胎齡18 d SD胎鼠大腦皮層。將腦組織表面的腦膜和血管剔除后，碾碎腦組織并用胰酶消化。隨后將神經(jīng)元以6×105個(gè)/皿的密度接種在裝有神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）的直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并添加2%無(wú)血清添加劑（B-27 supplement，B27）、2 mmol/L L-谷氨酰胺、100 U/mL青霉素/鏈霉素雙抗（Gibco，美國(guó)），培養(yǎng)基及以上添加物終體積為8毫升/皿。每3天進(jìn)行一次半量換液，連續(xù)培養(yǎng)至第10天，用于后續(xù)研究。

1.3.2 大鼠原代神經(jīng)元氧糖剝奪 神經(jīng)元培養(yǎng)至第10天，進(jìn)行氧糖剝奪（oxygen glucose deprivation，OGD）。細(xì)胞分為6組：①對(duì)照（control，CON）組，②氧糖剝奪1 h后復(fù)氧1 h（OGD 1 h）組，③氧糖剝奪1 h后復(fù)氧4 h（OGD 4 h）組，④SAL組，⑤氧糖剝奪1 h后復(fù)氧1 h/全程SAL治療（OGD+SAL 1 h）組，⑥氧糖剝奪1 h后復(fù)氧4 h/全程SAL治療（OGD+SAL 4 h）組。

OGD具體流程如下：超凈工作臺(tái)（ESCO，新加坡）內(nèi)，無(wú)菌PBS清洗神經(jīng)元2次以去除培養(yǎng)基中的葡萄糖，隨后更換為無(wú)添加葡萄糖的達(dá)爾伯克氏改良伊格爾氏培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified Eagle medium，DMEM）（Gibco，美國(guó)）；將神經(jīng)元放置于缺氧小室（Stemcell，美國(guó)），95%N2/5%CO2通入小室內(nèi)以排盡氧氣，平衡5 min后密封缺氧小室，將小室置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，1 h后取出神經(jīng)元復(fù)氧，更換為原神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)基1 h或4 h后收集細(xì)胞。CON組和SAL組不進(jìn)行OGD，其中SAL組在培養(yǎng)皿中加入50 μmmol/L SAL（即6微升/皿SAL貯存液）處理，加藥4 h后收集細(xì)胞，CON組也在4 h后收集細(xì)胞；其余組進(jìn)行OGD，OGD+SAL 1 h組和OGD+SAL 4 h組分別在OGD時(shí)、復(fù)氧后加入與SAL組同等劑量SAL處理，OGD 1 h組和OGD+SAL 1 h組復(fù)氧1 h后收集細(xì)胞，OGD 4 h組和OGD+SAL 4 h組復(fù)氧4 h后收集細(xì)胞。體外實(shí)驗(yàn)流程見圖1。

圖1 大鼠原代神經(jīng)元氧糖剝奪流程圖

1.3.3 免疫印跡試驗(yàn) 裂解“1.3.2 大鼠原代神經(jīng)元氧糖剝奪”中收集的細(xì)胞，12 000轉(zhuǎn)/分離心20 min，取上清液經(jīng)BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（Pierce，美國(guó)）定量后依次進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳、蛋白轉(zhuǎn)膜、膜的封閉、一抗孵育（LC3B、Beclin-1、Atg3、Atg5、Atg7）、二抗孵育、發(fā)光液顯影，通過G：BOX化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Syngene，英國(guó)）檢測(cè)蛋白條帶，使用ImageJ軟件分析圖像并計(jì)算目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)量。免疫印跡所用一抗分別為L(zhǎng)C3B（CST-3868，美國(guó)，1∶1000）、Beclin-1（CST-3495，美國(guó)，1∶1000）、Atg3（CST-3415，美國(guó)，1∶1000）、Atg5（CST-12994，美國(guó)，1∶1000）、Atg7（CST-8558，美國(guó)，1∶1000），酶標(biāo)二抗抗兔IgG（CST-7074，美國(guó)，1∶2000）。同時(shí)在同一膜上測(cè)定肌動(dòng)蛋白（Santa Cruz-1616，美國(guó)，1∶500）的表達(dá)，將其作為內(nèi)參。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3.4 大鼠原代神經(jīng)元免疫熒光染色 CON組、OGD 4 h組細(xì)胞固定后LC3B（CST-83506，美國(guó)，1∶500）與NeuN（Millipore-ABN78，美國(guó)，1∶600）免疫熒光共染，采用EVOSTM FL Auto 2成像系統(tǒng)（Life technology，美國(guó)）觀察神經(jīng)元自噬水平，使用ImageJ軟件對(duì)LC3B+/NeuN+細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 采用GraphPad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以表示；多組比較采用單因素方差分析，在整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的情況下進(jìn)行Tukey檢驗(yàn)進(jìn)行兩兩比較；兩組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體內(nèi)研究結(jié)果

2.1.1 SAL對(duì)缺血再灌注小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用 缺血再灌注后24 h，假手術(shù)組、溶劑組、SAL組小鼠間神經(jīng)功能缺損評(píng)分的整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較顯示，溶劑組和SAL組神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于假手術(shù)組（均P＜0.0001）；SAL組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于溶劑組（P=0.0332）。缺血再灌注后24 h，3組間腦梗死率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較顯示，溶劑組和SAL組腦梗死率均高于假手術(shù)組（均P＜0.0001）；SAL組腦梗死率低于溶劑組（P=0.0038）（表1，圖2）。

圖2 毛柳苷對(duì)缺血再灌注小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

表1 缺血再灌注后24 h小鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分及腦梗死率結(jié)果

2.1.2 LC3B與缺血再灌注小鼠梗死周邊區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位情況 缺血再灌注后24 h，溶劑組小鼠LC3B與神經(jīng)元有共定位（圖3A～B），與星形膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)共定位（圖3C～D）。即缺血再灌注后24 h，小鼠梗死周邊區(qū)神經(jīng)元表達(dá)自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B，然而梗死周邊區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞此時(shí)并未表達(dá)LC3B。

圖3 LC3B與缺血再灌注小鼠梗死周邊區(qū)神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞共定位情況

2.1.3 Beclin-1、Atg3與缺血再灌注小鼠梗死周邊區(qū)神經(jīng)元共染結(jié)果 缺血再灌注后24 h，假手術(shù)組、溶劑組和SAL組3組間單位面積（1 mm2）內(nèi)Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+細(xì)胞個(gè)數(shù)比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較顯示，與假手術(shù)組相比，溶劑組Beclin-1+/NeuN+、溶劑組Atg3+/NeuN+、SAL組Atg3+/NeuN+單位面積內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)均增多（P=0.0010，P＜0.0001，P=0.0005）；與溶劑組相比，SAL組Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+單位面積內(nèi)細(xì)胞個(gè)數(shù)減少（P=0.0121，P=0.0013）（表2）。圖4為Beclin-1、Atg3與NeuN共染免疫熒光代表圖。

圖4 自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg3與腦缺血再灌注小鼠梗死周邊區(qū)神經(jīng)元共染結(jié)果

表2 缺血再灌注后24 h小鼠梗死周邊區(qū)Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果[單位：個(gè)/平方毫米]

2.2 體外研究結(jié)果

2.2.1 SAL對(duì)氧糖剝奪大鼠原代神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響 6組間比較，LC3B、Beclin-1、Atg3的相對(duì)表達(dá)量整體差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Atg5和Atg7的相對(duì)表達(dá)量整體差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩兩比較顯示，與CON組相比，OGD 1 h組、OGD 4 h組LC3B相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.0174、P＜0.0001）；與OGD 1 h組相比，OGD 4 h組LC3B相對(duì)表達(dá)量升高（P=0.0038），SAL組LC3B相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.0476）；與OGD 4 h組相比，SAL、OGD+SAL 1 h組LC3B相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.0001，P=0.0002）；OGD+SAL 4 h組與CON組、OGD 1 h組、OGD 4 h組、SAL組、OGD+SAL 1 h組相比，LC3B相對(duì)表達(dá)量降低（P=0.0002，P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001，P＜0.0001）。OGD+SAL 1 h組Be cl i n-1相對(duì)表達(dá)量低于OGD 4 h組（P=0.0458）；OGD+SAL 4 h組Beclin-1相對(duì)表達(dá)量低于CON組、OGD 1 h組、OGD 4 h組、SAL組、OGD+SAL 1 h組（P=0.0005，P＜0.0001，P＜0.0001，P=0.0002，P=0.0030）。OGD+SAL 4 h組Atg3相對(duì)表達(dá)量低于OGD 1 h組和OGD 4 h組（P=0.0119，P=0.0211）（表3，圖5）。

圖5 自噬相關(guān)蛋白LC3B、Beclin-1、Atg3、Atg5、Atg7免疫印跡代表性條帶

表3 SAL對(duì)氧糖剝奪大鼠原代神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白相對(duì)表達(dá)量的影響

2.2.2 大鼠原代神經(jīng)元自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B免疫熒光染色結(jié)果 CON組神經(jīng)元在單位面積（1 mm2）的LC3B+/NeuN+細(xì)胞個(gè)數(shù)為51.9±18.7個(gè)，OGD 4 h組為584.2±34.5個(gè)，2組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.0002）（圖6）。

圖6 大鼠原代神經(jīng)元自噬標(biāo)記物L(fēng)C3B免疫熒光染色結(jié)果

3 討論

自噬作為維持真核生物中與受損細(xì)胞器形成和降解相關(guān)的細(xì)胞蛋白平衡的重要機(jī)制，越來越多的證據(jù)表明，缺血性卒中激活了各種類型的大腦細(xì)胞的自噬，如神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞和大腦微血管細(xì)胞等[14]，這可能為缺血性卒中的臨床治療提供了潛在的靶點(diǎn)。然而，自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮保護(hù)還是損傷作用仍存在爭(zhēng)議。一般認(rèn)為在神經(jīng)元系統(tǒng)中，適度的自噬具有神經(jīng)保護(hù)作用，因?yàn)樽允捎兄谇宄c神經(jīng)變性相關(guān)的聚集蛋白；不充分或有缺陷的自噬則可能導(dǎo)致神經(jīng)元死亡；而過度的自噬通常由強(qiáng)烈的壓力觸發(fā)，也可促進(jìn)神經(jīng)元死亡[15-16]。自噬的程度和其被誘導(dǎo)的時(shí)間點(diǎn)可能才是真正決定自噬對(duì)缺血再灌注后神經(jīng)元?dú)w轉(zhuǎn)作用的關(guān)鍵因素[17]。

目前已證實(shí)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）、Beclin-1/B淋巴細(xì)胞瘤-2（Beclin-1/B-cell lymphoma-2，Beclin-1/Bcl-2）等多種信號(hào)通路在自噬活動(dòng)中發(fā)揮了調(diào)節(jié)作用[18-20]。其中自噬相關(guān)蛋白Atg3、Atg5、Atg7在自噬中發(fā)揮核心調(diào)控作用：Atg3可以作為E2泛素樣偶聯(lián)酶，促進(jìn)吞噬體伸長(zhǎng)[21]；Atg5是自噬小泡形成不可或缺的蛋白，敲除ATG5基因可導(dǎo)致自噬下調(diào)或完全抑制[22]；Atg7是一種重要的自噬效應(yīng)酶，與其他Atg蛋白協(xié)同調(diào)節(jié)免疫、細(xì)胞死亡和蛋白分泌，可以獨(dú)立調(diào)控細(xì)胞周期和凋亡[23]。LC3即微管相關(guān)蛋白1A/1B-輕鏈3（microtubule-associated proteins 1A/1B light chain 3，MAP1LC3，簡(jiǎn)寫LC3），它包括LC3A、LC3B、LC3C等3種亞型，其中LC3B與自噬小體的發(fā)育成熟有關(guān)，常用于監(jiān)測(cè)自噬活性[24]。自噬發(fā)生時(shí)，胞漿型LC3BⅡ會(huì)酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)樽允审w膜型LC3BⅡ，LC3BⅡ含量增加代表自噬被激活，LC3BⅡ含量降低則代表自噬被抑制，通常采用LC3BⅡ/LC3BⅠ比值評(píng)估自噬水平的高低。此外，Beclin-1可以干預(yù)自噬通路從自噬小體形成到自噬小體/核內(nèi)體成熟的每一個(gè)主要步驟，亦常作為自噬形成的標(biāo)志物之一[25]。

在本次體內(nèi)外研究中SAL的劑量（小鼠10 mg/kg，大鼠原代神經(jīng)元50 μmol/L）參考了本課題前期研究結(jié)果[26]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SAL具有明確的腦缺血再灌注損傷保護(hù)作用，可以顯著改善腦缺血再灌注小鼠感覺運(yùn)動(dòng)神經(jīng)功能，降低腦梗死率。對(duì)腦缺血小鼠進(jìn)行LC3B、NeuN的免疫熒光染色結(jié)果亦證實(shí)了腦缺血急性期梗死周邊區(qū)神經(jīng)元發(fā)生了自噬，而SAL治療可以降低神經(jīng)元自噬水平（SAL組單位面積內(nèi)Beclin-1+/NeuN+、Atg3+/NeuN+細(xì)胞數(shù)量下降）。在大鼠原代神經(jīng)元的OGD研究中，觀察到OGD后神經(jīng)元發(fā)生了明顯的自噬（OGD 1 h、OGD 4 h后LC3B表達(dá)量顯著高于CON組），給予OGD神經(jīng)元SAL處理后，自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、Atg3、LC3B的表達(dá)水平均顯著下降，而Atg5、Atg7在此時(shí)的表達(dá)水平雖然未出現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但存在下調(diào)趨勢(shì)。以上結(jié)果提示SAL治療可能通過抑制神經(jīng)元自噬水平發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，SAL可以作為缺血性卒中臨床治療的潛在藥物，具有十分廣闊的應(yīng)用前景。然而SAL干預(yù)神經(jīng)元自噬水平的具體分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究，這也是本研究的局限性之一。

【點(diǎn)睛】毛柳苷通過下調(diào)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)，抑制神經(jīng)元自噬，在腦缺血再灌注損傷中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。