環介導等溫擴增(LAMP)技術在果樹病毒病檢測中的應用

羅麗婷，蔣君梅，李向陽，謝 鑫*

(1.貴州大學 農學院/農業微生物特色重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 綠色農藥與農業生物工程教育部重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

果樹是指能提供可供食用的果實、種子的多年生植物及其砧木的總稱。其果實不僅含有豐富的維生素營養，而且能夠促進消化，因而深受人們的喜愛。自改革開放以來，我國果樹產業發展迅速，現已成為世界果樹產業第一大國，種植面積和產量都居世界首位。果樹病害頻發是目前制約果樹產業發展的主要原因，病毒是其最常見的致病因子，據報道，目前已發現900多種病毒可引起植物病害，造成的經濟損失可高達600億美元。早期診斷是減少病害損失，阻止病害進一步傳播的有效方法。但由于病毒個體微小，結構簡單，只含有一種核酸(DNA或RNA)，無法用光學顯微鏡觀察，使得病毒診斷存在較大的局限性。隨著時間的推移與研究的不斷深入，病害診斷領域發生了巨大的變革。從標本中分離和鑒定病原，到血清學鑒定的出現，再到酶聯免疫吸附劑測定方法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA)和聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)等檢測方法的出現。檢測效率和靈敏度雖都有不同程度的提高，但昂貴的儀器和繁瑣的擴增后處理過程使其應用受到一定程度的影響。直至2003年環介導等溫擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP)被用于植物病毒病的檢測，才有效地解決了上述問題，該方法不僅操作簡單，而且其靈敏度及效率也高于傳統的ELISA及RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)檢測技術。從2003年至今，LAMP技術已被用于檢測47個屬的100多種病毒。此外，逆轉錄環介導等溫擴增(Reverse Transcription Loop-mediated Isothermal Amplification,RT-LAMP)也已在2個科8個病毒屬中進行檢測。本文將從LAMP技術的原理出發，重點梳理LAMP技術在果樹病毒病檢測中的應用，討論其優缺點，并對LAMP技術在植物病害防治中的應用進行了展望。

1 環介導等溫擴增技術(LAMP)

LAMP是由Notomi和同事設計和開發的一種用于基因診斷和恒溫核酸擴增的方法，最初用于檢測乙型肝炎病毒的DNA。該方法所涉及的嗜熱脂肪芽孢桿菌(，Bst)DNA聚合酶在60～65 ℃的等溫條件下約有60 min的自動循環可置換DNA合成，因此需要由一組專門設計的特異性目標引物啟動，用于識別目標DNA上的特定區域。LAMP檢測引物至少包括正向及反向外引物(F3和B3，僅在非循環步驟中具有鏈位移活性)、正向及反向內引物FIP和BIP，有助于環的形成，其中FIP由F1c和F2兩部分組成；BIP由B1c和B2兩部分組成；F1c和F2c與目標序列中的F1和B1區域互補；有時還包括兩種環引物(LF和LB)以加快LAMP反應效率。LAMP引物是針對每個病原體的目標核酸序列(DNA或RNA)而設計的，通常使用Primer Explore(https://primerexplorer.jp/e/)在線網站設計。

LAMP反應過程(圖1)包括三個步驟:(1)初始步驟：FIP針對特定的互補序列，開始DNA合成。在目標序列的另一端，BIP的DNA擴增也以同樣的方式進行(圖1-a，1-2)；(2)環結構生成：F3進入目標區域，在Bst酶的置換作用下，FIP鏈被取代，形成一個擴增循環的模板。通過兩個連續的擴增周期，即可合成含有目標序列的DNA片段，其末端為環狀結構，用于循環擴增步驟的模板(圖1-a，3-5)；(3)循環放大：類似于初始和環結構產生步驟，但環結構作為單鏈模板。在每個循環中，對于每個單鏈DNA模板，都會有兩個擴增產物，其中一個與模板相同，另一個是模板長度的兩倍。最終得到花椰菜狀混合產物，可通過多種方法檢測，如：雙鏈DNA(dsDNA)結合染料、濁度測量、紫外光照射、實時熒光、凝膠電泳等方法檢測(圖1-b，6-11)。

2 LAMP技術在果樹病毒病檢測中的應用

2.1 蘋果病毒病

蘋果(Mill.)是全球最重要的果樹作物之一，為落葉喬木。蘋果病毒病是制約蘋果可持續生產的一大威脅，如蘋果褪綠葉斑病毒(，ACLSV)和蘋果莖溝病毒(,ASGV)是使蘋果產業嚴重受損的主要病毒。ACLSV和ASGV在感病果樹體內濃度很低，且一般不產生明顯癥狀，因而防治較為困難。目前主要通過使用高靈敏的檢測方法對苗木進行病毒檢測，從而及時對病害進行防治。傳統的ELISA和 RT-PCR技術都可快速識別和區分致病因子，防止病害進一步傳播。然而，在某些情況下，ACLSV和ASGV在感病苗木中含量甚至會低于ELISA和RT-PCR的最低檢測限度，使得蘋果褪綠葉斑病和蘋果莖溝病一直未得到有效的防治。

注：(1)靶標DNA從FIP開始合成到其特定的互補序列B3c為止；(2)F3引物進入B3c序列并開始延伸；(3)在Bst酶作用下，從FIP開始合成的鏈被替換并成為下一個擴增周期的合成模板；(4)從BIP合成DNA；(5)包含目標序列的DNA片段擴增完成；(6)-(7)FIP引物在F2c位點與模板配對，擴增至與模板鏈相同長度；(8)模板鏈在B1c位點處合成至達到原來長度的兩倍；(6)-(11)同上述步驟，在Bst酶的作用下每條模板鏈合成兩條以上新DNA鏈。其中一條與模板長度相同，另一條長度為模板鏈的兩倍。圖1 LAMP反應原理及流程Fig.1 LAMP reaction principle and amplification process

為有效解決上述問題，Zhao等、Kim等于2014年建立了一種簡單、靈敏的RT-LAMP檢測方法，利用設計的外殼蛋白基因引物(表1)，快速檢測ASGV。結果顯示，RT-LAMP檢測出53個被侵染的蘋果葉片樣品，而RT-PCR檢測出49個被侵染的葉片樣品。并通過與ACLSV和蘋果莖痘病毒(,ASPV)的交叉反應，確定了RT-LAMP引物具有特異性。2017年，Peng等首次建立ACLSV的RT-LAMP體系。在多次試驗后確定其最佳反應溫度為64 ℃，最佳反應時間為75 min(表1)，并在現場采集的蘋果樣品上成功檢測出病毒。不同于傳統的檢測技術，RT-LAMP靈敏度高，簡單易行，成本低廉，可在簡單的現場條件下輕松進行，適用于野外條件下及在許多發展中國家進行感染樣品的快速檢測，目前已得到越來越廣泛的應用。

2.2 番木瓜病毒病

番木瓜(Linn.)又名木瓜,是最具經濟價值的番木瓜科水果，營養價值與藥用價值都極為豐富，廣受人們的喜愛，在我國南方多地均有種植。但近年來，番木瓜病毒病頻繁發生，嚴重阻礙了番木瓜的高產與優產。番木瓜環斑病毒(,PRSV)，于1949年在美國被首次報道，屬于馬鈴薯Y病毒屬()，有PRSV-P和PRSV-W兩種類型。該病毒在自然界中極易傳播，已成為全球性的制約番木瓜生產的重大病害，曾在中國華南地區大規模流行，一度被認為是危害中國木瓜生產最廣泛和最具破壞性的病害。此外，與PRVS同屬的番木瓜變形花葉病毒(-,PLDMV)因引起的病害癥狀與PRVS相似，最初被認為是PRSV。病毒基因通過同源性依賴的轉錄后基因沉默(Post-transcriptional Gene Silencing,PTGS)獲得的轉基因抗性是迄今為止保護植物免受包括PRSV在內的病毒感染的最有效途徑。而PLDMV卻可侵染中國臺灣和海南島的抗PRSV轉基因番木瓜，對中國番木瓜商業化生產構成了嚴重威脅。在經過病毒的血清學診斷和全基因組測序后發現，PLDMV為一個獨立的種。為了區分PLDMV和PRSV，已建立ELISA、Western blotting和基于PLDMV基因的RT-PCR等鑒別方式，但效果均不太理想。因此，有必要開發一種快速、靈敏、經濟的檢測PLDMV的方法。2013年Shen等基于PLDMV的保守序列設計了4條RT-LAMP引物(表1)，建立PLDMV的RT-LAMP檢測方法，通過RT-LAMP檢測試驗，僅在PLDMV感染樣本的RNA提取物中獲得陽性結果，因此較好地區分了這兩種病毒。

對于PRSV基因，過去常用RT-PCR進行檢測，但近年來由于PRSV轉基因抗病品種培育的增多，以往的檢測方法已難以完全區分各轉基因品種與感PRSV的番木瓜。研究人員在之前的研究的基礎上，對GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中保存的22個PRSV-P和PRSV-W菌株的基因組序列進行序列比對，發現3基因包含一個高度保守的區域(3552-3736 bp)，還尚未用于轉基因番木瓜抗PRSV基因的開發。以此區域設計LAMP引物靶點，成功設計出了對感PRSV植株病毒RNA有特異性和敏感性的引物(表1)，且對PLDMV的檢測不具有特異性和敏感性。通過檢測PRSV即可區分轉基因番木瓜、感PRSV番木瓜和感PLDMV番木瓜。該方法結合早期開發的PLDMV RT-LAMP檢測方法，為區分木瓜病毒感染提供一個快速、可靠、敏感和經濟的診斷工具。

2.3 櫻桃病毒病

櫻桃(spp.)為薔薇科、櫻屬植物的統稱，營養豐富，含豐富的蛋白質、糖類、維生素及鈣、鐵等多種元素，享有“早春第一果”的美譽。世界上作為栽培的櫻桃僅有櫻桃((Lindl.) G.Don)、歐洲甜櫻桃((L.) Moench.)、歐洲酸櫻桃(Mill.)和毛櫻桃((Thunb.) Wall.)4個種類。甜櫻桃是近幾年來在我國發展較快的果樹之一，其種植面積逐年擴大，但由于栽培過程中的操作不當，尤其對病毒病的重視及預防力度不夠，嚴重影響了櫻桃果品的產量與品質。

目前，國內報道的甜櫻桃病毒病已有14種，主要為櫻桃小果病毒1(,LChV-1)、櫻桃小果病毒2(,LChV-2)和ACLSV等。LChV-1與LChV-2致病力極強，在大多數櫻桃種植區均有發現，被認為是造成櫻桃經濟損失的主要原因，目前尚未找到較好的防治方法，只有通過清除感病的苗木才能控制，需要高效、靈敏、準確的檢測方法為其提供保障。傳統的檢測技術，如：RT-PCR、ELISA等大都存在靈敏度低，操作復雜的問題。因而，研究人員選擇建立LChV-1與LChV-2的RT-LAMP體系。研究發現，RT-LAMP技術在10 min內就能檢測出LChV-1，在67 ℃下進行時效果最佳(表1)。現場檢測病葉結果顯示RT-LAMP檢測速度較RT-PCR顯著提高，靈敏度至少提高了100倍。在對從甜櫻桃中分離出的LChV-2進行廣譜檢測，還發現了其潛在的昆蟲媒介。該研究成果為LChV-1與LChV-2在現場快速診斷應用奠定了基礎，為櫻桃的商業化發展提供了技術支持。

2.4 葡萄病毒病

葡萄(L.)是世界上產量第二大的水果，是世界最古老的果樹樹種之一。近年來，葡萄栽種面積的持續擴大的同時，也造成了葡萄病毒病的快速傳播。到目前為止，已有超過60種病毒在葡萄中發現，嚴重制約了葡萄產業的發展。據血清學調查顯示，多種葡萄病毒病都是由一種單一病毒所引起——葡萄扇葉病毒(，GFLV)。GFLV是已知最早的葡萄病毒，葡萄受侵染后其葉片會退化，導致高達80%的產量損失。預防一直以來都是控制病毒病最重要的方法，但因GFLV在世界范圍內的廣泛分布，導致預防效果一直欠佳，這對病毒檢測技術提出了更高的要求。研究人員通過對雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(DAS-ELISA)、RT-PCR、免疫捕捉反轉錄聚合酶鏈式反應(IC- RT-PCR)、RT-LAMP、免疫捕捉反轉錄環介導等溫擴增方法(IC-RT-LAMP)等幾種檢測方法的評估發現，IC-RT-LAMP為目前檢測GFLV基因的最佳方法(表1)。該檢測方法所需時間最短，且操作簡便,避免了毒性染色材料的使用,可直接用肉眼進行視覺檢測，提高了安全性的同時也降低了成本。

長期以來，盡管人們已對葡萄的主要病毒病有了一定了解，如由GFLV引起的病害，但影響葡萄健康和產業發展的新病毒仍在不斷出現。包括葡萄紅斑點病毒(，GRBV)，于2008年首次在美國加州出現，2012年首次從患病葡萄中提取出該病毒。由其引起的葡萄紅斑病，廣泛分布于北美葡萄種植區，可導致葡萄產量嚴重降低、成熟期大幅縮短。此前，果農一直都通過定期檢測和清除病株的方式來管理葡萄園，往往不能及時發現病害，而導致損失嚴重。直到2019年研究人員建立了一種不需要提取核酸，使用無菌移液管尖端穿刺植物體，即可在無菌蒸餾水中孵育LAMP反應所需模板的技術。試驗結果顯示，“針刺”LAMP檢測方法具有100%的敏感性和96.3%的特異性，進一步使用葡萄紅斑伴隨病毒等溫擴增檢測試紙條(AmplifyRPAcceler8for GRBaV Rapid DNA Test)對GRBaV進行檢測。結果與“針刺”LAMP檢測一致，表明“針刺”LAMP檢測法具有實用性與廣譜性。

2.5 西番蓮病毒病

西番蓮(L)別名百香果，因其香氣濃郁，營養、藥用價值高，而深受消費者的喜愛，有“果汁之王”的美譽。又因其適應性強，種植還具有“短、平、快”的特點，近年來全國種植面積持續增加。目前，西番蓮多為引種栽培，在栽培生產過程中，常常會受到病蟲害的威脅。其中，病毒病對西番蓮產業的發展危害最大，據報道，現已有超過25種病毒可侵染西番蓮。夜來香花葉病毒(,TeMV)為病毒，該病毒首先在越南發現可侵染夜來香屬植物(Cov.)，2014年通過檢測在西番蓮中發現了該病毒。西番蓮受TeMV侵染后，其果實和葉片會出現變形及皺縮等癥狀，使其產量和品質受到嚴重影響。現在，大都選擇通過篩選無毒果苗來防治病毒危害，但由于早期植株受病毒侵染后不表現出明顯的癥狀，從而采用ELISA、PCR及LAMP等方法來檢測植物病原物。

不同于傳統的檢測方法，如ELISA、PCR等，LAMP因其具有檢測速度快、靈敏度高和無需專業儀器等優點，而被廣泛用于各種病原體的檢測。為了減少西番蓮產業的損失，加快無毒苗的篩選，Fu等于2021年首次將LAMP技術應用于西番蓮TeMV的檢測，并成功建立西番蓮LAMP快速檢測體系(表1)。研究發現RT-LAMP檢測技術與RT-PCR相比具有顯著優勢，其靈敏度與效率高，特異性強，此外還可直接在田間使用。為西番蓮的有效防治提供了極其有力的保障。

表1 LAMP在果樹病毒檢測中的應用Tab.1 Application of LAMP in fruit tree virus detection

續表1

3 總結與展望

自2000年LAMP技術被首次報道以來，已被廣泛應用于動物、植物和人類樣本的病原體檢測的多個方面。與其他技術相比，LAMP具有一些顯著的優勢，使其在診斷方面具有競爭力。首先，LAMP檢測速度快、靈敏度高、特異性強。LAMP反應在等溫條件下很容易進行，一般在45～60 min內即可完成大量樣品的檢測，若增加一對環引物，檢測時間可縮短到30～60 min，其反應靈敏度可達到PCR的10～100倍；其次，LAMP檢測方法操作簡單、無需昂貴的設備、可使用范圍廣。LAMP反應不需要昂貴的儀器，只要簡單的水浴或加熱即可。結果不需要放大處理，根據反應過程產生沉淀物的濁度，或利用鈣黃綠素(Calcein)、羥基萘酚藍(Hydroxy naphthol blue，HNB)、SYBR Green I等進行熒光檢測，即可肉眼對結果進行直接觀察。這使得LAMP檢測可在實驗室、室外現場檢測,甚至是世界上資源有限的地區都能使用。

LAMP檢測技術已成為目前病害診斷的主要方法之一，但在廣泛使用的同時也應注意其不足：(1)LAMP檢測時每個標靶都需要4～6個長度不等的引物，引物較多增加了正確設計難度的同時，使其相互之間作用的機會也更多，影響檢測的準確性；(2)LAMP檢測方法特異性強，使其無法用于研究已知信息較少的新基因或結構未知的目標基因；(3)不能用于擴增大于30 bp的序列，目的基因片段通常較短，反應產物是一系列大小不一的DNA片段，不能作為其他檢測的材料，如PCR；(4)LAMP檢測技術靈敏度高，樣品制備、擴增和擴增后處理(如需要)必須在單獨的空間進行，否則其極易被污染；(5)指示劑(鈣黃綠素、HNB等)或其他反應組分(錳離子或反應輔助因子)濃度過高可能會抑制聚合酶反應，使產物分解或改變指示劑顏色，從而影響檢測結果。

雖然LAMP技術目前仍存在一些缺陷，但其已成為目前診斷病害的重要方法之一，在農業、醫學等領域得到了廣泛的應用，同時LAMP技術也在不斷的完善。許多新試劑的開發，如：Bst 2.0和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶(New England Biolabs,Ipswich,MA)、GspSSD 和Tin DNA 聚合酶和等溫混合物(OptiGene Ltd,West Sussex,United Kingdom)等極大地提高了檢測的熱穩定性和擴增效率；LAMP-LFD(LAMP與橫向流動試紙條(lateral flow dipstick,LFD) 結合，使結果可用肉眼直接觀察)、IC-LAMP(免疫捕獲與LAMP結合，省去了制備病原體DNA或RNA的步驟)等技術的開發，即保持了檢測的有效性、靈敏度和特異性，同時減少了反應所需時間、更好的避免污染、對操作人員也更加安全；LAMP技術與帶有特定光學標記特征的條形碼結合，并對用于條碼掃描的光學傳感器進行計算機集成，或使用在與目標序列結合后可改變電或磁特性的納米材料，實現了快速讀取檢測結果及檢測結果的數字化管理。此外，為了使該技術可以應對大規模的篩查和對抗病毒病的大流行。研究人員提出了一種基于新型冠狀病毒肺炎診斷的LAMP試紙條化檢測方法，可供任何居家隔離或就診困難的人群使用。再結合“improva”系統——集成了控制整個系統的中央單元、分離和純化樣品核酸的預處理單元、核酸序列檢測和擴增的LAMP組件為一體，即可連接智能手機等電子設備，實現對檢測結果和疾病發展情況的實時了解。雖然目前想要實現在日常生活的環境中進行恒溫檢測還較為困難,但隨著越來越多的研究人員和實驗室的加入，LAMP技術的完善性將不斷提高，在未來得到更廣泛的應用。