獼猴桃花、幼果微生物群落及病害感染途徑初步分析

李 勇，陳海江，許 粟，吳文能

(貴陽學院 食品與制藥工程學院，貴州 貴陽 550005)

近年來，貴州省獼猴桃產業規模進入全國前三，隨著種植面積增加，由病原微生物引起的獼猴桃病害日益突出，造成重大經濟損失。由細菌引起的獼猴桃病害有細菌性潰瘍病、花腐病，由真菌引起的有黑斑病、褐斑病、葉斑病、炭疽病、根腐病等。這些致病菌可危害獼猴桃的果實、葉片、根等部位。目前關于獼猴桃微生物的病害集中于病原菌的分離純化，輔以侵染試驗等，缺乏微生物群落對比及感染途徑分析。對致病微生物是何時，通過何途徑侵染到植株的研究仍然較為欠缺。目前針對微生物群落的調查有多種方法，如傳統培養結合微生物形態學鑒定和生理生化鑒定，或結合PCR手段如限制性片段長度多態性分析(RFLP)、隨機擴增多態性DNA(RAPD)等。以及一些非培養方法，如變性梯度凝膠電泳(DGGE)、實時熒光PCR、熒光原位雜交(FISH)等。這些技術均存在耗時、費力、結果可靠性差等缺陷。本研究利用的Illumina NovaSeq 測序平臺，具有測序通量高、周期短、準確率高、成本低等優點，在微生物多樣性研究中有顯著優勢。本研究通過Illumina NovaSeq高通量測序平臺對獼猴桃花、健康幼果和患病幼果的微生物進行測序，比較樣品中群落結構差異，分析微生物群落結構變化，為揭示患腐爛病獼猴桃的病原菌種類及感染途徑提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集和命名

本研究獼猴桃品種為貴長，屬貴州省自主選育并主要推廣品種。采樣地點為貴州省修文縣，采集獼猴桃健康無病害的花朵、健康幼果及患病幼果，患病幼果癥狀為在果柄處開始出現腐爛跡象，并逐漸蔓延。采集后的樣品裝入樣品袋，低溫運輸到實驗室，并在12 h內對樣品進行處理，無病害的獼猴桃花命名為MHTH，健康幼果命名為MHTG-1，患病幼果命名為MHTG-2。

1.2 基因組 DNA 提取及多樣性分析

分別提取各組樣品的基因組DNA，對其進行瓊脂糖凝膠電泳以檢測DNA的純度和濃度。取適量樣本DNA稀釋濃度至1 ng/μL，根據所選擇的測序區域，分別以其為模板，使用帶有Barcode的特異性引物，以及PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs公司)對細菌的16S rDNA V3-V4區及真菌的ITS1區進行PCR。檢測PCR產物濃度，并根據濃度進行等量混樣，通過瓊脂糖凝膠電泳的方法檢測PCR產物，對目的條帶使用膠回收試劑盒(QIAGEN公司)回收產物。最后利用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit和Q-PCR定量，質量檢測合格后使用NovaSeq6000平臺進行樣品的測序工作。

1.3 數據處理

對高通量初始數據進行處理，利用FLASH(V1.2.7)對每個樣本的reads進行拼接，經過嚴格過濾處理得到高質量Tags數據。然后用Usearch軟件對所有樣品有效序列以97%一致性將序列聚類成為OTU；用Mothur和SILVA的SSUrRNA數據庫進行物種注釋分析，對獲得分類學信息分別在各個分類水平統計樣本群落組成。使用Qiime軟件計算Shannon、Simpson、Chao1、Goods-coverage指數，使用R軟件繪制圖像和Alpha和Beta多樣性指數差異分析。

2 結果與分析

2.1 序列長度分布

對各樣品中細菌16S rDNA的V3-V4區進行測序，共獲得266 533條平均長度為411 bp的高質量序列(圖1)，基本符合16S rRNA基因的V3-V4區序列長度(460 bp)。對樣品中真菌18S rDNA的ITS1區域進行測序，共獲得260 919條平均長度為274 bp的高質量序列(圖1)，與ITS1區域長度(260 bp)基本一致。

2.2 樣品復雜度分析

樣品中分別針對細菌和真菌測序結果的稀釋度曲線如圖2所示，從圖2可以看出，隨著測序數量的增加，稀釋曲線斜率均逐漸降低，趨于平坦。根據曲線最終趨勢可以看出，對樣品中真菌測序深度較高，增加測序數量也只會產生少量新OTU。而對細菌繼續增加測序數量，可能還會產生新OTU。由表1也可得出同樣結論，測序深度指數中Good′s coverage代表了各樣品文庫的覆蓋率，其數值越高，樣品中未被測出序列概率越低，真菌測序的Good′s coverage均為1，3個樣品中細菌此數值分別為0.996、0.996、0.995。Shannon指數和Simpson指數(本文分析使用Simpson′s Index of Diversity，即1-D)均是用來估算樣品中微生物多樣性的指數，此二者數值越高，說明樣品中微生物群落的多樣性越高，樣品MHTG-2的細菌和真菌多樣性均高于其他兩個樣品，在真菌中更加明顯。ACE指數和Chao1指數均是用來估算樣品中含有的OTU數目，表示群落豐富度，二者算法不同，Chao1和ACE指數越大，說明群落中含有的OTU數目越多，樣品中物種豐富度越大，對比發現MHTG-2的細菌和真菌多樣性均高于其他兩個樣品。

注：a為細菌；b為真菌。圖1 序列長度分布Fig.1 Distribution of sequence length

注：a為細菌；b為真菌。圖2 稀釋度曲線Fig.2 Rarefaction curve

表1 樣品中微生物多樣性指數Tab.1 Microbial diversity index

2.3 OTU聚類分析及維恩圖分析

對宏基因組測序后的數據進行分析，所有樣品共獲得細菌Tags(過濾后得到的拼接序列數)173 338條，包括164 970條可獲得分類信息的Tags，7882條低頻Tags。共獲得真菌Tags 191 499條，包括187 177條可獲得分類信息的Tags，3354條低頻Tags。對拼接的數據進行優化，在97%相似度下將其進行聚類為用于物種分析的OTU，MHTH、MHTG-1、MHTG-2樣品獲得的細菌OTU個數為805、746和895(圖3)，獲得的真菌樣本分別是99、43和168(圖4)。比較3個樣品中檢測到的Tags數目以及OTU數目，健康的獼猴桃幼果MHTG-1稍低，但無顯著性差異。

圖3 樣品中的細菌Tags和OTUs數目統計Fig.3 Statistics of the bacterial numbers of tags and OTUs in samples

圖4 樣品中的真菌Tags和OTUs數目統計Fig.4 Statistics of the fungal numbers of tags and OTUs in samples

3組樣品的細菌、真菌韋恩圖如圖5所示，MHTF、MHTG-1、MHTG-2分別獨有212、140、238個細菌OTU，以及40、7、83個真菌OTU。3組樣品分別共有374和26個細菌和真菌OTU，樣品MHTG-2中無論是細菌還是真菌類群獨有OTU都是最多的。

樣品中的測序數據可以注釋到細菌門平均28個，細菌屬平均212個，以及真菌門平均3個，真菌屬平均53個(表2)。3個樣品中細菌類群較為接近，樣品MHTG-2中真菌在綱、目、科、屬水平上均為最高。

表2 細菌、真菌分類數目Tab.2 Number of bacteria and fungi classification level

2.4 細菌物種多樣性分析

圖6列出了細菌門和屬分類水平上物種豐度排名前十的分布狀況，結果表明，3個樣品中細菌的主要門類為變形菌門Proteobacteria、擬桿菌門Bacteroidota、放線菌門Actinobacteria、unidentified Bacteria和厚壁菌門Firmicutes，其余門類的相對豐度均小于1%，優勢菌均為變形菌門Proteobacteria(74.98%以上)。在屬分類水平上，各組的優勢屬類為寡養單胞菌屬(8.14%～44.48%)、假單胞菌屬(12.86%～16.85%)、---屬(3.96%～12.79%)、泛菌屬(3.55%～9.06%)，此四者均為變形菌門Proteobacteria。

圖6 細菌門和屬分類水平相對豐度排名前十的物種分布Fig.6 Abundance (top 10) of bacteria in samples at phylum and genera level

根據獼猴桃生長階段和患病狀況不同進行對比分析，在門分類水平上MHTH及MHTG-1群落結構較為簡單，優勢菌為變形菌門Proteobacteria，相對豐度分別為88.43%和94.79%，患病獼猴桃MHTG-2除變形菌門Proteobacteria外，擬桿菌門Bacteroidota、放線菌門Actinobacteria相對豐度也較高，均為10%左右。在屬分類水平上，除假單胞菌屬相對豐度均較高外，其他屬微生物相對豐度變化較大。樣品MHTH中占比最高的為，相對豐度為22.33%，樣品MHTG-1和MHTG-2中占比最高的均為寡養單胞菌屬，相對豐度分別為44.48%和19.34%。

注：a為細菌;b為真菌。圖5 細菌和真菌韋恩圖Fig.5 Venn graphs of bacteria and fungi

2.5 真菌物種多樣性分析

圖7列出了真菌門和屬分類水平上物種豐度排名前十的分布情況，由圖可知，3個樣品中真菌的主要門類為子囊菌門Ascomycota(95.90%～99.20%)，相對豐度占絕對優勢。在MHTG-2中擔子菌門Basidiomycota含量也較高，相對豐度為3.22%。其余門類的相對豐度均小于1%。

圖7 真菌門和屬分類水平相對豐度排名前十的物種分布Fig.7 Abundance (top 10) of fungi in samples at phylum and genera level

在屬分類水平上，樣品MHTH和MHTG-1中微孢子屬為優勢菌群，相對豐度分別為98.24%和96.37%，其余屬相對豐度均小于1%。樣品MHTG-2中相對豐度較高的有微孢子屬、枝孢菌屬、小雙腔菌屬、不整小球囊菌屬、鐮孢菌屬、格孢菌屬、附球菌屬、unidentified、維希尼克氏屬、，相對豐度分別為39.28%、18.47%、15.06%、8.68%、3.22%、3.18%、1.67%、1.65%、1.39%、1.11%。

3 結論與討論

本研究利用高通量測序的方法對不同生長時期、不同健康狀況樣品中微生物群落進行分析。發現3個樣品中細菌類群微生物群落結構相差較小，豐度較高的屬均為寡養單胞菌屬和假單胞菌屬。寡養單胞菌屬是一類革蘭氏陰性菌，廣泛分布于自然界，該屬未發現有植物致病菌存在。假單胞菌屬已知有191個種，多為植物致病菌，如淺綠黃假單胞菌、沙氏極毛桿菌、螢光假單胞菌、丁香假單胞菌的致病變株丁香致病變種pv.及丁香假單胞菌獼猴桃致病變種pv.均為獼猴桃致病菌，但這幾種微生物均未在本次測序結果中發現。

真菌群落的研究中，樣品MHTH和MHTG-1在屬分類水平上群落結構相似，與患病樣品MHTG-2群落結構相差較大。前二者微孢子屬占絕對優勢，該屬研究較少，有些種可引起植物干粉病，但未見到有關獼猴桃致病菌的報道。MHTG-2除微孢子屬外，枝孢菌屬、小雙腔菌屬、不整小球囊菌屬、鐮孢菌屬、格孢菌屬、附球菌屬、unidentified、維希尼克氏屬、相對豐度也較高，可見患病獼猴桃中真菌群落結構較復雜，并可初步得出，患病獼猴桃屬于真菌性致病菌感染。

可導致獼猴桃患病的真菌性致病菌種類較多，如屬就有尖孢鐮刀菌、層出鐮刀菌和三線鐮刀菌，三者均可導致獼猴桃軟腐??；亞隔孢殼屬屬可導致獼猴桃患黑斑病。本研究發現，在樣品MHTG-2中發現互隔鏈格孢菌和莖點霉菌sp.相對豐度較高，分別為3.18%和1.03%，這兩種微生物并未在樣品MHTH和MHTG-1中發現?；ジ翩湼矜呔且环N常見的獼猴桃致病菌，可導致獼猴桃患黑斑病和貯藏期軟腐病，莖點霉菌sp.同樣可導致獼猴桃軟腐病。

獼猴桃軟腐病常見于貯藏期，通常果實外表無明顯癥狀，但隨著儲存時間增長，獼猴桃內部開始腐爛。通過本研究發現，雖然獼猴桃花和健康的幼果中沒有發現相關致病菌，但幼果可被感染并且發病，推斷果園環境中存在相關致病微生物，可感染幼果或成熟果，待條件合適時大肆繁殖，導致發病，發病時期可在生長期，或在貯藏期。下一步可對獼猴桃環境中的樣品采樣并進行高通量分析，以對本研究推測進行確認。同時指導種植戶在獼猴桃種植園區噴施真菌殺菌劑，防范獼猴桃在生長、采摘、運輸過程中的感染。

病原菌的入侵使微生物的多樣性和豐富度均增加，在真菌群落結構中尤其明顯。樣品中未發現致病細菌，發現多種致病真菌，推斷由果園環境感染。高通量測序獲得大量微生物群落結構信息，為系統分析病原菌的入侵和潛在病害研究提供可靠依據。