苦參堿通過調控HMGB1/NLRP3信號途徑抑制慢性鼻-鼻竇炎小鼠炎癥反應

李特，宋天喜，秦喜昕，王建

（1.重慶北部寬仁醫院耳鼻咽喉科，重慶 401120；2.九江市第三人民醫院耳鼻咽喉科，江西 九江 332000；3.陸軍軍醫大學第三附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，重慶 400042）

慢性鼻-鼻竇炎（chronic rhinosinusitis,CRS）是一種慢性炎癥性疾病，以慢性鼻塞、嗅覺減退和面部疼痛為特征[1]。CRS被認為是由遺傳和環境因素共同驅動的復雜炎癥過程的結果[2]。通常，CRS治療策略主要通過減輕黏膜炎癥、預防感染和清除鼻竇內黏液。CRS有多種治療選擇，包括生理鹽水沖洗、局部鼻腔皮質類固醇噴霧、口服抗組胺藥物和抗生素等[3]。即使在藥物和手術治療之后，CRS也會復發[4]。因此，迫切需要開發更有效、副作用最小、能夠降低CRS復發率的治療方法。研究顯示，外界刺激通過NOD樣受體家族包含pyrin結構域蛋白3（nod like receptor family pyrin domain containing 3，NLRP3）和Caspase-1亞基誘導活性氧的產生激活NLRP3炎性小體，導致鼻上皮細胞IL-1β的成熟和分泌，從而加重鼻部炎癥反應[5]。高遷移率族蛋白-1（high mobility group box protein-1,HMGB1）是一種炎癥分子，可介導NLRP3炎性小體的激活以促進IL-1β的產生，從而加重炎癥反應[6]。目前，CRS的發病機制尚不明確，而關于HMGB1/NLRP3信號途徑在CRS中的作用也尚未可知，需進一步探究。苦參堿是一種小分子化合物（相對分子質量：248），屬于羽扇豆堿，具有抗癌、抗炎、抗氧化、抗病毒、抗菌、抗纖維化、抗過敏、抗傷害、保肝、護心和神經保護等多種藥理作用[7]。已有證據顯示，苦參堿可通過抑制HMGB1信號通路，抑制促炎細胞因子（如IL-6、TNF-α和TGF-β1）的釋放，從而發揮抗癌作用[8]。目前，關于苦參堿在CRS中的作用及其可能的作用機制尚不明確。因此，本研究通過建立CRS小鼠模型，旨在探究苦參堿是否通過調控HMGB1/NLRP3信號途徑在CRS中發揮作用，以期為明確苦參堿對CRS的作用機制及開發新的CRS治療策略提供新的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級雄性C57BL/6J小鼠42只，購自陸軍軍醫大學動物實驗中心，生產許可證號：SCXK（渝）20170002，體質量（20±2）g，6～8周齡。小鼠飼養于室溫（24±2）℃，相對濕度40%～60%，12 h/12 h明暗交替環境下，自由飲水及進食。待小鼠適應環境1周后，進行后續實驗操作。

1.2 主要材料

苦參堿（質量分數≥98%）購自成都曼思特生物技術有限公司；重組HMGB1蛋白（rHMGB1）購自北京百普賽斯生物科技股份有限公司；天狼星紅染色液和甲苯胺藍溶液（1%水溶液）購自北京索萊寶科技有限公司；IL-1β、IL-4、IL-6、TNF-αELISA檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；MUC5B和MUC5AC抗體購自英國Abcam公司；E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、HMGB1和GAPDH抗體購自北京義翹神州科技股份有限公司；NLRP3抗體購自武漢三鷹生物技術有限公司；ASC和Cleaved caspase-1抗體購自Cell Signaling Technology。

1.3 模型建立與分組給藥

將42只小鼠隨機分為對照組、模型組、苦參堿低、中、高劑量組、苦參堿高劑量+rHMGB1組，每組7只。參考文獻[9]建立CRS小鼠模型。麻醉小鼠后，于小鼠鼻背正中處做一橫行約3 mm切口，鈍性分離皮下組織，暴露上頜竇腔，于上頜竇左右兩側開口處磨一個直徑約為1 mm的小孔。將含1 μL肺炎鏈球菌菌液（6×108CFU/mL）的膨脹海綿（海綿體積為1 mm3）植入竇腔內。隨后逐層縫合皮膚切口。對照組小鼠行相同手術操作但不植入含肺炎鏈球菌菌液的膨脹海綿。造模后第8周，參考文獻[10]，記錄造模組小鼠打噴嚏和撓鼻次數并按照表1所示進行評分，得分超過5分，則表示造模成功。隨后，苦參堿低劑量組小鼠腹腔注射苦參堿7.5 mg/kg，苦參堿中劑量組小鼠腹腔注射苦參堿15 mg/kg，苦參堿高劑量組小鼠腹腔注射苦參堿30 mg/kg[11]，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠腹腔注射苦參堿30 mg/kg和20 μg rHMGB1[12]，對照組小鼠腹腔注射等量溶劑。每天給藥1次，連續給藥2周。

表1 小鼠打噴嚏和撓鼻評分標準Table 1 Scoring criteria of sneezing and nose scratching in mice

1.4 打噴嚏和撓鼻癥狀評分

末次給藥24 h后，觀察各組小鼠鼻部癥狀和一般情況。參考文獻[10]和表1，對各組小鼠打噴嚏和撓鼻癥狀進行評分。

1.5 HE染色檢測小鼠黏膜病理學變化

末次給藥24 h后，小鼠經麻醉后處死。取小鼠鼻竇黏膜組織，4%（φ）多聚甲醛固定組織，梯度酒精脫水，二甲苯透明。組織塊石蠟包埋，切片機切片。石蠟切片常規脫蠟至水，蘇木素染色液染色15 min，切片流水沖洗1 min，1%鹽酸乙醇分化3 s后，氨水返藍，伊紅染色液染色10 s后，流水沖洗。切片經脫水透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察并拍照。對各組小鼠上皮增生進行評分，上皮增生評分標準[13]：無增生計0分；輕微幾乎檢測不到計1分；輕微可檢測計2分；中度計3分；重度計4分。應用CellSens Standard 1.7圖像分析系統測定鼻組織中嗅覺和呼吸上皮過渡區的最大黏膜厚度。

1.6 天狼星紅染色檢測小鼠黏膜嗜酸性粒細胞的產生

鼻竇黏膜石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水清洗3次后，天狼星紅染色液滴染1 h，流水沖洗后，無水乙醇快速沖洗切片，常規脫水透明，中性樹膠封固。Image J軟件對陽性細胞數進行計數。

1.7 甲苯胺藍染色檢測小鼠肥大細胞浸潤

鼻竇黏膜石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水清洗3次后，添加甲苯胺藍染液染色30 min。流水沖洗后，95%（φ）乙醇分色，常規脫水透明，中性樹膠封固。Image J軟件分析陽性面積。

1.8 ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量

末次給藥24 h后，小鼠腹主動脈采血。將血液于室溫條件下靜置1 h后，3 000 r/min離心10 min收集上清液，即為血清。血清置于-80℃條件下保存。

1.9 Western blot檢測小鼠MUC5B、MUC5AC、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達

取小鼠鼻竇黏膜組織，加入RIPA裂解液，冰上反應30 min后，離心收集上清液并通過BCA法測定其蛋白濃度。取30 μg蛋白上樣，進行SDS-PAGE凝膠電泳和轉膜操作。5%脫脂奶粉室溫條件下孵育3 h。向細胞中添加MUC5B（1∶1 000）、MUC5AC（1∶1 000）、E-cadherin（1∶2 000）、N-cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）、HMGB1（1∶2 000）、NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶1 000）、Cleaved caspase-1（1∶1 000）和GAPDH（1∶5 000）抗體稀釋液，4℃條件下孵育過夜。添加特異性二抗（1∶5 000），室溫條件下孵育1 h。滴加ECL發光液，凝膠成像系統檢測蛋白條帶，Image J軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.10 統計學分析

采用SPSS 21.0軟件進行數據統計分析，實驗數據以表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 苦參堿對CRS小鼠臨床癥狀的影響

造模前，各組小鼠精神狀態良好，皮毛光滑，飲食規律。造模后，對照組小鼠無明顯異常，其余組小鼠少量進食、飲水，可見流涕、頻繁撓鼻、打噴嚏，鼻腔內有少量分泌物。經藥物干預2周后，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量組+rHMGB1組小鼠上述癥狀有明顯改善，而苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠較苦參堿高劑量組癥狀更為明顯。與對照組相比，模型組小鼠癥狀評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠癥狀評分明顯降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性；與苦參堿高劑量組相比，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠癥狀評分明顯升高（P＜0.05）。結果見圖1。

圖1 各組小鼠癥狀評分的比較Figure 1 Comparison of symptom scores of mice in each group

2.2 苦參堿對CRS小鼠鼻竇黏膜病理學變化的影響

對照組小鼠鼻竇黏膜上皮組織結構無明顯異常，排列整齊，無明顯炎性細胞浸潤和腺體增生。與對照組相比，模型組小鼠鼻竇黏膜出現明顯病變，黏膜上皮排列紊亂，有明顯炎性細胞浸潤，上皮增生評分、最大黏膜厚度、嗜酸性粒細胞數和甲苯胺藍面積均明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠鼻竇黏膜病理學變化得到明顯改善，上皮增生評分、最大黏膜厚度、嗜酸性粒細胞數和甲苯胺藍面積均明顯降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性；與苦參堿高劑量組相比，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠鼻竇黏膜病變加深，上皮增生評分、最大黏膜厚度、嗜酸性粒細胞數和甲苯胺藍面積均明顯升高（P＜0.05）。結果見圖2-5。

圖2 HE染色檢測各組小鼠黏膜病理學變化（200×）Figure 2 Mucosal pathological changes in mice of each group by HE staining（200×）

2.3 苦參堿對CRS小鼠炎癥反應的影響

與對照組相比，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量明顯降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性；與苦參堿高劑量組相比，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α含量明顯升高（P＜0.05）。結果見圖6。

2.4 苦參堿對CRS小鼠杯狀細胞黏蛋白分泌的影響

與對照組相比，模型組小鼠黏膜組織中MUC5B和MUC5AC蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠黏膜組織中MUC5B和MUC5AC蛋白表達明顯降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性；與苦參堿高劑量組相比，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠黏膜組織中MUC5B和MUC5AC蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。結果見圖7-8。

圖4 甲苯胺藍染色檢測各組小鼠肥大細胞浸潤（200×）Figure 4 Mast cell infiltration of mice in each group detected by toluidine blue staining（200×）

圖5 各組小鼠鼻竇黏膜病理學變化的比較Figure 5 Comparison of pathological changes of sinus mucosa in mice of each group

圖7 Western blot檢測各組小鼠MUC5B和MUC5AC蛋白表達Figure 7 Expressions of MUC5B and MUC5AC protein in mice of each group by Western blot

2.5 苦參堿對CRS小鼠EMT的影響

與對照組相比，模型組小鼠黏膜組織中E-cadherin蛋白表達明顯降低（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠黏膜組織中E-cadherin蛋白表達明顯升高（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性；與苦參堿高劑量組相比，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠黏膜組織中E-cadherin蛋白表達明顯降低（P＜0.05），N-cadherin和Vimentin蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。結果見圖9-10。

圖9 Western blot檢測 各 組 小鼠E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達Figure 9 Expressions of E-cadherin，N-cadherin and Vimentin proteins in each group by Western blot

圖8 各組小鼠MUC5B和MUC5AC蛋白表達的比較Figure 8 Comparisons of MUC5B and MUC5AC protein expressions in mice of each group(±s,n=7)

圖10 各組小鼠E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達的比較Figure 10 Comparison of E-cadherin，N-Cadherin and Vimentin proteins expressions in mice of each group

2.6 苦參堿對CRS小鼠HMGB1/NLRP3信號通路的影響

與對照組相比，模型組小鼠黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，苦參堿低、中、高劑量組和苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達明顯降低（P＜0.05），且苦參堿的作用呈劑量依賴性；與苦參堿高劑量組相比，苦參堿高劑量+rHMGB1組小鼠黏膜組織中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達明顯升高（P＜0.05）。結果見圖11-12。

圖11 Western blot檢測各組小鼠HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達Figure 11 Expressions of HMGB1，NLRP3，ASC and Cleaved caspase-1 proteins in each group by Western blot

圖12 各組小鼠HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達的比較Figure 12 Comparison of HMGB1，NLRP3，ASC and Cleaved caspase-1 proteins expressions in mice of each group

3 討論

CRS作為一種發病率高的疾病，除了給衛生保健系統帶來巨大的經濟負擔外，還嚴重影響患者的生活質量[14]。因此，需開發新的、有效的疾病治療策略以改善CRS疾病現狀。本研究通過建立CRS小鼠模型，旨在探究苦參堿在小鼠CRS發生發展中的作用。本研究結果顯示，苦參堿可通過抑制HMGB1/NLRP3信號途徑，減輕CRS的EMT、炎癥反應和黏液分泌，從而在CRS中發揮治療作用。

CRS患者以一系列炎癥介質（如前列腺素和白細胞介素）上調和炎性細胞浸潤（如嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、肥大細胞和巨噬細胞）為特征[15]。組織重塑是傷口修復的關鍵過程，但當調控不當時，可導致以氣道上皮、固有層和黏膜下區域變化為特征的病理重建，從而導致各種慢性氣道疾病（包括CRS）[16]。證據顯示，上皮-間充質轉化（epithelial mesenchymal transition,EMT）參與組織重塑過程，與CRS的發展有關[17]。因此，靶向抑制CRS的EMT和炎癥反應可能是CRS的潛在治療策略。苦參堿具有抗炎和抗EMT作用，可能成為治療炎癥和氧化應激相關疾病的潛在藥物。例如，苦參堿通過抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B,NF-κB）信號通路，減輕氣道上皮細胞和哮喘小鼠炎癥因子的產生、炎癥細胞浸潤、杯狀細胞分化和黏液生成[18]。苦參堿還可上調上皮細胞特異性標志物E-cadherin表達，下調間質細胞標志物N-cadherin和Vimentin表達，從而抑制胰腺癌細胞EMT[19]。此外，苦參堿對小鼠結腸炎中有明顯的治療作用。苦參堿通過減少出血和腹瀉以及下調炎癥因子（IL-1β和TNF-α）的表達來減輕結腸損傷和腸道炎癥[20]。本研究結果顯示，苦參堿低、中、高劑量組均可減少CRS小鼠臨床癥狀，改善鼻竇黏膜病理學變化，抑制上皮增生、嗜酸性粒細胞和肥大細胞浸潤和降低黏膜厚度，抑制IL-1β、IL-4、IL-6和TNF-α的產生，抑制黏蛋白MUC5B、MUC5AC和EMT相關蛋白N-cadherin和Vimentin的表達，促進E-cadherin表達，且苦參堿的作用呈劑量依賴性。該研究結果表明，苦參堿可抑制CRS小鼠炎癥反應、黏液分泌和EMT，從而發揮治療作用。

HMGB1是一種促炎介質，屬于alarmin家族，在炎癥和感染的刺激下，由單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞釋放到細胞間隙，也可以由死亡細胞釋放[21]。HMGB1在不同的急性和慢性免疫疾病中發揮關鍵作用[22]。它不僅通過多種炎癥因子和促炎細胞刺激免疫系統產生炎癥反應，而且還參與NLRP3炎性小體的激活[23]。NLRP3炎性小體的異常激活與糖尿病、動脈粥樣硬化、代謝綜合征、心血管和神經退行性疾病等多種疾病有關，這引起了人們對探索NLRP3炎性小體潛在抑制劑的巨大興趣[24]，例如，異丙酚預處理可使HMGB1依賴的NLRP3炎性小體信號失活，抑制TNF-α、IL-6、IL-1β和IL-18的產生，從而減輕LPS誘導的乳鼠心肌細胞炎癥和凋亡[25]。已有證據顯示，HMGB1參與CRS疾病進展，與疾病嚴重程度、嗜酸性粒細胞浸潤、促炎細胞因子水平和EMT過程密切相關。靶向抑制HMGB1在治療CRS疾病中具有潛在的應用價值[26]。目前，已有證據證明，苦參堿可通過抑制HMGB1通路信號轉導和NLRP3炎性小體的激活，降低TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-1β炎癥因子的產生，從而發揮疾病治療作用[26-28]。本研究結果顯示，CRS小鼠鼻竇黏膜中HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達升高，而低、中、高劑量苦參堿處理CRS小鼠后，可降低HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達，且苦參堿的作用呈劑量依賴性。進一步實驗結果顯示，rHMGB1處理可部分逆轉苦參堿對CRS小鼠的作用，導致HMGB1、NLRP3、ASC和Cleaved caspase-1蛋白表達明顯升高，從而促進炎癥反應、黏液分泌和EMT，加快小鼠CRS疾病進展。該研究結果表明，苦參堿通過介導HMGB1依賴的NLRP3炎性小體信號失活，在CRS小鼠中發揮治療作用。

綜上所述，本研究結果表明，苦參堿呈劑量依賴性抑制CRS小鼠炎癥反應、黏液分泌和EMT，從而對CRS小鼠發揮保護作用。苦參堿在CRS小鼠中的作用機制可能與抑制HMGB1依賴的NLRP3炎性小體激活相關。該研究結果為闡明苦參堿在CRS小鼠中的作用機制及開發新的CRS治療策略提供了新的實驗依據。