新疆部分地區規模豬場PEDV、TGEV和RV的流行情況調查

陳強斌

（新疆生產建設兵團第八師動物疫病預防控制中心，新疆 石河子 832000）

我國的生豬養殖業不斷趨向于集約化和規模化發展，支撐著我國畜牧產業的壯大，但是隨著我國豬場的規模化發展，各種豬的流行病也在我國的豬場中肆虐起來，特別是豬病毒性腹瀉，嚴重影響著我國養豬業的發展壯大[1]。豬病毒性腹瀉是規模化養豬場常見的一種豬腸道疾病，有著非常復雜的致病機理，不論是細菌、病毒的感染，還是寄生蟲的感染，都有可能導致病毒性腹瀉。豬病毒性腹瀉的傳播速度非常快，致死率也非常高，尤其是在規模化養豬場中，一旦流行起來，就有可能造成大量種豬和仔豬死亡。近年來，新疆的很多豬場都發生過不同程度的豬病毒性腹瀉，引起這些病毒性腹瀉的3種典型性病毒分別為豬輪狀病毒（RV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）等。一般來說，這3種病毒一般以混合交叉感染的方式或者單一感染的方式在豬群中傳播，發病非常急，對于仔豬來說更是可以造成百分之百的致死率。目前，僅從病理解剖和腸道病變很難區分TGE（豬傳染性胃腸炎）、PED（豬流行性腹瀉）、輪狀病毒感染，因為感染了豬病毒性腹瀉的豬都有相同的臨床表現，那就是消瘦、有水樣腸道病變、食欲不振、精神狀態差等，會讓感染病豬發生各種各樣的腸道病變。雖然生豬養殖有很大的利潤，但是因為豬場流行病毒性腹瀉，導致大量生豬死亡，會對養殖戶造成巨大的經濟損失。特別是新疆部分地區，由于豬的規模化養殖起步時間不長，養殖技術和疾病防治技術都不發達，很多養殖場對豬流行性腹瀉的流行狀況并不了解，甚至不管豬感染何種病毒，都盲目使用豬腹瀉疫苗，不但不能阻礙豬病毒性腹瀉的傳播，還對養殖戶造成了更加嚴重的經濟損失，因此采用科學的方法對新疆部分地區規模豬場的PED、TGE和RV流行情況調查是非常有必要的。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

試驗于2019年12月在新疆生產建設兵團第八師動物疫病預防控制中心進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 病料來源 收集來自新疆部分規模化豬場疑似TGEV、PEDV和RV的組織病料。

1.2.2 主要試驗儀器設備 梯度型PCR儀（山東龍煤工礦機械有限公司）；TG16-WS高速離心機（常州市億能實驗儀器廠）；MIX2000漩渦混合器（杭州瑞誠儀器有限公司）：HH-80數顯恒溫水浴鍋（常州市億能實驗儀器廠）；迷你離心機WTL-6K（湘儀離心機儀器有限公司）；Tanon 2500凝膠成像系統（蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司）；DYCP-44P快速凝膠電泳槽（北京合眾博普科技發展有限公司）；格蘭仕微波爐（格蘭仕集團）；伊若達DSX-280KB30滅菌器（南京伊若達儀器設備有限公司）；博科96孔板混勻儀VORTEX-2（山東博科生物產業有限公司）；電子精密天平JA3003（上海恒平科學儀器有限公司）；705型超低溫冰箱（美國Thermo公司）。

1.2.3 主要試劑 血樣/組織DNA提取試劑盒、總RNA提取試劑盒、DNA分子量標準、Trizol裂解液、2×TaqPCR Master Mix；反轉錄試劑盒。

1.3 引物設計

PEDV、TGEV和RV的檢測參考前人建立的方法[2-5]。各病原檢測引物信息見表1。

表1 引物序列和片段大小

1.4 方法

1.4.1 病料的處理 將采集的病料用研磨器進行研磨，再用PBS緩沖液作10倍稀釋，經過反復凍融3次，然后在5℃ 8 000 r/min離心20 min，取上清液，并且將樣品的相應信息進行標注，進行下一步的檢測。

1.4.2 核酸的提取 按照試劑盒提供的步驟進行操作。

1.4.3 RT-PCR

（1）將無菌操作臺充分消毒通風后，取一個無菌的PCR離心管，添加樣品及試劑，隨機引物（Random Primer）1 μL；樣品病料RNA 2 μL；H2O 9 μL；5×RT Buffer 4 μL；dNTPs 2 μL；RNase Inhibitor 1 μL；Reverse Tra Ace 1 μL。

（2）將上述20 μL混合液PCR管混勻，低速離心后，置于RT-PCR反應儀器中，反應溫度見表2，反應結束后在4 ℃保存。

表2 反應溫度

（3）PCR擴增反應（25 μL體系）。試劑添加：10×PCR buffer2.5 μL；dNTP2.0 μL；上游引物1.0 μL；下游引物1.0 μL；滅菌去離子水17.0 μL；DNA模板1.0 μL；Taq酶0.5 μL。擴增反應條件：95℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，52.2 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，反復30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃終止循環。

將PCR產物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳，在電壓5～10 V/cm條件下30 min，同時與DNA Marker DL 2 000進行比較，即可得出試驗結果。

2 結果與分析

采用RT-PCR方法對來自新疆維吾爾自治區50個規模化豬場的131份疑似豬病毒性腹瀉病料進行檢測[6]，結果如下。

2.1 豬病毒性腹瀉病料RT-PCR檢測結果

不同地區豬病毒性腹瀉病料RT-PCR檢測結果見表3。收集的131份病料中PEDV陽性份數74份，陽性率為56.5%；TGEV陽性份數17份，陽性率為13.0%；RV陽性份數18份，陽性率為13.7%，表明新疆維吾爾自治區規模豬場引起豬病毒性腹瀉的主要病原為PEDV，陽性率最高，其次是RV，最后是TGEV。

表3 豬病毒性腹瀉病料RT-PCR檢測結果

新疆維吾爾自治區不同地區的PEDV、TGEV和RV的陽性率有所差異，其中PEDV在石河子和庫爾勒陽性率最高，分別為58.3%和57.9%，TGEV在庫爾勒和福海最高，分別為15.8%和15.4%，RV陽性率在昌吉和石河子最高，分別為18.2%和15.0%，說明豬病毒性腹瀉流行特點存在地域性差異，這可能與地貌差異、天氣變化、溫濕度不同等因素有關，有待進一步研究分析[7]。

2.2 不同季節PEDV、TGEV和RV陽性率

PEDV、TGEV和RV在一年四季的陽性率見表4。春、冬季節PEDV陽性率分別為52.1%和52.9%，均高于夏季（34.8%）和秋季（34.6%）的陽性率；春、冬季節的TGEV陽性率分別為8.3%和5.9%，均高于夏季（4.3%）和秋季（3.8%）的陽性率；春、冬季節的RV陽性率分別為6.2%、8.8%，均高于夏季（4.3%）和秋季（3.8%），表明豬病毒性腹瀉在不同季節的陽性率有差異，冬季和春季暴發嚴重，陽性率高。PEDV在一年四季的陽性率均大于TGEV和RV[8]。

表4 PEDV、TGEV和RV在一年四季的陽性率

2.3 豬不同發育階段PEDV、TGEV和RV陽性率

豬不同發育階段的PEDV、TGEV和RV陽性率見表5。在豬不同發育階段PEDV、TGEV和RV的陽性率存在顯著差異，PEDV、TGEV和RV主要在7d內哺乳仔豬和7～25d哺乳仔豬陽性率較高，分別為PEDV 62.5%和65.1%、TGEV 7.1%和9.3%、RV 5.4%和9.3%。仔豬在出生25d內易受病毒感染引起腹瀉，到了保育期階段，PEDV、TGEV和RV陽性率均有明顯下降，且到了肥育期階段，幾乎沒有檢測到由TGEV和RV引起的病毒性腹瀉情況。

表5 豬不同發育階段PEDV、TGEV和RV陽性率

3 討論

豬病毒性腹瀉是目前我國規模化豬場常見的疾病，一旦豬感染了豬病毒性腹瀉，則會出現消瘦、脫水、嚴重腹瀉等癥狀，死亡率極高，嚴重制約我國養豬業的發展，對豬場造成嚴重的經濟損失[9]。為了解新疆部分地區規模豬場的豬病毒性腹瀉情況，研究使用了RT-PCR對新疆維吾爾自治區的50個規模化豬場（包括石河子、阜康、庫爾勒、昌吉、福海）疑似131份豬病毒性腹瀉病料進行了實驗室檢測，結果表明，PEDV陽性率最高，為56.5%；TGEV和RV陽性率較低，分別為13.0%和13.7%。不同地區的陽性率有一定的差異，說明豬病毒性腹瀉流行特點存在地域性差異，這可能與地貌差異、天氣變化、溫濕度不同等因素有關，有待進一步研究分析。春、冬季節PEDV陽性率分別為52.1%和52.9%，均高于夏季（34.8%）和秋季（34.6%）的陽性率，春、冬季節的TGEV陽性率分別為8.3%和5.9%，均高于夏季（4.3%）和秋季（3.8%）的陽性率，春、冬季節的RV陽性率分別為6.2%、8.8%，均高于夏季（4.3%）、秋季（3.8%），表明豬病毒性腹瀉在不同季節的陽性率有差異，冬季和春季暴發嚴重，陽性率高，可能是因為春季、冬季比較寒冷，導致豬的免疫力低下，更容易感染豬腹瀉病毒。通過本文的數據不難發現，PEDV在一年四季的陽性率均大于TGEV和RV。在豬不同發育階段PEDV、TGEV和RV陽性率存在顯著差異，PEDV、TGEV和RV主要在7d內仔豬和7～25d哺乳仔豬陽性率較高，分別為PEDV 62.5%和65.1%、TGEV 7.1%和9.3%、RV 5.4%和9.3%，仔豬在出生25d內易受病毒感染引起腹瀉。到了保育期階段，PEDV、TGEV和RV陽性率均有明顯下降，而到了肥育期階段，幾乎沒有檢測到由TGEV和RV引起的病毒性腹瀉情況，這是因為仔豬的免疫力比較低下，更容易受到腹瀉病毒的侵襲。本研究通過對豬病毒性腹瀉流行情況調查，為新疆維吾爾自治區豬病毒性腹瀉研究提供科學依據和防控方向。