一例豬輪狀病毒感染引起仔豬腹瀉的實驗室診斷與防制

葛生虎，高明艷

（1.河北銘諸生物科技有限公司，河北 邢臺 054000；2.青海農(nóng)牧科技職業(yè)學院，青海 西寧 812100）

豬輪狀病毒（Porcine Rotavirus, PoRV）屬于呼腸病毒科、輪狀病毒屬重要成員，是導致仔豬腹瀉的重要傳染性病原之一[1]。豬輪狀病毒在我國不同地區(qū)廣泛分布，但多以散發(fā)或局部暴發(fā)為特征，且主要發(fā)生于冬季和春季等寒冷季節(jié)[2]。不同發(fā)育階段豬群對PoRV均易感，但仔豬感染該病原后出現(xiàn)的臨床癥狀最明顯且嚴重，主要為水樣腹瀉、脫水和嘔吐等，且病死率較高；成年豬群（母豬、肥育豬等）感染該病不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但處于隱性感染階段，且可對外排毒，也會對其它健康豬群造成威脅[3]。

可導致仔豬腹瀉的病原種類繁多，其中最常見的腸道腹瀉相關病毒包括豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Porcine Transmissible Gastroenteritis Virus, TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）和豬德塔冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV）等。自2010年以來，PEDV變異株廣泛流行，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，且目前豬流行性腹瀉（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）仍然是導致仔豬腹瀉的主要腸道病毒性疾病[4]。這使得大部分養(yǎng)殖人員當仔豬發(fā)生腹瀉時首先想到的便是PED，而忽略了PoRV、PDCoV感染等“少見”疾病的存在，繼而可能因誤診而延誤疾病最佳防控期。

2022年4月初，河北石家莊某養(yǎng)殖合作社豬場仔豬出現(xiàn)腹瀉疫情，為確診病因，該場迅速將腹瀉仔豬送至河北銘諸生物科技有限公司進行實驗室診斷。在排除了該場仔豬發(fā)病不是PEDV、豬圓環(huán)病毒、豬偽狂犬病病毒（PRV）、豬瘟病毒（CSFV）等感染引起的情況下，我們檢測了其它“少見”病原，最終確定為PoRV感染；進一步擴增與分析該毒株的VP7基因序列，確定該毒株為基因9型（G9）。確定病因后采取一系列防控措施，最終使疫情得到有效控制。

1 發(fā)病豬場

河北省石家莊平山縣某養(yǎng)殖專業(yè)合作社飼養(yǎng)能繁母豬300余頭，2022年4月初該豬場產(chǎn)房個別欄舍仔豬出現(xiàn)腹瀉。其主要臨床癥狀為：發(fā)病仔豬初期采食量下降、精神萎靡且輕微嘔吐等；后期嚴重腹瀉，且糞便為黃色或黑色帶血絲，嚴重脫水等。截至4月10日，該場有200余頭初生仔豬腹瀉，盡管采取了對癥治療，但病死率仍然近80%。

咨詢該場的負責人得知，該場之前發(fā)生過一次類似的腹瀉疫情，但對豬群免疫接種腹瀉三聯(lián)滅活疫苗（PEDV+TGEV+PoRV）后控制了疫情。當前該場已對豬群免疫接種了常規(guī)疫苗，其中包括針對豬偽狂犬病、豬口蹄疫、豬瘟、藍耳病、圓環(huán)病毒病、細小病毒病和乙腦等多種疫苗，但卻忽視了接種針對腸道腹瀉病毒病的相關疫苗。

2 臨床癥狀及病理變化

觀察腹瀉仔豬整體狀況，發(fā)現(xiàn)仔豬極度消瘦（圖1A），且仔豬因持續(xù)腹瀉臀部肌肉松弛，粘滿黃色糞便（圖1B），地面多處可見黃白色糞污或嘔吐物（圖1C和圖1D）。剖檢發(fā)現(xiàn)病變主要出現(xiàn)于小腸，可見腸壁脹氣且薄，腸系膜淋巴結腫大充血等，胃內(nèi)有大量未消化的乳凝塊。

3 實驗室診斷結果

為確定發(fā)病原因，采集4頭嚴重腹瀉仔豬小腸組織樣品送至河北銘諸生物科技有限公司，分別進行細菌分離鑒定和常見病毒性病原診斷。

3.1 細菌分離鑒定結果

在超凈工作臺下，使用滅菌眼科剪剪開腸道深層組織，用火焰灼燒并冷卻的接種環(huán)蘸取少量組織液分別在鮮血固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和普通固體營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基表面平板劃線。其后將培養(yǎng)基置于37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)16～24 h，觀察培養(yǎng)基表面是否出現(xiàn)疑似菌落。結果發(fā)現(xiàn)4份樣品在2種培養(yǎng)基表面均未出現(xiàn)疑似菌落，提示該豬場發(fā)病并非細菌病感染引起。

3.2 病毒性病原診斷結果

用滅菌手術刀和手術剪切取少量腸組織放入2.0 mL離心管內(nèi)，加入少量生理鹽水和鋼珠，低溫高速勻漿并反復凍融3次，低溫離心后取上清液保存于-80 ℃，待檢。取200 μL上清液使用商業(yè)化DNA/RNA基因組提取試劑盒進行核酸（DNA和RNA混合物）提取，并使用cDNA反轉錄試劑盒將核酸中RNA反轉錄為cDNA。應病料送檢員要求，使用商業(yè)化試劑盒以real-time PCR法分別檢測4份樣品中是否存在PEDV、PRV、PCV2（圓環(huán)病毒2型）、PRRSV（藍耳病病毒）、CSFV和PDCoV核酸，結果以上病原均為陰性。隨后在筆者建議下，我們再次檢測TGEV（傳染性胃腸炎病毒）和PoRV核酸，結果發(fā)現(xiàn)4份樣品TGEV核酸均為陰性，但PoRV核酸均為陽性，且CT值為22～25。根據(jù)臨床及實驗室診斷結果，我們判定該場仔豬腹瀉是PoRV感染引起的。

3.3 PoRV毒株VP7基因序列RT-PCR擴增、測序與分析

為確定該場流行PoRV毒株基因型及遺傳變異情況，根據(jù)參考文獻[4]合成擴增PoRV毒株VP7基因序列特異性引物，引物序列為：VP7-F：5'-GGCTTTAAATGAGAGAATTTCCGTCTGG-3'；VP7-R：5'-GGTCACATCATACAATTCTAATCTAA G-3'，擴增產(chǎn)物大小為1 062 bp，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。以RT-PCR法體外擴增1份CT較低核酸樣品VP7基因序列，其擴增體系（50 μL）包括2×PCR預混液25.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各2.0 μL，cDNA模板3.0 μL及雙蒸水18.0 μL；RT-PCR擴增條件為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；最后以72 ℃延伸7 min。反應結束后取RT-PCR產(chǎn)物進行凝膠電泳，其結果如圖2所示，擴增得到的PoRV毒株VP7基因序列產(chǎn)物大小約1 000 bp，與已知陽性對照擴增產(chǎn)物大小一致，提示我們成功擴增得到PoRV VP7基因序列。其后將該產(chǎn)物送至北京擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

測序結果拼接后去除前后不準確序列，將最終序列在NCBI上進行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)該毒株序列與GenBank數(shù)據(jù)庫收錄的PoRV G9型中國株（JF781163.1）VP7核苷酸序列同源性最高，為99.8%，與其它PoRV G9型毒株VP7基因序列同源性均高于95%；但與其它基因型PoRV毒株同源性較低，由此推測該豬場暴發(fā)的PoRV毒株屬于G9型。

4 防控措施制定與實施

確定該場仔豬發(fā)生腹瀉是由PoRV G9型感染引起后，我們采取系列措施用于防控該病：1）將發(fā)病仔豬與假定健康豬群隔離飼養(yǎng)，同時將無治療意義的腹瀉仔豬撲殺，并無害化處理；給予發(fā)病較輕仔豬進行對癥治療，如提供富含電解質飲水防止仔豬脫水；提高產(chǎn)房溫度減少仔豬體溫損失；給仔豬灌喂抗生素防止繼發(fā)細菌病感染等；2）對該場豬群緊急免疫接種腹瀉病毒三聯(lián)弱毒疫苗，仔豬出生后保證足量且優(yōu)質的初乳，減少母豬應激等；3）對豬舍內(nèi)外環(huán)境反復消毒；在豬舍過道鋪撒生石灰等保持豬舍干燥；實行“全進全出”管理體制等。

實施以上防制措施后，當時腹瀉仔豬死亡率仍然較高，但較未采取措施之前低；其后初生仔豬的死亡率極大降低，且豬場生產(chǎn)成績逐漸恢復正常。

5 討論

可導致仔豬腹瀉的病原種類繁多，但大部分養(yǎng)殖戶認為當前引起仔豬腹瀉的腸道病毒主要是PEDV和PDCoV等[5]，而忽略了TGEV、PoRV等“不常見”病原。就目前而言，針對PED的弱毒或滅活疫苗已廣泛應用于我國豬場，這使得PEDV在豬場流行情況有所緩解，也導致其它腸道病毒導致仔豬腹瀉比例逐漸提高。王成等調(diào)查結果表明，2021年春季湘西地區(qū)仔豬腹瀉樣品PoRV檢出率達25.08%（76/303），且未檢出PEDV、TGEV和PDCoV等常見腸道病毒，這說明PoRV是導致該地區(qū)仔豬腹瀉的主要腸道病毒[3]。若豬場發(fā)生仔豬腹瀉，養(yǎng)殖場應盡可能檢測多種病原，防止漏檢、延誤疾病最佳治療期。

為進一步確定該場PoRV流行株基因型特征，我們擴增并分析該毒株的VP7基因序列特征，發(fā)現(xiàn)該毒株VP7基因序列與PoRV G9型中國株（JF781163.1）VP7核苷酸序列同源性最高，提示該毒株可能為G9型，以上試驗結果為該病的防控提供了科學依據(jù)。

由于目前暫無針對豬輪狀病毒病的特效藥物，因此對該病的防治應以對癥治療和疫苗接種為主。盡管我們采取了系列措施對腹瀉仔豬進行治療，但仍然有部分腹瀉仔豬死亡，說明仔豬感染該病后一般治療效果較差。但對產(chǎn)前母豬免疫接種疫苗后，初生仔豬攝取足夠的母源抗體后對該病的防控效果較好。值得注意的是，成年豬群對PoRV也十分敏感，雖然感染該病后不表現(xiàn)明顯臨床癥狀，但仍然可對外排毒，繼而威脅其它健康豬群[3]。因此對于PoRV的防控應盡量對所有豬群免疫接種疫苗，同時提高飼養(yǎng)管理水平等。