大河烏豬STARD4基因的分子鑒定、組織表達、多態性分析與相關研究進展

李昌武，劉永剛，萬長華，廖 柱

（1.海南羅牛山畜牧有限公司，海南 海口 570100；2.云南農業大學，云南 昆明 650000）

目前我國商品豬生產規模居世界首位，是世界上最大的生豬產出國，現在中國一年要生產和消費5億頭豬，占全球豬肉生產和消費量近一半。而每個中國人平均一年要消費掉近40 kg的豬肉，遠遠高于牛羊肉和其他所有肉類的總和。1990年城鎮居民平均每人可用于生活費的貨幣收入為1 387元，2021年，我國城鎮居民人均可支配收入47 412元，增長約35倍[1-2]。隨著人民生活水平的顯著提高，人們在飲食習慣上出現了明顯差異和變化，從簡單的對肉的需要轉變成對優質、風味好、口感佳的豬肉的需求。在對豬長期選育培育的過程中，其體內脂肪含量發生一定變化，尤其是IMF（肌內脂肪）含量的變化，對肉質的風味及口感都產生一系列的影響。而目前我國一些本地豬種其IMF含量豐富，且經過雜交改良后能保持其肌內脂肪豐富的特性。王忠慶等[3]通過測定大河烏豬和大河豬肉質指標的結果表明，大河烏豬較大河豬的胴體品質和產肉性能均有較大幅度的改善，生產性能有較大幅度的提高，且有效地保持了大河豬在肉質性狀上的優勢，并在肉質評分上基本都優于大河豬，大河烏豬的IMF水平雖略有下降，但仍保持較高水平。此外，兩品種在氨基酸和脂肪酸組成上差異不顯著，也說明大河烏豬的選育過程中保持了大河豬在脂肪和蛋白質組成與結構上的優良性，大河烏豬是一種具有重要實際應用價值與研究價值的品種。因此，對其脂代謝相關功能的研究具有極為重要的意義。

STARD4（類固醇合成相關脂轉移4）基因是進化上保守的START基因家族的成員，是一種可溶性的甾醇轉運蛋白，與膽固醇感知和維持細胞內穩態有關。STARD4被廣泛表達，并已被證明其在細胞內的脂質體和細胞器之間轉移膽固醇[4]。非特異性固醇轉運機制中，STARD4是在質膜和ERC（Endocyticrecycling compartment，內吞循環體）之間的固醇轉運中占很大比例[5]。人類STARD4基因的結構顯示其具有一個保守的α-螺旋/β-GRIP折疊，其中包含一個很深的疏水口袋，用作疏水口袋蓋的Ω1-環具有封閉構象。封閉形式的甾醇結合腔的形狀不能互補用來容納膽固醇，這表明Ω1-環的構象變化對于甾醇結合是必不可少的。人類STARD4基因具有脂質體間的膽固醇轉移活性，Ω1-環和疏水壁的突變使該轉移活性喪失[6]。Iaea等[5]的研究表明可溶性膽固醇轉運蛋白STARD4占總膽固醇轉運量的25%，占質膜與內質網之間非囊性膽固醇轉運量的33%。膽固醇的非囊泡轉運機制，特別是STARD4，在質膜和ERC之間的甾醇轉運中占有很大比例。Soccio等[7]利用cDNA微陣列，發現STARD4基因在喂食高膽固醇飲食的小鼠肝臟中的表達降低了2倍以上。Northern印跡分析（RNA印漬術）表明，內質網脅迫對STARD4的誘導僅限于早期階段。熒光素酶報告基因分析表明，STARD4的誘導依賴于轉錄因子ATF6及其啟動子中的類erse元件（ER stress元件，內質網壓力相應元件）[8]。Garbarino等[9]也發現了STARD4表達的減少會導致膽固醇滯留在質膜上，與內質網相關的膽固醇減少，ACAT（Acyl coenzyme A-cholesterol acyltransferase，酰基輔酶A-膽固醇酰基轉移酶）合成的膽固醇酯減少。Mesmin等[10]為了分析STARD4的作用機制，比較了STARD4介導的甾醇轉運和簡單的膽固醇載體MCD（Methyl-Beta-Cyclodextrin，甲基-β-環糊精）介導的甾醇轉運。STARD4和胞內MCD的作用相似，它們增加了甾醇向ERC和ER（內質網）的轉移率。其結果提示，STARD4介導的膽固醇轉運是膽固醇穩態調節機制的重要組成部分。David等[4]通過敲除膽固醇轉運蛋白STARD4，發現脂質體發生了很大的變化。STARD4-KD細胞的mRNA譜也有較大變化。結果表明細胞膽固醇增加，包括晚期的內小體。這些結果也表明了STARD4在脂質穩態中起著重要作用。此外，還有證據表明STARD4的表達增加還能促進膽汁酸的合成，綜上所述STARD4是一種高度調控的、非囊泡性的、定向的細胞內膽固醇轉運體，在維持細胞內膽固醇穩態方面發揮著關鍵作用[11]。

1 研究的目的與意義

關于STARD4基因的相關研究都表明其在脂肪代謝、轉運或分解過程中起到一定作用，但目前在國內還很少見到關于STARD4基因與脂代謝相關功能的研究。本文對大河烏豬基因進行分子鑒定、組織表達、多態性分析，以為后續對STARD4基因在對養豬生產，構建人類疾病模型等相關研究提供基礎。

2 材料與方法

2.1 試驗材料與數據分析

2020年5月，隨機采取云南農業大學動科院自有試驗動物中心200頭成年大河烏豬的肺臟組織、脂肪組織、脾臟組織、肝臟組織、腎臟組織、心臟組織、小腸組織和肌肉組織。采用GENSCAN工具對cDNA序列進行預測，利用美國國立生物技術信息中心生物大分子序列比對搜索工具對序列的同源性進行分析，利用CLUSTAL OMEGA對蛋白質進行預測和分析。對STARD4基因編碼的蛋白質的等電點和分子量進行預測采用COMPUTER PI和MW TOOL工具進行。組織表達特異性分析使用Applied Biosystems 7900HT SDS來進行檢測。對開放閱讀框的分析使用美國國立生物技術信息中心中的開放閱讀框查詢軟件進行。豬STARD4基因的組織表達分析采用qRT-PCR的方法進行。

2.2 試驗方法

分離大河烏豬STARD4基因的全長cDNA。引物使用引物設計軟件Primer Premier 5.0進行并設計5'-RACE和3'-RACE引物。STARD4基因5'-RACE和3'-RACE引物序列如表1所示。

表1 STARD4基因5'-和3'-RACE引物

RACE-PCR反應程序：94 ℃ 30 s和72 ℃ 3 min條件下進行5個循環；94 ℃ 30 s，69 ℃ 30 s和72 ℃3 min條件下進行5個循環；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min條件下進行30個循環直至本次反應程序終止。對PCR引物擴增產物進行檢測及鑒定使用凝膠電泳。

擴增反應結束后，進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測外，剩余產物用于0.8%瓊脂糖凝膠電泳并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對特異性條帶切膠回收。最后進行測序。

3 結果與分析

3.1 大河烏豬STARD4基因全長cDNA序列的分子克隆

經過5'-RACE和3'-RACE擴增，得到了一條長度為895 bp和一條長度為871 bp的片段，并將這些產物分別插于T-載體進行克隆測序，從而得到一個1 164 bp的全長cDNA（圖1）。

3.2 大河烏豬STARD4基因的序列分析

通過BLAST比對大河烏豬STARD4基因cDNA核苷酸序列發現，該基因與已知的豬的任何基因都不同源，將該序列提交到GenBank數據庫（Accession number：FJ436384）。利用GENSCAN軟件對該1 164 bp cDNA序列進行基因預測，從結果中發現一個編碼209個氨基酸的完全單基因該蛋白質的等電點（pI）和分子量（Mw）的計算采用Compute pI/Mw Tool軟件，計算出該蛋白質的等電點為5.37，分子量為23 798.14 Da。

進一步比對分析發現該蛋白質與太平洋短吻海豚（Lagenorhynchus obliquidens）（accession number：XM_027100170）的STARD4蛋白具有91.3%的同源性、雙峰駝（Camelus bactrianus）（accession number：XP_010969783）的STARD4蛋白具有96.2%的同源性、羊駝（Vicugna pacos）（accession number：XP_015094376）的STARD4蛋白具有95.2%的同源性、美洲獅（Puma concolor）（accession number：XP_025779258）的STARD4蛋白具有93.8%的同源性、虎鯨（Orcinus orca）（accession number：XP_005901130）的STARD4蛋白具有95.2%的同源性。

該蛋白具有START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/CoxG/CalC（SRPBCC）ligand-binding domain superfamily結構域。

在以上STARD4蛋白質比對的結果基礎上，通過EMBL-EBI（https://www.ebi.ac.uk）中的Clustal Omega工具（http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）構建了STARD4基因進化樹見圖2。

基因進化分析表明了大河烏豬的STARD4基因與虎鯨（Orcinus orca）的STARD4基因遺傳關系較近。

3.3 大河烏豬STARD4基因的基因變異分析

在豬蛋白數據庫進一步比對分析發現大河烏豬STARD4蛋白還存在1個變異體Isoform X1（accession number：XP_020932818.1），與豬STARD4蛋白具有99%的高度相似性。

進一步在豬基因數據庫比對分析中發現，大河烏豬STARD4蛋白質編碼區存在2個突變位點（表2）。

表2 大河烏豬STARD4基因變異分析

3.4 大河烏豬STARD4基因的組織表達譜分析

組織表達譜分析表明STARD4在脂肪、肝臟、肌肉、脾臟、腎臟、小腸中高度表達，在心臟中中等表達（圖3）。

4 討論

豬在我國養殖生產中占有重要地位且其為一種重要的試驗動物，而STARD4基因又與脂肪代謝和人類疾病緊密相關。目前在其他物種上，對STARD4基因的研究雖有一些報道，但對于豬STARD4基因的克隆以及對其功能的研究還鮮少報道。本試驗首次克隆國內大河烏豬STARD4基因的cDNA序列全長。為后續以豬為動物模型研究STARD4基因相關疾病奠定基礎。相關研究表明，STARD4能增加細胞內膽固醇酯的形成，并受細胞內固醇水平的調控。當STARD4過表達時，固醇向內吞循環體（ERC）和內質網（ER）的運輸增加。STARD4介導的膽固醇轉運是膽固醇穩態調節機制的重要組成部分[12]。STARD4表達的減少會導致膽固醇滯留在質膜上，與內質網相關的膽固醇減少，ACAT合成的膽固醇酯減少[10]。在后續的研究中我們將對豬STARD4基因的這些信號通路以及作用機制進行研究，尋找與STARD4基因具有相同突變基因型的個體作為模式動物，對STARD4基因與脂代謝疾病之間的關系進行進一步深入的研究。

5 結論

大河烏豬STARD4基因完整全長cDNA序列為1 164 bp，編碼209個氨基酸，等電點為5.37，分子量為23 798.14 Da。豬STARD4基因編碼的蛋白與太平洋短吻海豚、雙峰駝、羊駝、美洲獅、虎鯨的STARD4蛋白分別具有91.3%、96.2%、95.2%、93.8%、95.2%的高度同源性。該蛋白具有START/RHO_alpha_C/PITP/Bet_v1/Cox G/CalC（SRPBCC）ligand-binding domain superfamily結構域和一個變異體。其基因編碼區存在2個突變位點。該基因與虎鯨的STARD4基因有著較近的親緣關系。大河烏豬STARD4基因在肝臟、肌肉、脾臟、腎臟、小腸、脂肪和肺高度表達，在心臟中中等表達。