云南地方豬FATP1基因多態(tài)性分析

張 斌，韓 敏，劉韶娜，相德才，熊和麗，張 彥，趙智勇

（云南省種豬性能測定站/云南省種豬質(zhì)量檢驗(yàn)測試中心/云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南 昆明 650224）

作為脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族（FATPs）的一員，脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（FATP1）基因首次在小鼠脂肪細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[1]，其主要功能可能是運(yùn)輸脂肪酸到相應(yīng)組織合成甘油三酯[2-4]。目前，豬FATP1基因的cDNA序列已經(jīng)公布[5]，且該基因定位于2號染色體的2q1.2-2.1位置[6]。研究表明，F(xiàn)ATP1基因與脂肪性狀的形成具有顯著相關(guān)性[7-8]。因此，本研究將其作為影響豬脂肪沉積的候選基因，采用PCR擴(kuò)增、直接測序、序列比對等技術(shù)，在豬FATP1基因第一內(nèi)含子、第一外顯子和第二內(nèi)含子等區(qū)域?qū)ふ铱赡艽嬖诘亩鄳B(tài)性位點(diǎn)（SNPs），檢測SNPs位點(diǎn)在云南地方豬雜交后代中的遺傳分布，為云南地方豬的雜交選育提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)耳組織樣品從云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院試驗(yàn)場于2017年11月至2019年4月飼養(yǎng)的試驗(yàn)豬中采集。隨機(jī)采集41頭杜藏豬（杜洛克×迪慶藏豬）（♂20頭、♀21頭）、56頭杜小豬（杜洛克×滇南小耳豬）（♂30頭、♀26頭）、52頭杜小藏豬（杜洛克×滇南小耳豬×迪慶藏豬）（♂25頭、♀27頭）耳組織，共149份，置于裝有75%酒精的離心管中，-70 ℃保存。

1.2 基因組DNA提取及檢測

使用天根生化科技有限公司（北京）的組織DNA提取試劑盒提取試驗(yàn)豬耳組織樣品中的DNA，共149份，置于-80 ℃保存。提取的基因組DNA樣品用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用TE緩沖液稀釋備用。

1.3 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank提供的豬FATP1全基因序列（NC_010444.4），采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)1對引物擴(kuò)增試驗(yàn)豬的FATP1基因，引物序列為：正向引物序列為（F1）5'-GATCACAATAGCA CTACCTGGC-3'，反向引物（R1）5'-GATCCAATCCC CATCTCACTCT-3'，擴(kuò)增片段長度為776 bp，委托英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增及條件

PCR擴(kuò)增體系：12.5 μL Mix，上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），2 μL（約50 ng）DNA，ddH2O補(bǔ)至25 μL。

PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min；4 ℃保存。

1.5 目的基因測序及多態(tài)性檢測

試驗(yàn)豬的FATP1基因PCR擴(kuò)增后，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增效果，而后送到北京擎科生物科技有限公司昆明分公司進(jìn)行正向測序，然后利用DNAStar（5.0）軟件的SeqMan程序檢測多態(tài)性位點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel軟件統(tǒng)計(jì)目的基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因型，并計(jì)算各多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率、等位基因頻率、雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬FATP1基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

以試驗(yàn)豬耳組織基因組DNA為模板，用F1/R1引物擴(kuò)增豬FATP1基因的第一內(nèi)含子、第一外顯子和第二內(nèi)含子等區(qū)域，擴(kuò)增獲取的目的片段（圖1）與預(yù)期大小一致，無非特異片段出現(xiàn)，可用于進(jìn)一步的DNA測序。

2.2 豬FATP1基因目的片段序列分析結(jié)果

對149份試驗(yàn)豬FATP1基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序及序列比對，發(fā)現(xiàn)與GenBank已公布的豬FATP1基因相同區(qū)域的序列吻合，確定目的片段為豬的FATP1基因序列。利用SeqMan程序分析發(fā)現(xiàn)，位于FATP1基因第一外顯子上存在1個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）c.70 C＞T，且僅存在兩種基因型，具體見圖2。

2.3 豬FATP1基因的SNP位點(diǎn)的遺傳分布情況

由表1可知，F(xiàn)ATP1基因c.70 C＞T位點(diǎn)在杜藏豬群體中不存在變異，在杜小豬和杜小藏豬中存在變異，且均處于Hardy-Weinderg平衡（P＞0.05）。在杜小豬群體和杜小藏豬群體中的優(yōu)勢等位基因型均為CC型（基因型頻率分別為0.82和0.75），優(yōu)勢等位基因均為C（等位基因頻率分別為0.911和0.875）。進(jìn)一步計(jì)算c.70 C＞T位點(diǎn)在各群體中的雜合度（He）和多態(tài)性信息含量（PIC），發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)在杜小豬群體和杜小藏豬群體中均屬低度多態(tài)（He＜0.25，PIC＜0.25），說明該位點(diǎn)在杜小豬群體和杜小藏豬群體中受自然選擇和人工選擇的影響較大。

表1 豬FATP1基因SNP位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中的遺傳分布情況

3 討論

目前，在金華豬、皮特豬、金皮F2代和杜洛克豬的FATP1基因上共檢測到5個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別位于5'調(diào)控區(qū)[9]的g-586 T→C和g-601 A→G及CDS區(qū)[10]的c.441C＞T、c.747A＞G 和 c.400C＞T。本研究設(shè)計(jì)1對引物擴(kuò)增了豬FATP1基因的第一內(nèi)含子、第一外顯子和第二內(nèi)含子等區(qū)域，在第一外顯子檢測出了1個(gè)SNP（c.70 C＞T）位點(diǎn)，并分析了該位點(diǎn)的遺傳分布情況，發(fā)現(xiàn)在杜藏豬群體中僅表現(xiàn)為CC型，在杜小豬群體和杜小藏豬群體中表現(xiàn)為CC型和CT型，表明該位點(diǎn)可能在迪慶藏豬群體和杜洛克豬群體中不存在多態(tài)性，僅在滇南小耳豬群體中存在多態(tài)性，該結(jié)果與Melo等[10]在杜洛克群體中研究的結(jié)果基本一致。

研究表明，F(xiàn)ATP1基因多態(tài)性位點(diǎn)的突變與豬的脂肪沉積具有顯著相關(guān)性[9-10]，可能是該基因多態(tài)性位點(diǎn)的變異能夠影響細(xì)胞外脂肪酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)[11]，從而影響甘油三酯的生物合成[12]。然而有關(guān)c.70 C＞T位點(diǎn)與豬的脂肪沉積的相關(guān)性，還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。