WT1 基因在骨髓增生異常綜合征中的表達(dá)及與療效的關(guān)系

孫萬磊，陳娟娟，吳瓊，賀文鳳，鄒葉青，劉川

（南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，南昌 330006）

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndrome，MDS）是一組起源于造血干細(xì)胞的異質(zhì)性克隆性疾病，其生物學(xué)特征是髓系細(xì)胞（粒系、紅系、巨核系）一系或多系發(fā)育異常（或稱病態(tài)造血）和無效造血，高風(fēng)險(xiǎn)向急性髓系白血病（AML）轉(zhuǎn)化，約20%～30%的MDS 病例轉(zhuǎn)變?yōu)锳ML[1-2]。WT1 基因作為Wilms 腫瘤的易感基因，不僅與實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，同時(shí)也在血液惡性腫瘤中有著高表達(dá)[3-4]。WT1 基因的過表達(dá)與不成熟的造血細(xì)胞有關(guān)[5]，WT1 表達(dá)水平隨著MDS 患者疾病階段的進(jìn)展，其表達(dá)水平是MDS 患者評(píng)估病情、預(yù)測(cè)病情變化及判斷預(yù)后的重要指標(biāo)。本研究通過定量PCR 檢測(cè)MDS 患者WT1 基因表達(dá)水平，探討WT1 表達(dá)與MDS 患者在診斷分型及療效評(píng)價(jià)中的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 2015 年11 月至2021 年12 月于南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院診斷的MDS 患者共70 例，男43 例，女27 例，年齡35～78 歲，中位年齡62歲。根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）2016 年MDS 分型標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其進(jìn)行分類，其中MDS-SLD 3 例，MDSMLD 25 例，MDS-EB 42 例（其中EB-1 共19 例，EB-2 共23 例）。同時(shí)并根據(jù)修定的國(guó)際預(yù)后積分系統(tǒng)(IRSS-R)對(duì)MDS 患者進(jìn)行危險(xiǎn)度的分層，極低危組3 例，低危組18 例，中危組24 例，高危組14 例，極高危11 例。34 例MDS-EB 患者接受包括去甲基化藥物（如阿扎胞苷、地西他濱）單藥、或聯(lián)合維奈克拉及小劑量化療、HAG 或CAG 方案等治療。陰性對(duì)照組為45 例非惡性血液系統(tǒng)疾病患者的骨髓樣本。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法（1）提取RNA 及逆轉(zhuǎn)錄：骨髓穿刺時(shí)收集初診及治療后的MDS 患者骨髓3～5 mL，用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll 分離液）分離單個(gè)核細(xì)胞。經(jīng)TRIzol 法（Invitrogen 公司）提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定260、280 nm 吸光度，計(jì)算RNA含量及純度。取2 μg 總RNA 用MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)為cDNA。（2）實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQPCR）：使用ABI 7500（ABI 公司，美國(guó)）熒光定量PCR 儀進(jìn)行RQ-PCR 檢測(cè)。WT1 基因及ABL 內(nèi)參基因的引物及TaqMan 探針序列見表1。PCR 反應(yīng)體系共20 μL: Premia Ex TaqTM 10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，熒光探針0.8 μL，cDNA 模版2 μL，滅菌去離子水6.2 μL。反應(yīng)條件為：50 ℃預(yù)變性3 分鐘，95 ℃熱啟動(dòng)5 分鐘，然后95 ℃變性20 s，60 ℃退火60 s，共45 個(gè)循環(huán)。每次實(shí)驗(yàn)均設(shè)立陰性及陽性對(duì)照。（3）WT1 表達(dá)計(jì)算方法：以ABL 為內(nèi)參照基因，用已知拷貝的ABL 標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計(jì)算各樣本中WT1 及ABL 基因的拷貝數(shù)，WT1 基因表達(dá)水平（%）=（W1 拷貝數(shù)/ABL 拷貝數(shù)）×100%。

表1 WT1、ABL 基因引物及探針

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以()表示，均采用非參數(shù)檢驗(yàn)，Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，兩組間比較用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WT1 基因在MDS 患者中的表達(dá) 不同診斷分型的MDS 患者，WT1 表達(dá)水平存在一定差異，MDS-SLD 及MLD 組WT1 表達(dá)水平較低，與對(duì)照組無顯著差異(P＞0.05)，而MDS-EB-1 及MDSEB-2 組，WT1 表達(dá)水平較對(duì)照組、SLD 及MLD 組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),而EB 1 及EB 2 組之間的WT1 表達(dá)水平并無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，見表2。

表2 WT1 在MDS 分型中的表達(dá)

2.2 不同IPSS-R 危險(xiǎn)分層MDS 患者WT1 表達(dá)按IPSS-R 積分系統(tǒng)進(jìn)行預(yù)后分層，MDS 患者可分為極低危組、低危組、中危組、高危組及極高危組。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、極低危組、低危組及中危組MDS 患者的WT1 表達(dá)水平均無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，而高危組及極高危組MDS 患者，WT1 表達(dá)水平顯著高于其它組(P＜0.05)，而高危組及極高危組之間WT1 表達(dá)無顯著差異(P＞0.05)，見表3。

表3 WT1 在不同預(yù)后分層MDS 患者中的表達(dá)

2.3 MDSRAEB 患者治療前后WT1 表達(dá)水平比較34 例MDS-EB 患者接受了包括去甲基化藥物單藥或聯(lián)合維奈克拉、小劑量化療等方案化療，化療后復(fù)查WT1 基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)治療前34 例MDS-EB患者WT1 基因表達(dá)為（8.21±6.3）%，治療后WT1表達(dá)水平下降為（0.73±0.56）%，與治療前相比，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。

3 討論

骨髓增生異常綜合征作為一組異質(zhì)性疾病，部分患者存在向急性髓細(xì)胞白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險(xiǎn)[6-7]，在疾病的不同階段需密切進(jìn)行觀察以判斷其危險(xiǎn)度、療效及預(yù)后。通過準(zhǔn)確的預(yù)后評(píng)估，為不同危險(xiǎn)度的患者選擇最適宜的治療方案顯得尤為重要。在MDS 患者風(fēng)險(xiǎn)及預(yù)后的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)中，原始細(xì)胞比例、血細(xì)胞減少的程度和細(xì)胞遺傳學(xué)特征等是主要指標(biāo)[8-9]。文獻(xiàn)報(bào)道染色體核型異常在MDS的檢出率為40%～70%，在幼稚細(xì)胞數(shù)不高的MDS患者中伴有異常核型尚不足32%[10]。對(duì)于該部分缺乏染色體核型分析結(jié)果病人來說，更需要有力的指標(biāo)以協(xié)助患者進(jìn)行診斷、判斷預(yù)后及指導(dǎo)治療。

WT1 基因被稱為“泛白血病基因”，在急性白血病中表達(dá)顯著增高，WT1 基因的表達(dá)水平被證實(shí)與原始細(xì)胞的總量相關(guān)，其表達(dá)水平的高低可用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤的進(jìn)展、預(yù)后及檢測(cè)微小殘留病（MRD）的檢測(cè)指標(biāo)[11-12]。在本研究發(fā)現(xiàn)非惡性血液病患者低水平表達(dá)WT1 基因，而WT1 基因在不同分型的MDS 患者中的表達(dá)存在顯著差異，在WHO(2016) MDS 分型標(biāo)準(zhǔn)中，原始細(xì)胞是一個(gè)重要指標(biāo)，原始細(xì)胞比例小于5%時(shí)，診斷為SLD或MLD，而這兩組MDS 患者的WT1 表達(dá)水平較低，與對(duì)照組相比無顯著差異；當(dāng)MDS 患者的原始細(xì)胞比例大于等于5%時(shí)，患者診斷為MDS-EB-1，而原始細(xì)胞比例為10%～20%時(shí)，診斷為MDSEB-2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MDS-EB-1 及EB-2 患者的WT1基因表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組、SLD 及MLD 組，但EB-1 及EB-2 之間并無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。此外，按IPSS-R 分層體系對(duì)MDS 患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層，發(fā)現(xiàn)極低危組、低危組與中危組的WT1 表達(dá)與對(duì)照組無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而高危組及極高危組的MDS患者的WT1 表達(dá)水平顯著高于極低危組、低危組與中危組。此研究結(jié)果說明，MDS 患者的WT1 表達(dá)水平與原始細(xì)胞比例及危險(xiǎn)分層有關(guān)。

本研究中，MDS-EB 患者接受了以去甲基化藥物為基礎(chǔ)的方案治療，治療后患者的WT1 水平顯著下降,在疾病監(jiān)測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)，部分患者在病情復(fù)發(fā)進(jìn)展時(shí)WT1 水平再次顯著升高（結(jié)果未展示），說明WT1 表達(dá)與治療效果存在相關(guān)性。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，MDS 患者去甲基化治療及造血干細(xì)胞移植過程中，可通過監(jiān)測(cè)WT1 基因的表達(dá)水平以評(píng)估其療效，并預(yù)測(cè)患者的總體生存期、無進(jìn)展生存期[13-15]。因此，在MDS 患者的診治過程，可通過定期監(jiān)測(cè)WT1 的表達(dá)，對(duì)疾病治療療效、復(fù)發(fā)及進(jìn)展等進(jìn)行評(píng)估。

總之，在MDS 患者的診治過程中，WT1 基因的表達(dá)水平監(jiān)測(cè)具有重要意義，不僅可作為其危險(xiǎn)度評(píng)分的依據(jù)，同時(shí)也可作為其治療效果的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究例數(shù)相對(duì)少，需要更多病例及規(guī)范監(jiān)測(cè)時(shí)間來驗(yàn)證及支持。