佛手山藥線蟲病害發生調查與病原鑒定

楊小林, 李夢歡, 何中華, 胡營營, 王高峰, 常向前,王佐乾, 肖雪瓊, 肖炎農*, 張 舒*

(1. 湖北省農業科學院植保土肥研究所,農作物重大病蟲草害防控湖北省重點實驗室, 武漢 430064;2. 華中農業大學植物科學技術學院,湖北省植物病害監測與安全控制重點實驗室, 武漢 430070;3. 湖北省浠水縣蔬菜水果花卉科技開發中心, 黃岡 438200)

山藥原名“藷藇”,俗稱土薯,為藥食同源的多年生草質藤本植物,是薯蕷科Dioscoreaceae薯蕷屬Dioscorea多個種的統稱[1]。山藥原產于亞洲和非洲,在中國南北各地區均有種植,主要分布于山西、河北、湖北、山東、河南、安徽、江蘇和江西等地[2]。

近年來山藥線蟲病在許多國家和地區發生,嚴重影響山藥產量和品質。在西非曾有緩慢盾線蟲Scutellonemabradys、根結線蟲Meloidogynesp.為害山藥的報道,在波多黎各、牙買加、英屬所羅門群島、太平洋和中美洲曾有咖啡短體線蟲Pratylenchuscoffeae危害山藥的記載[3-4]。在烏干達,蘇丹短體線蟲已成為引起當地山藥線蟲病害的優勢種[5]。我國于1987年首次報道薯蕷根腐線蟲Pratylenchusdioscoreae在河南的危害;1988年-1999年間張廣民等報道在山東嘉祥發現穿刺根腐線蟲Pratylenchuspenetrans危害山藥[6];2019年張海燕等在山東發現了根結線蟲危害山藥[7]。賀哲等研究發現在江西瑞昌有山藥根腐線蟲病的發生,并經形態學和分子生物學鑒定該病原線蟲為咖啡短體線蟲Pratylenchuscoffeae[8]。莫毅君等在桂林地區淮山藥上發現了根腐線蟲病發生危害,發病率為44.23%[9]。江蘇沛縣曾報道山藥根結線蟲病的發生蔓延逐漸加重,輕病田減產15%～20%,重病田減產80%[10]。

武穴市地處湖北省東部,屬亞熱帶季風性濕潤氣候,適宜種植山藥[11]。該地特色農產品佛手山藥因其優良的品質以及獨特的品種特征于2009年獲國家農產品地理標志認證。武穴佛手山藥種植歷史悠久,據清同治壬申《廣濟縣志》記載,于唐貞觀年間開始引入種植,至今已有1 300多年的歷史;李時珍在《本草綱目》中曾記載,佛手山藥具有健脾止瀉,補益氣,潤皮毛,補虛羸,除寒熱邪氣,強筋健骨之功效[11]。目前佛手山藥栽培面積常年在66.67 hm2左右,畝產值達12 000元以上,其經濟產值是水稻、棉花等大宗作物的3～10倍,武穴現已成為全國最大的“佛手山藥”生產基地[12-13]。近年來該地佛手山藥線蟲病頻發,但具體發生情況尚不明確,因此本研究主要對該地佛手山藥線蟲病發生情況展開調查,并利用形態學和分子鑒定相結合的方法,對樣品中所分離到的線蟲進行分類鑒定,通過構建系統發育樹分析病原線蟲系統發育關系。目的在于了解武穴地區引起佛手山藥線蟲病的線蟲種類,為當地的線蟲防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器設備及試劑

儀器設備:連續變倍體視顯微鏡(型號XTB-01)徠卡顯微系統(Leica Microsystems);生物顯微鏡(型號13395H2X)徠卡顯微系統(Leica Microsystems);倒置顯微鏡(型號Olympus IX71),北京普瑞賽司儀器有限公司;線蟲分離盤(實驗室自制);網篩(200目、500目);牛津杯。

1.2 山藥根際土壤樣品的采集

2021年5月在湖北省黃岡市武穴市大金鎮山藥專業合作社基地采集山藥及土樣。山藥基地前期生產依照常規用藥防控山藥線蟲病,按自然生產狀態分為4類,分別為未施藥1年土(山藥苗期未施用2%阿維菌素,且上茬作物非佛手山藥)、施藥1年連作土(山藥苗期施用1次2%阿維菌素,且連續2年種植山藥)、未施藥2年連作土(山藥苗期未施用2%阿維菌素,且連續3年種植山藥)和施藥2年連作土(山藥苗期施用1次2%阿維菌素,且連續3年種植山藥)。參考洪彩鳳等[14]所描述的方法,采用五點取樣法分別采集上述4類山藥土樣,每類型土壤選取3塊,即重復3次取樣,用自封口塑料袋包裝,及時帶回室內分離檢測。

1.3 線蟲分離

量取100 mL的土壤樣品用改良淺盤法進行線蟲分離[15]。

1.4 樣品中線蟲的形態學鑒定

先將待鑒定線蟲于60℃水浴鍋3 min殺死,然后加入FAA 固定液(福爾馬林6 mL,95% 乙醇20 mL,冰醋酸1 mL,蒸餾水40 mL)固定,制成臨時玻片。在倒置顯微鏡下觀察、測量、記錄其形態學特征。線蟲形態描述依據DeMan公式[16]。

1.5 樣品中線蟲的分子生物學鑒定

對采集到的山藥線蟲樣品進行分子鑒定。單條線蟲的DNA提取參考已報道方法[17]。線蟲28S rRNA基因的D2/D3區采用如下引物進行擴增:上游引物28S-D2A:5′-ACAAGTAECGTGAGGGAAAGTTG-3′和下游引物28S-D3B:5′-TCGGAAGGAACCAGCTACTA-3′,反應體系為: DNA模板1 μL, PrimeSTAR Max DNA 25 μL,上游引物和下游引物各2 μL, ddH2O補足至50 μL。PCR擴增條件為:94℃預變性5 min;94℃變性30 s,60℃退火30 s,72℃延伸1 min,35個循環;72℃延伸10 min,16℃保持。PCR產物經1.3%瓊脂糖凝膠檢測,擴增產物切膠回收,產物送武漢擎科生物技術有限公司測序。

1.6 系統進化分析

系統進化分析采用MEGA X 5.2軟件,根據BLAST比對結果從GenBank數據庫中下載線蟲28S rDNA 基因的D2/D3區序列作為系統進化分析參考序列[18-20]。采用Clustal W方法默認參數將本研究測序獲得的線蟲序列與參考序列進行比對分析。序列比對結果基于鄰接法(neighbor-joining),采用K2P 模型(kimura 2-parameter model)構建系統進化樹,選擇自展法(bootstrap method)重復1 000次對進化樹分支可信度進行評估。上述序列比對結果按線蟲種類進行分組后,采用MEGA X 5.2軟件遺傳距離計算模塊下的相應算法,使用算法默認參數分析種內及種間遺傳距離。

1.7 SCAR-PCR 特異性引物驗證

根據系統發育樹及序列比對分析結果,利用種特異性引物[21]PC1: 5′-ATGCGCACATTGCATTCAGC-3′和PC2: 5′-GAGCGAGAAACACCTCTCAC-3′對不同DNA 樣本進行擴增,PCR 反應體系:DNA模板1 μL,5 μmol/L的上游引物和下游引物各2 μL,2×ExTaqMix 12.5 μL,ddH2O補足至25 μL。擴增條件:94℃預變性4 min;94℃變性30 s,60～66℃(按引物不同)退火30 s,72℃延伸45 s,共40個循環;72℃延伸10 min。PCR產物在1.3%瓊脂糖凝膠上電泳檢測,根據相應引物的擴增片段大小確定線蟲的種類。

1.8 數據統計及分析

用SPSS Statistics 18.0軟件的ANOVA 程序進行方差分析,LSD 法在0.05水平分析試驗中不同處理之間的差異。Graph軟件分析作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤樣品中線蟲數量

對采集的山藥土樣進行線蟲分離,線蟲數量如表 1所示。不同樣地類型線蟲數量不同,不同土層深度線蟲數量亦不相同。

從5～10 cm土層線蟲數量看，未施用阿維菌素連作2年地>施用阿維菌素連作2年地>未施用阿維菌素1年地>施用阿維菌素連作1年地，且各地塊類型之間差異顯著。10～20 cm土層的線蟲數量最高的為未施用阿維菌素連作2年地，顯著高于其他類型地塊，施用阿維菌素連作1年地線蟲數量最低，顯著低于其他類型田塊，施用阿維菌素連作2年地與未施用阿維菌素1年地之間差異不顯著。20～30 cm土層的線蟲數量分布與10～20 cm相似，未施用阿維菌素連作2年地線蟲數量顯著高于其他類型田塊，施用阿維菌素連作1年地線蟲數量顯著低于其他類型田塊，且施用阿維菌素連作2年地與未施用阿維菌素1年地之間差異不顯著。

施用阿維菌素1年連作地和施用阿維菌素連作2年地5～10 cm與10～20 cm土層深度線蟲數量之間差異不顯著,但20～30 cm土層深度中的線蟲數量顯著低于前兩個深度; 未施用阿維菌素連作2年地和未施用阿維菌素1年地地塊5～10 cm與20～30 cm土層深度之間線蟲數量差異不顯著,但10～20 cm土層深度線蟲數量顯著高于前兩者。

由表1可見未施用阿維菌素連作2年地線蟲達381.07條/100 mL土樣,是施用阿維菌素連作2年地數量的2.35倍;未施用阿維菌素1年地線蟲達133.4條/100 mL土樣,是施用阿維菌素連作1年地數量的3.34倍，且10～20 cm土層線蟲數量最多。由此可見:線蟲主要集中分布于10～20 cm深度的土層中,且連作1年地較連作2年地的線蟲數量少,施用阿維菌素的地塊較未施用的線蟲數量少。

2.2 樣品中線蟲種類的形態學鑒定

2.2.1形態測計值

武穴市山藥線蟲的形態測計值見表2。 將該線蟲群體的測計值與Ryss和Wang[22-23]描述的群體以及陳曉玲[24]所描述的群體相比較,其測計值基本一致。因此將該武穴群體初步鑒定為咖啡短體線蟲Pratylenchuscoffeae。

表1 連作土壤中不同土層深度的線蟲數量分布1)

表2 咖啡短體線蟲武穴群體與其他群體測量值比較1)

2.2.2形態描述

雌蟲:蟲體向腹部微彎曲呈C形,角質層環紋明顯(圖1a),唇區縊縮(圖1b,c)。口針發達,基部球呈橢圓形,具2個唇環(圖1b,c)。中食道球呈卵圓狀,食道腺狀似長葉(圖1e,f)。尾端鈍圓、平截或有缺刻,尾部形態多樣且多有變異(圖1g)。

雄蟲:蟲體相對細長,且形體與雌蟲相似,交合刺頭部明顯且窄細,似弓狀(圖1f),交合傘包至尾端,尾部尖細。

圖1 咖啡短體線蟲光學顯微照片Fig.1 Optical photomicrograph of the Pratylenchus coffeae

2.3 樣品中線蟲的分子生物學鑒定

在體視鏡下挑選48條線蟲樣品,提取DNA后進行通用引物驗證,根據通用28S D2A/D3B引物擴增的片段大小初步鑒定線蟲的種類,共擴增出48條785 bp條帶。將PCR擴增產物送測后進行BLAST分析比對,初步結果顯示,線蟲樣本中有46條為咖啡短體線蟲Pratylenchuscoffeae,2條為擬麗突線蟲Acrobeloidesnanus,咖啡短體線蟲占線蟲總數的95.83%,從上述結果可知:該地區短體線蟲優勢種類為咖啡短體線蟲。

圖2 短體線蟲種群 rDNA 28S D2A/D3B基因擴增片段Fig.2 Fragments of rDNA 28S D2A/D3B genes amplified from Pratylenchus nematodes

2.4 短體線蟲種群的系統進化分析

從NCBI分別下載來自中國、法國、泰國等國家的短體線蟲不同種群rDNA 28S D2/D3序列,與本研究獲得的序列一起構建系統進化樹(圖3),以四翼無刺線蟲Aspiculuristetraptera(KF444351.1)和食細菌線蟲-擬麗突線蟲(WX48)作為rDNA 28S樹的外群。基于rDNA 28S D2/D3序列系統進化樹(圖 3)顯示武穴山藥短體線蟲WX45與泰國群體(MK346210.1)聚類在一個分支上,置信度達98%,與香港群體(HQ688677.1)聚集在同一分支上,置信度高達99%。

圖3 基于rDNA 28S D2A/D3B序列構建的部分武穴市短體線蟲種群鄰接法系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of partial Pratylenchus species on wheat in Wuxue region of China based on rDNA 28S D2A/D3B sequences using neighbor-joining method

2.5 短體線蟲種群的SCAR 引物檢測

利用SCAR引物對48條線蟲DNA樣本進行擴增,結果顯示,咖啡短體線蟲SCAR引物對PC1/PC2共擴增出46條約630 bp的條帶(圖4),表明這些樣本均為咖啡短體線蟲。SCAR檢測結果表明,48條山藥線蟲樣品單條DNA 樣本中,46條為咖啡短體線蟲,與上述基于rDNA序列分析得出的結果一致。

圖4 短體線蟲種群的特異性引物檢測Fig.4 Identification of Pratylenchus species using the species-specific primers

3 結論與討論

本試驗對從武穴市佛手山藥種植區自然發病土壤中分離得到的線蟲,通過形態學觀察,發現與王碩等[25]、趙來順等[26]學者報道的咖啡短體線蟲相接近。進一步通過分子生物學鑒定,將山藥病原線蟲的PCR擴增序列與其進行比對,得出山藥病原線蟲為咖啡短體線蟲Pratylenchuscoffeae,與劉海璐等[21]的研究報道相一致。

土壤線蟲數量與土壤含水量顯著相關,食細菌線蟲、食真菌線蟲以及植物線蟲在不同土壤深度其數量存在著顯著變化,土壤水分被證明是影響線蟲密度和營養的最重要變量之一[27-28]。劉方明等[29]的研究表明,玉米地10～20 cm土層土壤線蟲的數量顯著高于20～30 cm土層。

本研究對采集連作地的土樣進行調查,結果表明,在同樣施用阿維菌素的情況下,連作1年土中的線蟲數量明顯少于連作2年土中的線蟲數量。山藥忌連作重茬重溝栽植[30]，否則易引發山藥病害,造成山藥減產甚至絕收。表明藥劑防治對于重茬連作山藥病害有一定的防治效果。阿維菌素是防治新茬山藥病害的常用藥劑,對于重茬連作山藥病害,許念芳等[31]報道2%阿維菌素微囊劑30倍液、30%辛硫磷30倍液和30%噻唑膦60倍液混合后噴施到山藥種植溝中,對重茬地山藥線蟲病防治效果較好。

本次研究明確了造成武穴市佛手山藥根腐病的病原線蟲種類,初步探索了線蟲在土中的分布情況,明確提出輪作和施用藥劑對于保障山藥健康生長有必要。前期所分離到的擬麗突線蟲并非植物病原線蟲而是土壤中常見的食細菌線蟲,因此,對于引起佛手山藥根腐病的病原除了咖啡短體線蟲外是否還有其他病原還需進一步的研究論證。篩選新的藥劑進行山藥多病害的高效防治亦是未來研究的主題。