畸形桑葉中病毒的鑒定及其小RNA特征分析

孔衛青, 凌 君, 楊金宏

(安康學院, 陜西省蠶桑重點實驗室, 安康 725000)

蠶桑產業是我國傳統優勢產業,近年隨著生物技術的發展,蠶桑產業在食用、飼用、醫藥、化工等多個領域的應用得到不斷拓展。桑葉是家蠶的唯一食物來源,桑葉的產量和質量對蠶桑產業的發展具有重要影響。植物病毒病可導致宿主品質降低、產量下降、甚至絕收,危害嚴重。近年常見桑葉病毒病的相關報道,病害導致桑葉卷曲、畸形、發黃、萎縮等,影響桑葉的產量和品質。迄今為止已報道的感染桑樹病毒有桑花葉型萎縮病相關病毒(mulberry mosaic dwarf associated virus， MMDaV)[1]、桑花葉卷葉病相關病毒(mulberry mosaic leaf roll associated virus, MMLRaV)[2]、桑桿狀DNA病毒1(mulberry badnavirus-1, MBV-1)[3]、桑脈帶相關病毒(mulberry vein banding associated virus, MVBaV)[4]、桑花葉萎縮類病毒(mulberry mosaic dwarf viroid, MMDVd)[5]、柑橘葉斑病毒(citrus leaf blotch virus, CLBV)[6]、李壞死環斑病毒(prunus necrotic ringspot virus, PNRSV)、桑潛隱病毒(mulberry cryptic virus, MuCV)[7]、煙草線條病毒(tobacco streak virus, TSV)[8]等,分屬于8個科。

陜西安康地區是我國優質繭絲生產基地,近年來調查發現桑園病毒病害日趨嚴重。小RNA(small RNA, sRNA)深度測序技術直接以宿主中sRNA為研究對象,是一種發現新病毒、監控病毒變異的有效方法,在植物、無脊椎動物和人體細胞病毒的鑒定和分類等方面有較多的應用[9]。本研究對安康主要桑樹種植區進行采樣調查,利用RT-PCR對9種病毒在樣品中的存在情況進行鑒定,對MMLRaV、MMDaV、MMDVd和MuCV復合侵染的桑樹葉片小RNA(small RNA,sRNA)進行深度測序和分析,為桑樹病毒病的防控和抗病育種提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年春在安康市漢濱區五里鎮、大同鎮、恒口鎮等地調查桑病毒病發生情況,采集表現為畸形的桑樹病毒病癥狀的葉片68份,-80℃冰箱保存備用。

1.2 RNA提取與RT-PCR擴增驗證

利用EastepTMSuper 總RNA提取試劑盒(LS1040)提取桑樹葉片的總RNA,反轉錄試劑盒(A5001)和2×PCR反應混合液(M7122)進行總RNA的反轉錄和PCR擴增,以桑樹actin基因為內參對照,檢測畸形桑樹葉片中的病毒。擴增程序為:94℃ 5 min預變性;94℃ 30 s,52℃ 45 s,72℃ 1 min,30個循環;72℃延伸10 min。檢測引物來自文獻或利用Primer Premier 5.0設計(表1),由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 病毒檢測引物1)

續表1 Table 1(Continued)

1.3 sRNA文庫構建與測序

為進一步鑒定桑樹中的病毒,對經RT-PCR檢測復合感染了MMDaV、MMLRaV、MMDVd和MuCV的‘淮陰4號’桑樹進行小RNA測序。取單株5個枝條,混合單枝條的3片桑葉為一個樣本,共5個重復樣本。以無病毒侵染的健康‘淮陰4號’桑樹葉片為對照,3個重復。提取各樣本總RNA,利用Qubit RNA檢測試劑盒(Q32855,Life)進行定量,檢測合格后送生工生物工程(上海)股份有限公司構建sRNA文庫,Qubit DNA檢測試劑盒檢測合格的sRNA文庫進行Hiseq 2500平臺高通量測序。

1.4 候選病毒sRNA序列分析

對測序所得數據進行處理,去除接頭和低質量數據,篩選長度為18～28 nt的sRNA,使用Bowtie 1.0軟件和無參考基因組分析候選寄主病毒sRNA,統計sRNA數量、長度、5′-末端核苷酸組成。對基因組環狀病毒,通過在完整基因組序列后面手動加入其自身的第1～27 nt序列作參考基因組進行分析。

2 結果與分析

2.1 侵染桑樹的主要病毒種類檢測

RT-PCR對68份畸形桑樹葉片進行檢測,結果共檢測到MMDaV、MMLRaV、MMDVd、MuCV 4種病毒,其中MuCV只在1份樣品中被檢出,該樣品同時檢出了MMDaV、MMLRaV、MMDVd(圖1b),為4種病毒的復合侵染(圖1a)。MMDVd的檢出率為47.06%,且所有檢出MMDVd的樣本均同時檢測到MMDaV和MMLRaV(圖1c)。MMLRaV的檢出率為83.82%(圖1d),MMDaV在68份樣品均檢測(圖1e)。MBV-1、MVBaV、CLBV、PNRSV和TSV等5種病毒在本次采集樣本中沒有檢測到。

圖1 4種病毒復合侵染桑樹的癥狀及病毒侵染樣本的檢測Fig.1 Symptom of mulberry infected by four viruses and the detection of samples infected by viruses

2.2 sRNA及其特征分析

去除低質量和長度小于18 nt大于28 nt的測序數據,復合侵染桑樹樣本和對照樣本分別得到sRNA序列58 920 928條和32 715 082條,數據過濾后復合侵染桑樹樣本獲得病毒sRNA序列6 470 767條,對照樣本僅獲得74條,幾乎沒有病毒來源序列(表2)。與GenBank病毒數據庫和桑樹病毒序列進行比對,所得sRNA可以比對到MMDaV、MMLRaV、MMDVd、MuCV 4種病毒的核酸序列,與前述RT-PCR鑒定結果一致。

表2 復合侵染和對照桑樹樣本的sRNA數

統計sRNA的長度,MMLRaV、MMDVd、MuCV的sRNA長度以21 nt最多,而MMDaV的sRNA長度以24 nt最多(圖2)。分別統計來自本研究4種病毒基因組鏈和互補鏈的sRNA的末端序列(圖3),結果顯示MMDaV基因組鏈sRNA的5′-末端以A和T為主,分別占總數的37.10%和32.39%,互補鏈以A為主,占總數的44.57%。MMLRaV和MMDVd基因組鏈sRNA的5′-末端以T最多,均占總數的50%以上,而其互補鏈剛好相反,以A和G居多。MuCV基因組鏈sRNA的5′-末端以C最多,占總量的54.15%,互補鏈主要為A,占其總量的70.66%。

圖2 4種病毒sRNA長度分布Fig.2 Length distribution of sRNA from four viruses

圖3 4種病毒基因組鏈和互補鏈sRNA 5′-末端堿基Fig.3 The 5′-terminal nucleotide bias of sRNA from genomic and negative strands of four viruses

3 討論

隨著檢測技術的發展,近年來報道的病毒種類不斷增多,同時,由于媒介昆蟲能傳播多種病毒,植物病毒的復合侵染現象時常發生。桑樹病毒病在我國江蘇、廣東、廣西、陜西等地均有發生,且復合侵染現象嚴重,發生癥狀多為卷葉、花葉、皺縮等,難以區分,如孫勛勛等[10]從皺縮狀和花葉狀桑葉樣品中同時檢測到MMDaV和MVBaV,Ma等[1]從畸形的桑樹葉片中同時檢測到3種病毒MMDaV、MMLRaV和MMDVd。本文利用RT-PCR對安康地區3個蠶桑重點鎮桑園的68份桑葉樣本的感染情況進行了檢測,發現了最多4種病毒的復合侵染。

MMDaV為雙生病毒科Geminiviridae成員,又被稱為桑樹皺葉病毒(mulberry crinkle leaf virus, MCLV),目前的研究主要集中在病毒的檢測,先后建立了酶聯免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)、核酸斑點雜交(nucleic acid spot hybridization,NASH)、基于SYBR GreenⅠ的qPCR檢測等方法[12-14]。柴建萍等對發病桑園中半翅目Hemiptera粉虱科Aleyrodidae桑粉虱Pealiusmori的研究顯示,其可通過取食獲毒,是該病毒的攜帶者和傳播媒介[15]。但關于MMDaV的侵染性、宿主范圍及其損害評估等缺乏相關研究。MMLRaV為豇豆花葉病毒科Comoviridae成員,2014年盧全有在花葉卷葉癥狀桑葉中發現[2]。MMDVd為植物亞病毒感染因子,又稱為小分子環狀RNA(mulberry small circular RNA,mscRNA),最新研究顯示其為MMLRaV的衛星RNA。MuCV為雙分病毒科Partitiviridae成員[7],2020年在陜西安康地區發現,MuCV的感染是首次在我國發現,該病毒引起癥狀不顯著,同時存在于無癥狀桑葉中,給桑樹病毒病的預防和防治提供了參考。

植物在對抗病毒侵染的過程中,通過RNA沉默機制靶向病毒基因組可產生病毒小RNA[16],近年來,利用小RNA深度測序發現和檢測植物病原應用廣泛。本文對復合病毒感染的畸形桑葉進行了小RNA深度測序,分析葉片感染的病毒,所得結果與RT-PCR鑒定一致,未發現其他新病毒。病毒sRNA的產生和其在寄主體內的復制機制有關,本文進一步分析4種病毒sRNA的長度和5′-末端組成。從長度組成,3種RNA病毒MMLRaV、MMDVd和MuCV的sRNA長度主要為21 nt,DNA病毒MMDaV以24 nt最多,與非洲木薯花葉病毒(African cassava mosaic virus, ACMV)中的研究一致[17],說明3種RNA病毒和DNA病毒由不同Dicer-like(DCL)蛋白加工生成[18]。不同sRNA的5′-末端組成決定了其結合的宿主蛋白[19-20],5′-末端序列組成方面,MMLRaV和MMDVd比較一致,與MuCV和MMDaV均不相同,說明本研究復合病毒侵染桑樹中存在多個sRNA識別裝載機制,為桑樹病毒的復制侵染機制研究奠定了基礎。