八角炭疽病生防菌株篩選及發酵條件研究

劉連金, 李正令, 李雪理, 李興田, 侯 青,楊友聯, 廖旺姣, 嚴 凱,*, 張曉勇,*

(1. 六盤水師范學院生物科學與技術學院, 六盤水 553004; 2. 廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室, 南寧 530022)

八角IlliciumverumHook. f.是著名的調味和藥用植物。炭疽病是八角樹在高溫季節發生最普遍、最嚴重的病害之一,尤其在人工種植或自然生長的八角植株上分布廣泛。該病害多始發于葉尖和葉緣,并逐漸擴展成圓形或不規則形的水漬狀病斑,后期病斑干枯呈棕色，常引起落葉,嚴重影響果實的產量和質量。據前人報道八角炭疽病病原菌主要有球炭疽菌Colletotrichumcoccodes[1]、膠孢炭疽菌C.gloeosporioides[2]和哈銳炭疽菌C.horii[3]。

近年來,生產上對八角炭疽病的防治主要采取化學藥劑。苯醚甲環唑、丙環唑、氟硅唑和腈菌唑等對八角炭疽病防治效果較為理想,但長期施用化學農藥不僅會提高病原抗性[4],同時還帶來了食品安全和生態環境污染風險。高效生防菌劑的研發和推廣應用是實現八角病害綠色防控最重要的途徑之一。相比傳統防治方法,生防菌具有抑菌效果好、成本低、抗菌譜廣和安全性高等優勢,開發潛力巨大。生防菌可通過合成、分泌抑菌活性物質,競爭作用占領生態位,誘導植物產生抗病性等多種途徑發揮高效的生防功能[5-6]。

本研究以組織分離法從八角葉片中分離出拮抗菌株,并通過與哈銳炭疽菌進行對峙培養篩選出高效拮抗菌株,結合形態學、分子學方法對拮抗菌株進行鑒定,并對拮抗菌發酵濾液抑菌活性進行檢測,以及采用離體葉片法測定拮抗菌對八角炭疽病的防治效果,再設計試驗對菌株最佳發酵條件進行研究,為八角炭疽病綠色防控研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 拮抗菌株的分離和篩選

采用組織分離法[7]分離健康八角葉片的內生細菌菌株。選取健康八角葉片,自來水洗凈后將其剪成5 mm×5 mm的小塊,用75%乙醇快速消毒30 s,2%次氯酸鈉溶液消毒1 min,無菌水清洗5次,滅菌的濾紙吸干表面水珠后采用五點法接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基(牛肉膏3.0 g,蛋白胨10.0 g,NaCl 5.0 g,水1 000 mL,自然pH)平板,30℃培養48 h后用接種環挑取葉片周圍的細菌菌落,重復3次進行平板劃線獲得單一菌株,所得菌株懸浮于30%甘油中并凍存于-20℃冰箱中備用。

指示菌八角炭疽病病原菌哈銳炭疽菌C.horii由廣西林業科學院廣西特色經濟林培育與利用重點實驗室廖旺姣等分離及鑒定[3]。所有供試菌株現保藏于六盤水師范學院基礎生物學實驗中心。

采用三點平板對峙法篩選哈銳炭疽菌的生防菌株。用6 mm無菌打孔器打取已活化的哈銳炭疽菌菌落邊緣菌餅接種于PDA平板的中央。在距離中央菌餅3 cm的上、左、右3個點分別用接種針蘸取微量內生菌菌體進行點接。25℃下培養,待下側菌絲長至平板的邊緣時測量對峙側的菌落半徑(mm),并計算抑菌率,3次重復。抑菌率=(對照側菌落半徑-對峙側菌落半徑)/對照側菌落半徑×100%。

1.2 拮抗菌株的鑒定

挑取活性菌株進行簡單染色和革蘭氏染色,并對芽胞進行染色觀察[8]。提取培養48 h的活性菌株DNA,利用細菌16S rDNA通用引物(27F/1492R)和DNA促旋酶B亞單位蛋白基因gyrB引物(UP-1S/UP-2Sr)分別對DNA進行PCR擴增[9-10]。擴增產物由北京擎科生物科技有限公司進行純化和測序。所得序列在GenBank中進行BLAST比對,并選擇已詮釋的模式菌株或可信度高的同源菌株的基因組序列,比較各菌株的16S rDNA 和gyrB序列,用MEGA 11軟件以極大似然法(maximum likelihood method, ML)構建系統發育樹,確定菌株的分類地位。

1.3 拮抗菌株發酵濾液的抑菌效果測定

用無菌接種環挑取少量拮抗菌菌體接種于牛肉膏蛋白胨固體培養基上,在32℃、180 r/min的搖床中培養48 h得種子液。取100 μL種子液接入100 mL 牛肉膏蛋白胨液體培養基，于32℃、180 r/min 下振蕩培養7 d,10 000 r/min離心10 min，吸取上清液,用0.22 μm無菌微孔濾膜過濾2次制得無菌發酵濾液。向冷卻至50℃左右未凝固的PDA培養基中分別加入無菌發酵濾液,使其濃度為2.5%、5%、10%、15%和20%(V/V),充分搖勻后制成平板,以不加發酵濾液的PDA為對照。打取6 mm哈銳炭疽菌菌落邊緣菌餅接種于平板中央,26℃下培養,待對照PDA平板中的菌絲長滿后以十字交叉法測量各處理的菌落直徑(mm),3次重復并計算菌絲生長抑制率。菌絲生長抑制率=(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100%。

1.4 拮抗菌株對八角炭疽病的離體防治效果測定

剪取健康無損傷、大小基本一致的成熟八角葉片,用流水洗凈表面塵土后用0.1%吐溫-80溶液清洗,再依次用75%乙醇和2% NaClO溶液擦拭表面進行消毒,無菌水漂洗5次后用無菌吸水紙吸干表面水珠;用無菌針尖在八角葉片上距葉脈1 cm處分別打取4個約3 mm的微創口,再用無菌濕棉球包住葉柄后放置在培養皿內備用。取100 μL拮抗菌種子液接入100 mL牛肉膏蛋白胨液體培養基中,在32℃、180 r/min下振蕩培養7 d后用無菌水稀釋獲得OD600為0.6的菌懸液,再將該菌懸液用0.22 μm無菌微孔濾膜抽濾3次得無菌發酵濾液。設置6個處理(表1)來測定拮抗菌株發酵液對八角炭疽病的離體抑制效果和安全性。

表1 拮抗菌株對八角炭疽病離體抑制效果測定處理設置

每處理設置6次重復,處理后置于25℃、自然光照條件下保濕培養。病原菌接種5 d后統計各處理葉片上病斑數量,并用十字交叉法測量各個病斑的平均直徑(D),最后計算病斑面積(mm2)和侵染抑制率(%)。病斑面積(mm2)=πD2/4,侵染抑制率=(對照組病斑面積-處理組病斑面積)/對照組病斑面積×100%。

1.5 活性菌株發酵條件研究

配制 KMB液體培養基(葡萄糖 20 g,蛋白胨 20 g,MgSO41.5 g,K2HPO41.5 g,蒸餾水 1 000 mL)[11]作為基本液體培養基,改變其中的營養成分和外界環境等發酵條件,分別進行菌株吸光度和拮抗特性的測定,用吸光度表示菌株生長情況,用抑菌圈大小表示菌株發酵液對哈銳炭疽菌的拮抗情況。

1)不同pH條件對菌株生長的影響。將基本液體培養基KMB的pH用1 mol/L HCl或NaOH分別調節為4、5、6、7、8、9、10等7個梯度,分裝于300 mL錐形瓶中,每瓶150 mL,每個梯度設置3個重復。滅菌后均加入100 μL菌株種子液,在25℃、180 r/min振蕩72 h后吸取適量的菌懸液測定600 nm處吸光度(OD600)。吸取適量上述菌懸液用0.22 μm微孔濾膜抽濾3遍,制得無菌發酵濾液;在PDA平板的上、左、右距離邊緣10 mm處各放置一個滅菌牛津杯,取100 μL無菌發酵濾液加入牛津杯中,并將1塊 6 mm 哈銳炭疽菌菌餅接種于平板中央,以加100 μL無菌水作為空白對照,接種后在25℃、自然光照條件下培養7 d后測量牛津杯周圍抑菌圈直徑(mm)。設置3次重復。

2)不同溫度條件對菌株生長的影響。除設置不同溫度外，其余試驗方法同1)。自然pH，培養溫度分別為15、20、25、30、32、35、37℃。

3)不同碳源條件對菌株生長的影響。將基本液體培養基KMB中的葡萄糖等質量替換為甘油、蔗糖、淀粉、麥芽糖、甘露醇等不同碳源,分裝于300 mL的錐形瓶中,每瓶150 mL,余下步驟與1)相同。

4)不同氮源對菌株生長的影響。將基本液體培養基KMB中的蛋白胨等質量替換為硝酸鉀、硝酸鈉、酵母粉、(NH4)2SO4、尿素等不同氮源,分裝于300 mL的錐形瓶中,每瓶150 mL,余下步驟與1)相同。

1.6 數據處理與分析

試驗數據采用DPS V7.05進行LSD多重比較。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離及篩選

從健康八角葉片內分離到8株內生細菌,與哈銳炭疽菌對峙培養中有3株抑制率達50%以上。其中編號為L0517的菌株抑菌率高達67.78%(圖1a～b)。

2.2 拮抗菌株的鑒定

2.2.1形態學鑒定

圖1 拮抗菌株 L0517 對哈銳炭疽菌的拮抗效果及菌株形態特征Fig.1 The antagonism of strain L0517 against Colletotrichum horii and its morphological characteristics

2.2.2生理生化鑒定

在氮代謝上,菌株L0517的硝酸鹽還原、尿素、硝酸鉀、磷酸二氫銨代謝陽性。碳代謝上D-葡萄糖、D-木糖、蔗糖、D-果糖、D-甘露醇、葡萄糖發酵和淀粉水解呈陽性。其他特征性反應中明膠液化、V-P試驗、卵磷脂水解試驗和過氧化氫酶反應均為陽性。甲基紅試驗及運動性測試為陰性。具有芽胞桿菌屬細菌典型的生理生化反應特征。

2.2.3分子生物學鑒定

將菌株L0517的16S rDNA和gyrB序列輸入GenBank的BLAST中進行同源性比對,下載20個詮釋菌株的兩個基因序列用MEGA 11軟件構建ML系統發育樹(圖2)。菌株L0517與貝萊斯芽胞桿菌B.velezensis、解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens和暹羅芽胞桿菌B.siamensis聚為一支,但B.amyloliquefaciens和B.siamensis獨立于B.velezensis分別獨立聚為一支,而L0517與B.velezensis無支長差異,結合形態學和生理生化特征,將菌株L0517鑒定為貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis。

圖2 基于 16S rDNA 和 gyrB 序列構建的ML 系統發育樹Fig.2 Maximum likelihood phylogenetic tree inferred from combined 16S rDNA and gyrB sequences

2.3 拮抗菌株發酵濾液抑菌活性

哈銳炭疽菌菌絲生長顯著受到菌株L0517發酵濾液的影響(圖3,表2),其菌落隨著L0517發酵濾液添加量的增大而顯著減小。發酵濾液添加量為2.5%時菌落即顯著減小,菌絲開始出現不正常腫脹或囊泡狀結構。而5%發酵濾液添加量接近對哈銳炭疽菌的抑制中濃度,當發酵濾液添加量為10%、15%和20%時,其菌絲生長抑制率分別達到74.67%、77.33%、83.67%。表明L0517菌株發酵濾液可有效抑制八角炭疽菌菌絲生長(圖3,表2)。

圖3 菌株L0517發酵濾液對哈銳炭疽菌抑制效果(a～f)及菌絲生長的影響(g～l)Fig.3 Effects of fermentation broth of strain L0517 on inhibition effect (a-f) and mycelial growth (g-l) of Colletotrichum horii

表2 菌株 L0517 發酵濾液對哈銳炭疽菌菌絲生長的影響1)

2.4 拮抗菌株對八角炭疽病的離體防治效果

離體條件下，拮抗菌L0517對八角炭疽病有顯著的預防效果(圖4,表3)。在含0.1%吐溫-80的葉片處理液中添加10%的L0517菌株發酵濾液和10%菌懸液(處理1和處理2),抑制率分別為82.5%和80.4%;僅用0.1%吐溫-80處理再接種病原菌的處理(處理4)的葉片其形成的病斑面積與對照(處理6)相比差異不顯著,說明L0517菌株發酵濾液和10%菌懸液都可顯著降低八角炭疽病病原菌的致病能力,對八角炭疽病表現出高效的預防作用。先接種病原菌,1 d后再用10% L0517發酵濾液處理葉片(處理5)后抑制率僅為4.2%,而且未能有效阻止病原菌在離體葉片傷口中擴展,說明菌株L0517對八角炭疽病治療效果不佳,使用中應重在發病前預防。菌株L0517菌懸液單獨處理傷口(處理3)未形成病斑,說明對八角葉片無致病性,安全性高。

表3 菌株 L0517對八角炭疽病的離體防治效果1)

圖4 菌株 L0517 對八角炭疽病的防治效果Fig.4 The control effect of strain L0517 against star anise anthracnose

2.5 拮抗菌株發酵條件對其生長和抑菌活性的影響

拮抗菌株 L0517在不同培養條件下的生長及其發酵濾液對哈銳炭疽菌抑菌活性的影響如圖5所示。菌株 L0517在pH為 6～7的營養液內生長良好,在 pH 為7時菌株發酵濾液抑菌活性最強(圖5a)。菌株L0517的增殖和抑菌活性受培養溫度的影響,在25℃ 時最適其生長及抑菌物質積累(圖5b)。不同碳源和氮源也對拮抗菌株 L0517的增殖和抑菌活性影響達到顯著水平。在 KMB培養基中,以麥芽糖作為碳源時菌株的OD600和抑菌圈最大,其次為蔗糖,甘露醇為碳源生長最差,甘油為碳源抑菌活性最弱(圖5c)。以酵母粉作為氮源時,菌株L0517的增殖速率和抑菌活性都最高,其次是硫酸銨和硝酸鈉,以尿素為氮源時最差(圖5d)。說明拮抗菌株 L0517生長及積累抑菌成分的最適宜pH為7,最適發酵溫度為25℃,最適的碳源和氮源分別為麥芽糖和酵母粉。

3 結論與討論

貝萊斯芽胞桿菌Bacillusvelezensis最早由Ruiz-García等于2005年從貝萊斯河(Vélez)中分離得到[12],其近緣種為死亡谷芽胞桿菌B.vallismortis和解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciens。3種細菌菌體大小、產芽胞方式和鞭毛分布都類似,難以區分,但在生理生化反應如卵磷脂水解、明膠液化和吲哚測試上都與解淀粉芽胞桿菌和死亡谷芽胞桿菌存在顯著區別[12-14]。本研究表明，貝萊斯芽胞桿菌菌株L0517可高效抑制哈銳炭疽菌對八角葉片的侵染。貝萊斯芽胞桿菌抗菌譜較廣,對很多細菌性和真菌性病害如辣椒細菌性斑點病[15]、水稻條斑病[16],魔芋軟腐病[17]、番茄灰霉病[18]、杧果炭疽病[19]和黃瓜葉斑病[20]等都具有很好的防治效果。大量研究證實貝萊斯芽胞桿菌對植物不具有致病性[21],并可用于食品工業發酵[22],對動植物安全性高。同時,貝萊斯芽胞桿菌還可促進甜菜、胡蘿卜、黃瓜、馬鈴薯和番茄等植物幼苗的生長[23],在農業領域開發潛力巨大。

本研究中,貝萊斯芽胞桿菌菌株L0517的發酵濾液可高效抑制哈銳炭疽菌菌絲生長,并引起菌絲不正常腫脹,出現囊泡狀結構,與前人研究結果一致[18]。研究表明,貝萊斯芽胞桿菌可合成桿菌抗霉素D、伊枯草菌素A和表面活性素C等高效的脂肽類抑菌成分[19],其中桿菌抗霉素D能抑制真菌細胞壁前體物質的合成,并能溶解細胞壁,導致菌絲細胞變形和破裂[24];伊枯草菌素和表面活性素可促使真菌形成小囊泡,破壞質膜正常結構,加大質膜透性和離子通道開放,導致胞內電解質和大分子物質流出而引起細胞死亡[25-26]。

圖5 不同pH、溫度、碳源、氮源對菌株 L0517 生長及抑菌活性的影響Fig.5 Effects of different pH, temperatures, carbon and nitrogen sources on the growth and antifungal activity of strain L0517

貝萊斯芽胞桿菌L0517對八角炭疽病病原菌具有高效的抑制效果,其發酵濾液中的抑菌活性物質可高效阻擋病原菌侵入八角葉片,具有潛在應用價值。下一步要開展田間試驗,以探究菌株在自然條件下的抑菌效果及在八角葉片中的定殖能力。同時要基于菌株L0517基本發酵條件設計多因素試驗進行優化,研究適于細胞快速增殖和抑菌物質積累的發酵方案,以為菌株L0517的工業化運用奠定堅實的基礎。