川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合抑菌活性研究

趙 晴, 張智蕊, 徐鳳波, 李慶山, 李 嬌

(南開大學化學學院, 元素有機化學國家重點實驗室, 天津 300071)

中草藥提取物都具有一定的抑菌功效,且利用中草藥提取物殺菌不易使植物病菌產生抗藥性,對農作物安全,可有效避免化學合成農藥造成的環境污染、農藥殘留等問題[1-2]。植物本身會產生豐富的抑菌物質,例如,萜類、生物堿類、黃酮類、苷類、皂甙、醌類、香豆素、木質素、芪類、酯類、酚類、醇類、甾類、有機酸及精油類等化合物。植物提取物對于土壤生態環境的影響較小,具有很大的開發價值和應用潛力[3-4]。川芎中含有有機酚酸類成分,其中阿魏酸、咖啡酸、綠原酸等具有廣泛的抑菌活性;穿心蓮中含有的黃酮類和二萜內酯類成分是穿心蓮主要的抑菌成分[5-6];干姜中含有的精油類成分具有抑菌、抗氧化、抗腫瘤、殺蟲等多種生物活性[7-8]。唐杰等對川芎提取物體外抑菌活性和殺蟲活性研究表明,其乙醇提取物對7種常見致病菌具有明顯的抑制作用,對油菜蚜蟲有觸殺作用[9]。羅丹等研究發現,姜精油對番茄早疫病菌Alternariasolani、番茄灰霉病菌BotrytiscinereaPers.、番茄瘡痂病菌Xanthomonascampestrispv.vesicatoria均有一定的抑制作用[10]。劉志祥等采用杯碟法對穿心蓮提取物進行體外抗菌研究,結果表明,穿心蓮提取物對金黃色葡萄球菌StaphyloccocusaureusRosenbach、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis、大腸桿菌Escherichiacoli、黑曲霉Aspergillusniger、青霉Penicillium有明顯的抑制效果[5]。之前的研究主要集中于單一中藥提取物的抑菌活性,對于多種中藥提取物組合的抑菌活性研究較少。經過文獻調研和中藥篩選,得出川芎、干姜、穿心蓮均為常用中藥,對于人體有較好的醫用功效,且3種中藥價格低廉,均具有一定的抑菌功效,故對川芎、干姜和穿心蓮分別進行提取,并進行抑菌活性測試,探究3種中藥提取物及其復配組合的抑菌功效,并對提取物進行化學成分分析和含量測定,結合文獻分析抑菌機理,篩選出效果好的中藥提取物殺菌組合用于防治植物病害。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1供試中藥

本試驗所用中藥如表1所示,其中川芎、干姜、穿心蓮均來自北京同仁堂,為中藥飲片,采購后置于4℃冰箱中保存備用。

1.1.2供試菌種

本試驗所用菌種如表2所示,5種植物真菌均由南開大學生測室提供。

1.2 方法

1.2.1中藥提取

1.2.1.1川芎提取

中藥川芎飲片用破壁機粉碎,細度約100目,在不銹鋼釜中按料液比1∶8加入90%乙醇溶液,超聲波輔助,加熱回流2 h,冷卻后離心過濾。濾渣按料液比1∶8加入90%乙醇溶液重復提取1次,合并兩次提取濾液,減壓濃縮脫除溶劑,得到醇提浸膏。

醇提浸膏加入5倍質量的水將其分散，然后加入15倍質量的乙酸乙酯萃取兩次,合并兩次萃取液,減壓脫除溶劑,干燥,得到川芎提取物。產物回收率為10.33%。

表1 供試中草藥

表2 供試真菌

1.2.1.2干姜提取

中藥干姜飲片用破壁機粉碎,細度約100目。在索氏提取器中加入料液比1∶15的石油醚,90℃索氏提取6 h,冷卻后抽濾,收集濾液,減壓脫除溶劑,得到干姜提取物。產物回收率為3.89%。

1.2.1.3穿心蓮提取

中藥穿心蓮飲片用破壁機粉碎,細度約100目。在圓底燒瓶中加入料液比1∶20的60%乙醇溶液,50℃加熱4 h,冷卻后抽濾,收集濾液,減壓脫除溶劑,得到穿心蓮提取物[11]。產物回收率為28.42%。

1.2.2抑菌效果測定

本文抑菌試驗以水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌為測試對象,采用生長速率法測定川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合的抑菌效果。具體試驗步驟如下:

將凍存菌種于室溫下復蘇,用接種針挑取少量菌落至PDA平板中心區域,封口,無光照倒置培養于溫度25℃、濕度73%的培養箱中。將川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合先分別用二甲基亞砜(DMSO)溶解,再用1‰的吐溫水分別稀釋成5 000、1 000、500 mg/L的藥液。用移液槍分別吸取1 mL藥液加入到9 mL的PDA培養基中,制成最終濃度為500、100、50 mg/L的含藥平板。水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌活化后用打孔器打取直徑4 mm菌餅,置于含藥平板內,每皿3塊呈等邊三角形擺放,每處理重復3次,以不加藥劑做空白對照。將各處理于(24±1)℃培養箱內培養72 h后測量各處理菌落擴展直徑,計算抑菌率。

抑菌率=(空白對照菌落增長直徑-藥劑處理菌落增長直徑)/空白對照菌落增長直徑×100%。

1.2.3提取物組合增效作用評價方法

采用Gowing方法[12]對殺菌劑混劑的協同增效作用進行判斷。按Gowing方程進行評價。

Cexp=C1+C2(1-C1)。

Cobs=Cexp,混劑中各組分表現獨立作用;

Cobs>Cexp,混劑中各組分表現增效作用;

Cobs

其中,Cexp為混劑對病菌抑制作用的預期水平(理論抑制率);C1和C2為單劑單獨使用時對病菌實際抑制率;Cobs為試驗測定的混劑對病菌的實際抑制率。

1.2.4色譜條件

1.2.4.1川芎提取物GC-MS條件

1) 氣相條件[13]。HP-5ms(30 mm×0.25 mm×0.25 μm);進樣量:1 μL;進樣溫度:270℃;分流比:30∶1;載氣∶He(99.999%),流量:1 mL/min;程序升溫:初始溫度50℃,以4℃/min升至260℃,保持2 min,以20℃/min升至300℃,保持5 min。

2) 質譜條件[13]。電離方式為電子電離(EI),電子能量70 eV;離子源溫度:230℃;四極桿溫度:150℃;掃描方式:全掃描;質量范圍:33～500 amu;溶劑延遲:3 min。

1.2.4.2干姜提取物GC-MS條件

1) 氣相條件[14]。HP-5ms(30 mm×0.25 mm×0.25 μm),柱溫45℃(保留2 min),以5℃/min升溫至280℃,保持2 min;氣化室溫度250℃;載氣為高純He(99.999%);柱前壓7.62 psi,載氣流量1.0 mL/min,進樣量1 μL,分流比20∶1,溶劑延遲3 min。

2) 質譜條件[14]。離子源為EI源;離子源溫度230℃;四極桿溫度150℃;電子能量70 eV;發射電流34.6 μA;倍增器電壓1 120 V;接口溫度280℃;質量范圍20～450 amu。

1.2.4.3穿心蓮提取物HPLC條件

色譜柱:ODS C18柱(150 mm×4.6 mm,5 μm);以乙腈-水(18∶82,V/V)為流動相梯度洗脫。乙腈起始濃度18%，60 min時濃度為40%,流速1 mL/min。檢測波長226 nm;進樣量20 μL[15]。

1.2.5紫外(UV)條件

1.2.5.1川芎總酚酸UV條件[16]

1)標準曲線制備。準確稱取5.00 mg阿魏酸,置于100 mL容量瓶中,加甲醇超聲溶解,制得0.05 mg/mL對照品溶液。精密吸取阿魏酸對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL,分別置25 mL容量瓶中,加甲醇至6 mL,加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL,0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶1)混合液1 mL搖勻,在暗處放置5 min,加入1 mol/L冰醋酸溶液,搖勻,暗處放置30 min,以不加阿魏酸的上述處理為空白對照,724 nm波長處測吸光度。以濃度(C)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標,繪制標準曲線。計算回歸方程為:A=0.299 29C+0.242 91,R2=0.961 91。

2)樣品測定。準確稱取川芎提取樣品0.067 82 g,置100 mL容量瓶,加甲醇超聲溶解,制得0.678 2 mg/mL樣品溶液。精密吸取樣品溶液2 mL于25 mL容量瓶中,加甲醇至6 mL,加0.3%十二烷基硫酸鈉2 mL,0.6%三氯化鐵-0.9%鐵氰化鉀(1∶1)混合液1 mL搖勻,在暗處放置5 min,加入1 mol/L冰醋酸溶液,搖勻,暗處放置30 min,724 nm波長處測吸光度,并用標準曲線的回歸方程計算總酚酸含量。

1.2.5.2穿心蓮總黃酮UV條件[11]

1)標準曲線繪制。準確稱取蘆丁標準試劑0.101 86 g,用甲醇溶解定容至100 mL,得到對照品溶液。精密吸取對照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分別置于6個10 mL容量瓶中,用甲醇補充至5 mL,各加入5%的NaNO20.5 mL,室溫放置6 min后,加入10%的Al(NO3)30.5 mL,室溫放置6 min,再加入4%的NaOH 4.0 mL,室溫放置15 min,以不加對照品溶液作為空白, 于 500 nm 處測定吸光度(A),以蘆丁濃度(C)為縱坐標,吸光度為橫坐標繪制標準曲線。得到回歸方程:C=9.053 6A-0.089 5,R2=0.983 38,線性范圍50.0～250 μg/mL。

2)樣品溶液制備及總黃酮含量測定。準確稱取穿心蓮提取物0.201 99 g,用甲醇溶解定容至50 mL,得樣品溶液。精密吸取供試品溶液5 mL于10 mL容量瓶中,加入5%的NaNO20.5 mL,室溫放置6 min,加入10%的 Al(NO3)30.5 mL,室溫放置6 min,再加入4%的NaOH 4.0 mL,室溫放置15 min,于500 nm處測定吸光度,并用標準曲線的回歸方程計算總黃酮含量。

1.2.6數據分析

所獲抑菌率原始數據經Excel初步處理后,使用SPSS 26軟件計算其平均值和標準誤,并以平均值±標準誤來表示。本試驗有兩個自變量,即提取物和提取物的濃度,本研究側重于提取物及其組合對5種植物病原真菌抑制率的影響。所以將相同濃度下不同提取物對相同病原真菌的抑制率數據導入到SPSS軟件中,采用LSD多重比較不同處理間的差異顯著性(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 提取物及其組合對5種植物病原真菌抑制作用

川芎、干姜和穿心蓮提取物及其組合對5種植物真菌的抑菌結果(表3)顯示,相同濃度下不同提取物對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌的抑制率均存在顯著差異。通過比較不同抑菌濃度,發現在 500 mg/L 時,3種提取物及其組合對5種真菌的抑制率效果顯著,部分抑制率最高達100%;比較單一提取物和提取物復配組合的抑菌活性,發現提取物組合對病原菌抑制率更高,抑菌譜更廣,其中,在1∶1(m∶m)配比下,濃度為500 mg/L時,川芎+干姜提取物對5種植物病原真菌抑制率達83%以上,川芎+穿心蓮提取物對5種植物病原真菌的抑制率達75%以上,干姜+穿心蓮提取物對除黃瓜枯萎病菌以外的4種病原菌的抑制率達88%以上。

表3 川芎、干姜、穿心蓮提取物及其組合對5種植物病原真菌的抑制作用1)

2.2 提取物組合增效作用評價結果

3種中藥提取物組合對5種植物病原真菌的增效作用評價結果見表4。在1∶1(m∶m)配比下,川芎+干姜提取物在100 mg/L時增效作用明顯,且對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌4種植物病原真菌的抑制作用較強;川芎+穿心蓮提取物在100 mg/L時,對水稻稻瘟病菌和水稻紋枯病菌的抑制作用較強且表現為增效作用;干姜+穿心蓮提取物在500 mg/L時,對5種植物病原真菌均表現為增效作用，其中對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、花生褐斑病菌的抑制作用較強。

表4 川芎、干姜、穿心蓮提取物組合對5種植物病原真菌的增效作用評價

2.3 提取物成分檢測與鑒定

2.3.1川芎提取物

2.3.1.1揮發性成分鑒定

川芎提取物經GC-MS聯用儀分析,共鑒定出5種主要的揮發性化合物(表5)。以色譜峰面積歸一法計算化學成分含量,其總離子流圖見圖1,其主要化學成分及其峰面積相對百分含量見表5。從表中可以看出川芎提取物中的化學成分主要為內酯類,其中含量最高的為藁本內酯,含量為57.21%,其次為(3s)-3-丁基-4,s-二氫-1(3H)-異苯并呋喃酮、新蛇床內酯、正丁基苯酞、3-正丁烯基苯酞,含量依次為30.50%、3.14%、2.27%、1.86%,總含量達90%以上,為川芎提取物中揮發性成分的主要組成部分。

2.3.1.2酚酸類成分含量測定

川芎提取物中含有的酚酸類如阿魏酸、咖啡酸、綠原酸均具有較好的抑菌功效,經UV分析,測得總酚酸含量為9.15%。

圖1 川芎提取物GC-MS總離子流圖Fig.1 GC-MS total ions chromatogram of Chuanxiong Rhizoma extracts

表5 川芎提取物主要化學成分

2.3.2干姜提取物成分分析鑒定

干姜提取物經GC-MS聯用儀分析,共鑒定出15種化合物(表6)。以色譜峰面積歸一法計算化學成分含量,其總離子流圖見圖2,其主要化學成分及其峰面積相對百分含量見表6。從表中可以看出干姜提取物中的化學成分主要為萜烯類、酮類、醛類、酚類,其中含量最高的4種為α-姜烯、β-倍半水芹烯、β-紅沒藥烯、α-姜黃烯,均為倍半萜類化合物,含量分別為37.90%、13.27%、12.23%、10.03%,總含量達70%以上,為干姜提取物的主要化學成分。

圖2 干姜提取物GC-MS總離子流圖Fig.2 GC-MS total ions chromatogram of Zingiberis Rhizoma extracts

表6 干姜提取物主要化學成分

2.3.3穿心蓮提取物

2.3.3.1穿心蓮內酯含量測定

穿心蓮主要抑菌成分為穿心蓮內酯和黃酮。圖3為對照品穿心蓮內酯液相色譜圖。穿心蓮提取物經HPLC分析得到的色譜圖如圖4所示,1為穿心蓮內酯峰。經計算,穿心蓮提取物中穿心蓮內酯含量為2.67%。

圖3 穿心蓮內酯對照品色譜分析Fig.3 Chromatographic analysis of andrographolide standard

2.3.3.2穿心蓮黃酮含量測定

經UV分析,測得穿心蓮提取物中總黃酮含量為4.85%。

3 結論與討論

本試驗結果表明,隨著提取物濃度的增大,在500 mg/L時,3種中藥提取物及其組合對5種真菌的抑制效果顯著,抑菌譜更廣,對部分病原菌的抑制率最高達100%;提取物組合與單一提取物相比,抑制率更高,抑菌譜更廣,其中,在1∶1(m∶m)配比下,濃度為500 mg/L時,川芎+干姜、川芎+穿心蓮提取物對5種植物病原真菌抑制率分別達83%和75%以上,干姜+穿心蓮提取物對除黃瓜枯萎病菌以外的4種植物病原真菌的抑制率達88%以上。

圖4 穿心蓮提取物色譜分析Fig.4 Chromatographic analysis of Andrographis Herba extracts

利用Growing法對3種中藥提取物復配組合進行增效拮抗作用評價,結果表明,2種中藥提取物復配具有較好的協同增效作用,其中,在1∶1(m∶m)配比下,川芎+干姜提取物在100 mg/L時對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌和花生褐斑病菌表現為增效作用;川芎+穿心蓮提取物在100 mg/L時對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌和花生褐斑病菌表現為增效作用;干姜+穿心蓮提取物在500 mg/L時對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、水稻紋枯病菌、黃瓜枯萎病菌、花生褐斑病菌表現為增效作用。

利用GC-MS、HPLC和UV對川芎、干姜和穿心蓮提取物進行成分分析和含量測定，結果表明，川芎提取物中的揮發性成分主要為內酯類,總含量達90%以上,其中含量最高的為藁本內酯,含量為57.21%,非揮發性抑菌成分酚酸類的含量為9.15%。干姜提取物中的化學成分主要為倍半萜類化合物,總含量達70%以上,其中含量最高的為α-姜烯，含量為37.90%。穿心蓮提取物中主要的抑菌成分穿心蓮內酯的含量為2.67%,黃酮的含量為4.85%。

真菌細胞壁位于細胞膜外層,具有保持營養物質、氣體和酶自由通透及避免細胞受外界高滲透壓的作用。細胞壁周圍覆蓋有脂多糖和外膜蛋白,限制疏水性化合物通過脂多糖層向胞內擴散，以減弱其對細胞膜的損害[17]。川芎酚酸類、穿心蓮黃酮苷和二氫黃酮類親水性強,親脂性差,川芎內酯類、干姜倍半萜類、穿心蓮二萜內酯類和部分黃酮類親脂性強。川芎提取物與干姜提取物或穿心蓮提取物復配組合,川芎提取物中親水性的酚酸類成分可破壞由多糖構成的細胞壁結構,增大細胞壁的通透性,使親脂性的川芎內酯類、干姜倍半萜類或穿心蓮二萜內酯類和部分黃酮類成分順利通過細胞壁,利用親脂性破壞細胞膜,使細胞內容物滲出,導致菌體死亡,從而達到協同增效的作用。試驗結果證明,川芎提取物同干姜提取物或穿心蓮提取物等親脂性提取物進行復配時在100 μg/mL時就能夠起到很好的增效作用。

而當穿心蓮提取物同干姜提取物進行復配時,濃度在500 μg/mL時才能達到較好的增效作用,抑菌機理可能是親脂性的主要為干姜倍半萜類和穿心蓮二萜內酯類,而穿心蓮黃酮類化合物中的黃酮苷、二氫黃酮類具有一定親水性,但是含量較低,需要較高的濃度才能對菌體產生作用。

川芎、干姜和穿心蓮提取物兩兩復配,抑菌率和抑菌廣譜性均優于單一提取物,并表現出優越的協同增效作用,為植物源殺菌劑的開發提供了較好的理論依據。