葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)監(jiān)測(cè)苗期小麥白粉病初探

單鼎城, 趙亞男, 張美惠, 馬明慧, 韓志國(guó), 劉 偉*,范潔茹*, 袁軍海, 周益林

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193; 2. 河北北方學(xué)院農(nóng)林科技學(xué)院, 張家口 075000; 3. 慧諾瑞德(北京)科技有限公司, 慧諾表型實(shí)驗(yàn)室, 北京 100096)

小麥白粉病是由禾布氏白粉菌小麥專化型Blumeriagraminisf.sp.tritici引起的氣傳性病害,當(dāng)小麥葉片受到白粉菌侵染后,葉綠素含量會(huì)顯著下降,且感病后不同時(shí)間和嚴(yán)重度下葉綠素含量的變化有所不同[1-2]。因此,通過(guò)葉片中葉綠素含量的變化可以了解植物所受病害脅迫的程度。但傳統(tǒng)上,葉綠素含量的測(cè)量主要采用紫外分光光度法,該方法操作繁瑣,而葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可以直接、快速地通過(guò)葉綠素?zé)晒夥从吵鋈~綠素的變化,以此作為生物脅迫檢測(cè)的依據(jù)。近年來(lái),隨著葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定和成像技術(shù)的進(jìn)步,尤其是葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)的開(kāi)發(fā),提出了一種從宏觀上獲取植物熒光的方式,在獲取熒光參數(shù)的同時(shí)也獲得了快速、直觀和精確的圖像信息,這使得葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)克服了傳統(tǒng)熒光儀有限點(diǎn)測(cè)量的缺點(diǎn),因而逐漸被廣泛應(yīng)用。陳兵等[3]對(duì)棉花黃萎病(Verticillium wilt)脅迫下的棉花葉片進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈾z測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)利用葉綠素?zé)晒獗O(jiān)測(cè)棉花黃萎病是可行的;許培磊等[4]的研究發(fā)現(xiàn),葡萄霜霉病菌Plasmoparaviticola侵染離體山葡萄Vitisamurensis葉片后3 d,其光系統(tǒng)活性就發(fā)生了顯著變化;Mandal等[5]利用葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),輕度感染霜霉病與重度染病的圓苞車前Plantagoovata葉片的Fv/Fm值相較于健康葉片分別降低了24.39%和44.90%。已有研究發(fā)現(xiàn),利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)可以實(shí)現(xiàn)煙草感染辣椒輕斑駁病毒(pepper mild mottle virus)或感染黃瓜炭疽菌Colletotrichumorbiculare后感病程度檢測(cè)[6-7];Cen等[8]利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對(duì)感染黃龍病菌CandidatusLiberibacter的柑橘葉片進(jìn)行診斷,診斷準(zhǔn)確率最高可達(dá)97%;Bauriegel等[9-10]利用葉綠素?zé)晒鈭D像技術(shù)分析了受黃色鐮孢Fusariumculmorum侵染后的麥穗損害程度和病害分布情況。這些研究均表明,利用葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)植物病害脅迫是可行的。

在小麥白粉病方面,利用激光誘導(dǎo)葉綠素?zé)晒?laser-induced chlorophyll fluorescence)監(jiān)測(cè)小麥葉片受白粉病侵染的程度已有研究報(bào)道[11],而葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在小麥白粉病監(jiān)測(cè)研究中鮮有報(bào)道。為了探究葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在小麥白粉病監(jiān)測(cè)中的可行性,本研究在室內(nèi)對(duì)接種6個(gè)不同濃度的小麥白粉病菌分生孢子的小麥離體葉段、一葉一心幼苗及二葉一心幼苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒鉁y(cè)定,初步明確圖像以及圖像參數(shù)與病情嚴(yán)重度之間的關(guān)系,為該技術(shù)在小麥白粉病監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試小麥品種為‘京雙16’(高感小麥白粉病)。小麥白粉病菌菌株為混合菌株,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所小麥白粉病組提供;多功能植物光合表型測(cè)量系統(tǒng)PlantExplorerPro(荷蘭PhenoVation公司)由慧諾表型實(shí)驗(yàn)室提供。

PlantExplorerPro儀器相關(guān)參數(shù)分別為:相機(jī)傳感器類型為CCD,相機(jī)分辨率為130萬(wàn)像素,單張葉綠素?zé)晒鈭D像獲取時(shí)間為20～1 000 μs,激發(fā)光強(qiáng)度在25 cm處為1 500～6 000 μmol/(m2·s),在60 cm處為800～3 500 μmol/(m2·s),且強(qiáng)度可調(diào)。成像面積為40 cm×53 cm。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1試驗(yàn)設(shè)置和接菌濃度梯度處理

本試驗(yàn)分別選取小麥幼苗期離體葉段、一葉一心期幼苗、兩葉一心期幼苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上癖O(jiān)測(cè)。各時(shí)期小麥培養(yǎng)條件基本一致。各時(shí)期小麥均在(18±1)℃,光周期L∥D=16 h∥8 h條件下的溫室或培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

小麥幼苗離體葉段的準(zhǔn)備:將‘京雙16’小麥品種種植在用玻璃罩罩起的塑料盆內(nèi)(防止污染),待小麥第1葉完全展開(kāi)時(shí),在無(wú)菌條件下將葉片剪成長(zhǎng)約4 cm的葉段,整齊擺放入10 cm×10 cm方形培養(yǎng)皿中的水瓊脂培養(yǎng)基上,每皿15個(gè)葉段。

一葉一心期和兩葉一心期小麥幼苗的準(zhǔn)備:將‘京雙16’小麥品種種植在用玻璃罩罩起的塑料盆內(nèi),每盆按照“一”字形種10株麥苗,待小麥苗長(zhǎng)至一葉一心及兩葉一心時(shí)備用。

孢子懸浮液的準(zhǔn)備:將新鮮的重為4、8、12、16 mg 和20 mg的孢子粉分別置于噴壺中,倒入4 mL 電子氟化液,渦旋振蕩15 s,混勻后進(jìn)行噴霧接種。

接菌處理:各處理均設(shè)置6個(gè)濃度的白粉病菌分生孢子懸浮液,用電子氟化液配制的0(對(duì)照)、1、2、3、4、5 mg/mL的小麥白粉病菌分生孢子懸浮液,其中離體葉段上每個(gè)接菌濃度設(shè)置4個(gè)重復(fù)(4皿),一葉一心、兩葉一心期小麥苗上每濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)(3盆),每個(gè)重復(fù)噴3 mL分生孢子懸浮液,在無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)按濃度梯度由低到高接菌,然后將各處理隨機(jī)排列置于(18±1)℃培養(yǎng)箱或溫室內(nèi)培養(yǎng)。

病害調(diào)查:在進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駲z測(cè)的當(dāng)天,逐個(gè)對(duì)葉片進(jìn)行白粉病發(fā)病情況調(diào)查,按病斑面積占葉片面積的百分率記錄嚴(yán)重度(0～100%),并計(jì)算每個(gè)濃度處理的平均嚴(yán)重度。

1.2.2葉綠素?zé)晒鈭D像采集和處理

分別于接菌后的第3、5、7天和第9天利用PlantExplorerPro多功能植物光合表型測(cè)量系統(tǒng)對(duì)不同時(shí)期以及接種不同濃度病菌分生孢子的小麥離體葉段或幼苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒獬上駲z測(cè)(為了減少干擾,提高測(cè)量的準(zhǔn)確性,盛放參試材料的托臺(tái)均用黑色幕布包裹),開(kāi)始檢測(cè)之前,參試材料需在無(wú)光的植物測(cè)量室內(nèi)暗適應(yīng)20 min,測(cè)量結(jié)束后文件保存為DAT文件格式。

利用PlantExplorerPro系統(tǒng)自帶的Data Analysis Software分析軟件對(duì)相應(yīng)的圖像進(jìn)行分析,首先利用Mask功能將不發(fā)葉綠素?zé)晒獾谋尘叭コ?主要是將小麥離體葉段的培養(yǎng)皿、一葉一心幼苗和二葉一心幼苗的盆以及背景雜物全部隱去,只在圖像中留下清晰的離體葉段或麥苗。然后利用ROI模塊將植物圖像進(jìn)行分割,分別導(dǎo)出分割圖像或者全圖像的葉綠素?zé)晒鈭D像參數(shù)。通過(guò)Data Analysis Software數(shù)據(jù)分析軟件分析處理可以得到暗適應(yīng)下最大光化學(xué)量子產(chǎn)量(Fv/Fm)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)、葉綠素指數(shù)(Chlidx)等4個(gè)參數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

病菌分生孢子不同接種濃度梯度下小麥離體葉段、一葉一心幼苗、二葉一心幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的多因子方差分析和差異顯著性分析分別采用SAS(9.4)軟件的PROC GLM和PROC ANOVA模塊完成。接種后第5、7、9天的離體葉段、一葉一心期幼苗、二葉一心期幼苗的小麥白粉病病情嚴(yán)重度與其對(duì)應(yīng)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)值之間的相關(guān)性分析采用SAS軟件的PROC CORR模塊完成。利用SAS軟件的PROC REG模塊建立不同時(shí)期下基于Fv/Fm和Chlidx的小麥白粉病嚴(yán)重度估計(jì)模型,并利用決定系數(shù)(R2)和均方根誤差(RMSE)來(lái)檢驗(yàn)擬合程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 白粉病菌分生孢子不同接種濃度下小麥離體葉段的葉綠素?zé)晒鈭D像變化

在接種白粉病菌分生孢子后的第3、5、7、9天對(duì)小麥離體葉段進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈭D像采集,獲取Fv/Fm圖像(圖1)。Fv/Fm圖像中的熒光信息分布比較均勻,1 mg/mL分生孢子的接菌處理隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有明顯的差異,表明在病菌分生孢子濃度低時(shí),離體葉段的熒光強(qiáng)度保持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的范圍;而2～5 mg/mL分生孢子處理的Fv/Fm熒光信息在小麥白粉病顯癥之前(接菌后第3天),染病葉段的葉表面Fv/Fm熒光信息變化相對(duì)較小;Fv/Fm在顯癥初期(接菌后第5天)開(kāi)始變化,且在接菌后第7天和第9天(此時(shí)葉片已明顯出現(xiàn)癥狀)表現(xiàn)出一定的差異,尤其是在病斑侵染嚴(yán)重的區(qū)域,熒光信息顯示為紅色,染病葉段的Fv/Fm圖像強(qiáng)度分布會(huì)隨著發(fā)病程度的增加而出現(xiàn)明顯紅色加深的變化。

圖1 接種不同濃度白粉菌分生孢子后小麥離體葉段的Fv/Fm圖像Fig.1 Fv/Fm-images of detached leaf segments of wheat inoculated with Blumeria graminis f.sp. tritici (Bgt) spores with different concentrations

2.2 小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期和白粉病菌分生孢子不同接種濃度梯度下Fv/Fm的比較

對(duì)不同接種濃度下小麥離體葉段、一葉一心幼苗、二葉一心幼苗的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的多因子方差分析結(jié)果表明,分生孢子濃度對(duì)Fv/Fm值的影響均達(dá)極顯著水平(P<0.01);接種后天數(shù)僅對(duì)小麥幼苗離體葉段Fv/Fm有顯著影響,而對(duì)一葉一心幼苗和兩葉一心幼苗的Fv/Fm無(wú)顯著影響;接種濃度和接種后天數(shù)兩因子交互作用對(duì)離體葉段和一葉一心幼苗Fv/Fm無(wú)顯著影響,而對(duì)兩葉一心幼苗Fv/Fm影響達(dá)到顯著水平(表1)。

接種白粉病菌分生孢子后的第3天時(shí),離體葉段、一葉一心幼苗以及兩葉一心幼苗的Fv/Fm值隨接種濃度的變化規(guī)律均不明顯,而在接種后第5、7和9天時(shí),在3個(gè)時(shí)期下Fv/Fm值均隨接種濃度的增加而下降(圖2)。

通過(guò)對(duì)離體葉段、一葉一心幼苗、二葉一心幼苗在不同接菌濃度下第5、7、9天時(shí)的熒光參數(shù)Fv/Fm的差異顯著性分析發(fā)現(xiàn),分生孢子濃度對(duì)不同時(shí)期小麥葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值有一定影響,除一葉一心幼苗用1～2 mg/mL孢子懸浮液處理時(shí)其Fv/Fm值與未接種對(duì)照處理沒(méi)有顯著差異外,其他處理的Fv/Fm值均顯著低于對(duì)照(表2)。

表1 小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期和白粉病菌不同接菌濃度下Fv/Fm的多因子方差分析1)

表2 接種不同濃度白粉病菌分生孢子條件下葉綠素的Fv/Fm1)

圖2 接種不同濃度白粉病菌分生孢子后不同天數(shù)的Fv/Fm箱線圖Fig.2 Fv/Fm boxplot of different days after inoculation with different concentrations of Blumeria graminis f.sp. tritici spores

2.3 小麥白粉病病情嚴(yán)重度與熒光參數(shù)的相關(guān)性

通過(guò)分析接種后第5、7、9天的離體葉段、一葉一心幼苗、二葉一心幼苗的小麥白粉病病情嚴(yán)重度與其對(duì)應(yīng)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)值(表3)的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Fv/Fm、Chlidx隨接菌濃度的升高有逐漸降低趨勢(shì);而接菌濃度越高,病情嚴(yán)重度越大;qP和NPQ隨接菌濃度變化規(guī)律不明顯。

進(jìn)一步對(duì)小麥白粉病病情嚴(yán)重度與其對(duì)應(yīng)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的相關(guān)性(表4)分析可以看出,所選葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和Chlidx與病情嚴(yán)重度之間均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,且兩個(gè)參數(shù)在離體葉段和一葉一心幼苗期與病情嚴(yán)重度之間的相關(guān)系數(shù)明顯高于兩葉一心幼苗期。qP在離體葉段和兩葉一心期與病情嚴(yán)重度顯著負(fù)相關(guān),而在一葉一心幼苗期與病情嚴(yán)重度未達(dá)到顯著相關(guān)性。

2.4 小麥白粉病病情嚴(yán)重度與葉綠素?zé)晒鈪?shù)的關(guān)系模型

在相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上,選取接種后第5、7、9天的葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和Chlidx,分別建立不同時(shí)期下基于Fv/Fm和Chlidx的小麥白粉病嚴(yán)重度估計(jì)模型(表5)。結(jié)果可以看出,兩個(gè)參數(shù)在離體葉段、一葉一心幼苗期、兩葉一心幼苗期所建模型擬合效果均達(dá)到極顯著水平(P<0.01),但在兩葉一心幼苗期所建模型擬合效果相較離體葉段和一葉一心幼苗期所建模型略差。

通過(guò)對(duì)基于兩個(gè)參數(shù)所建模型擬合效果(圖3)比較發(fā)現(xiàn),在同一時(shí)期基于葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm或Chlidx所建模型的擬合度相似,所建病害估計(jì)模型的R2基本相等,且同一時(shí)期分別基于Fv/Fm和Chlidx所建模型的理論值和實(shí)際觀察值之間的均方根誤差(RMSE)比較接近,因此,葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm或者Chlidx用來(lái)估計(jì)苗期小麥白粉病病情發(fā)生情況是可行的。

表3 小麥不同生長(zhǎng)時(shí)期和不同接菌濃度下小麥白粉病病情嚴(yán)重度及熒光圖像參數(shù)的動(dòng)態(tài)變化1)

表4 小麥白粉病病情嚴(yán)重度與葉綠素?zé)晒鈪?shù)之間的相關(guān)關(guān)系1)

3 結(jié)論與討論

葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)是一種快速、無(wú)損傷研究植物逆境光合生理的理想方法,已有的研究表明,病害脅迫可以降低棉花[3]、山葡萄[4]、煙草[12]等植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm值。本研究中,小麥葉片受到白粉病菌侵染后其Fv/Fm圖像顏色分布會(huì)隨著病害侵染程度的加重而發(fā)生改變,且Fv/Fm值顯著低于未接菌葉片,這表明利用葉綠素?zé)晒鈭D像參數(shù)來(lái)監(jiān)測(cè)小麥白粉病的嚴(yán)重程度是可行的。

小麥白粉病病情嚴(yán)重度與葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm和Chlidx之間均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,這是因?yàn)榘追鄄【那秩緯?huì)造成小麥葉片葉綠素含量的下降[1],從而導(dǎo)致Chlidx的下降;已有研究發(fā)現(xiàn),病菌的侵染會(huì)使PSⅡ(光系統(tǒng)Ⅱ)受到傷害,造成葉片PSⅡ潛在活性中心受損,光合電子由PSⅡ反應(yīng)中心向電子受體A、B及質(zhì)體醌庫(kù)的傳遞過(guò)程受到很大的影響,從而表現(xiàn)為Fv/Fm值降低[3, 7]。兩個(gè)參數(shù)在離體葉段和一葉一心幼苗期與病情嚴(yán)重度的相關(guān)系數(shù)明顯高于兩葉一心幼苗期,這可能是因?yàn)閮扇~一心麥苗葉片相對(duì)較長(zhǎng),且第2葉與第1葉有一定的重疊或者遮擋,從而產(chǎn)生干擾所致。進(jìn)一步通過(guò)對(duì)Fv/Fm與Chlidx參數(shù)所建模型擬合效果比較發(fā)現(xiàn),所建病害估計(jì)模型的R2基本一致,因此,葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm或者Chlidx用來(lái)估計(jì)小麥苗期白粉病病情發(fā)生情況具有一定的應(yīng)用前景。

葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)在研究植物病害脅迫以及在病害檢測(cè)和監(jiān)測(cè)方面具有巨大的應(yīng)用潛力,與傳統(tǒng)的人工調(diào)查等病害診斷方法相比,葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)具有快速、客觀、無(wú)損傷等特點(diǎn),而且可以早期檢測(cè)到病菌的侵染及程度。本研究發(fā)現(xiàn),在接菌后第3天進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)時(shí)Fv/Fm值變化不明顯,而在接菌后第5天(開(kāi)始顯癥期)時(shí)Fv/Fm值表現(xiàn)出隨接菌濃度的增加而下降的趨勢(shì),表明葉綠素?zé)晒獬上窦夹g(shù)對(duì)于還未顯癥，尚處于潛育期的小麥白粉病菌可能也有一定的檢測(cè)能力,但具體在病菌侵染后第幾天可以檢測(cè)到以及檢測(cè)能力的大小,還有待于進(jìn)一步研究。