噴施誘導的基因沉默(SIGS)技術控制植物病害研究進展

陳夕軍, 石 童, 陳 宸, 唐 滔

(揚州大學園藝與植物保護學院, 揚州 225009)

在自然情況下,生態系統是一個動態、復雜的系統,其演替至頂級后能實現自我更新并能維持自身功能處于較高水平和較小波動的狀態[1]。但當某些干擾超過其承受閾值時,生態系統的結構和功能就會發生變化[2]。農業生態系統是受到人類強烈干預的自然經濟復合生態系統,不同于自然系統的是,農業生態系統是以農業產出的物質和服務為基礎的[3-4]。片面地追求農產品的產量與品質,使得遺傳背景相似的高產品種、高肥密植的栽培措施、防治對象廣譜的化學藥劑等被廣泛應用。農作物病害的發生、病原菌的抗藥性、環境的污染等也越來越嚴重[5-10]。近年來,研究者們開始尋求一些綠色的農作物病害防控措施,如抗性品種、生物源誘抗物質、生防菌劑和轉基因技術等的應用[11-14]。但由于傳統的抗性育種花費時間長,獲得的品種易因病菌變異失去抗性[15-16];作物對某些病菌的抗性僅由數量性狀基因控制,生產上無高抗或免疫的種質資源[17];生物源誘抗物質雖可提高植物內稟抗性,但對病害防效較低[18-19];生防菌劑的防效易受環境影響,持效期較短[20-22];很多植物不能進行遺傳轉化,以及人們對轉基因農產品的接受程度和倫理[23-24]等原因,這些措施的運用均受到一定程度的限制。因此,亟須發展高效、可持續、對環境友好的病害防治方法,以符合人們對高產優質農產品的需求。噴霧誘導的基因沉默技術因其專一性、高效性、不需要轉基因和對環境友好等特性,展示出良好的應用前景。

1 SIGS技術的由來

1998年,Fire等[25]首次發現外源雙鏈RNA(double-stranded,dsRNA)可根據同源性促發對相應基因活性的抑制;且小RNA(small RNAs,sRNAs)作為一類新的調節分子可通過RNA干擾(RNA interference,RNAi)來沉默相關基因,從而抑制該基因的功能[26-27]。這些外源RNA沉默分子均源自外源基因的轉入、病毒、類病毒和轉座子,并通過核酸酶和向導RNA(guide RNA,gRNA)的作用進行轉錄后修飾[28]。在此研究基礎上,病毒誘導的基因沉默(virus-induced gene silencing,VIGS)、寄主誘導的基因沉默(host-induced gene silencing,HIGS)和絲狀生物誘導的基因沉默(filamentous organism-induced gene silencing,FIGS)等技術很快被建立,并用于植物病害的防控[28-31]。但這些技術均建立于基因工程基礎之上,而許多植物或病原真菌很難被進行遺傳操作,再加上許多國家對轉基因產品的接受程度較低,這些轉基因方法的廣泛適用性一直備受質疑。因此,非轉基因方法也一直是人們尋求的目標。

一直以來,人們普遍認為,由于病原真菌和寄主植物的基因組及RNA分別被兩套質膜和細胞外基質分開,侵染植物的病原真菌不可能在與寄主的互作中發揮RNA沉默作用,反之植物體也不可能通過與病原菌互作而沉默其相關基因[28]。但越來越多的研究表明,寄主植物和病原真菌之間可以利用RNA沉默機制來相互影響,病毒、sRNAs和dsRNA等均可在病原真菌與寄主之間進行跨界傳播[32-34],這種跨界傳播的基因沉默信號使RNAi和sRNAs在寄主-病原真菌通信中發揮重要作用[35-36]。但這些也僅是在寄主與病原物互作過程中通過特殊途徑進行RNA的轉運。直到最近才有研究表明,真菌可以像線蟲、昆蟲一樣從環境中吸收dsRNA[37-39]。Koch等[39]通過在大麥表面噴施靶向禾谷鐮孢Fusariumgraminearum細胞色素P450羊毛甾醇C-14α-甲基化酶的長鏈非編碼dsRNA(791 ntCYP3-dsRNA),然后接種病原菌,病菌中的CYP51A、CYP51B和CYP51C基因表達量明顯下調,病菌的生長顯著受到抑制,病害嚴重程度降低,該技術被稱為噴施誘導的基因沉默(spray-induced gene silencing),簡稱SIGS。

2 SIGS在植物病害防治中的應用

作為一種新型的植物病害防控技術,SIGS已被用于多種植物病害的治理研究,并展示出良好的應用前景(表1)。將根據灰葡萄孢Botrytiscinerea核酸內切酶基因Bc-DCL1和Bc-DCL2序列體外合成的Bc-DCL1/2-sRNAs和Bc-DCL1/2-dsRNA分別噴施于番茄、草莓、葡萄、萵苣、洋蔥和玫瑰的果實、葉片或花的表面,能減少寄主中病菌量的積累,并減小病斑面積[23]。將灰葡萄孢BcCYP51、Bcchs1和BcFE2基因經重疊PCR產生的長鏈dsRNA噴施于葡萄葉片、果實或經葉柄吸收,均能顯著減輕病害的發生[40]。以靶向核盤菌Sclerotiniasclerotiorum中編碼tRNA酰胺連接酶和硫氧還蛋白還原酶基因的dsRNA處理病菌,48 h后靶基因表達量下降50%左右;油菜葉面噴施該dsRNA后接種病原菌,病斑面積最多可減小85%[41]。分別以致病疫霉Phytophthorainfestans的鳥嘌呤核苷酸結合G蛋白β-亞基PiGPB1基因、吸器膜蛋白PiHmp1基因、角質酶PiCut3基因和內切1,3(4)-β-葡聚糖酶PiEndo3基因為靶標,將體外合成的dsRNA噴施于馬鈴薯葉片后,dsRNAPiGPB1強烈抑制病菌孢子的形成;dsRNAPiEndo3和dsRNAPiCut3雖不能完全抑制孢子的產生,但處理葉片上的孢子量明顯較低;4種dsRNA均能使致病疫霉在馬鈴薯葉片上導致的病斑面積變小[42]。以靶向大豆銹病病菌Phakopsporapachyrhizi乙酰輔酶A酰基轉移酶基因ATC、核糖體蛋白S16基因RP_S16和甘氨酸裂解系統H蛋白基因GCS_H的dsRNA噴施于離體大豆葉片表面,可使葉面孢子堆數減少73%，葉片中菌量減少75%,有效控制了大豆銹病的發生[43]。

除被用于絲狀生物引起的植物病害的防控,dsRNA還被應用于防治病毒病。將靶向煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus, TMV)p126和CP基因的dsRNA外源噴施于煙草葉片表面,3 d后,只接種TMV的植株中80%以上的植株出現脈明和褪綠斑,而TMV/dsRNA_p126和TMV/dsRNA_CP處理株則無癥狀;10 d后,所有只接種TMV的植株均表現嚴重花葉癥狀,而TMV/dsRNA_p126和TMV/dsRNA_CP處理株的病株率僅為35%和50%,且這種效果可持續20 d以上[57]。

表1 SIGS在植物病害控制領域的研究進展

3 影響SIGS對病害防控效果的因素

3.1 病原菌攝取環境dsRNA的能力

病原菌可以攝取環境中的dsRNA是利用SIGS進行病害控制的基礎,但不同病原菌從環境中攝取dsRNA的能力是不同的。Qiao等[44]以熒光素標記的YFP-dsRNA分別處理常見病原真菌灰葡萄孢、核盤菌、黑曲霉Aspergillusniger、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、大麗輪枝菌Verticilliumdahliae、膠孢炭疽菌Colletotrichumgloeosporioides和病原卵菌致病疫霉,以及非致病真菌綠色木霉Trichodermavirens,結果發現雖然灰葡萄孢、核盤菌、黑曲霉、立枯絲核菌等均能很好地從環境中攝入dsRNA,但綠色木霉攝入dsRNA的量很少,而膠孢炭疽菌中根本檢測不到。進一步研究發現,可以攝入外源dsRNA的病菌,在使用靶向致病基因的dsRNA處理后,其致病性均明顯減輕[39-41, 44]。致病疫霉從外源環境中攝入dsRNA的效率比較低,因此外源噴施不同致病基因的dsRNA對致病疫霉在馬鈴薯葉片上的生長發育和病斑的擴展均無抑制作用[44]。

有趣的是,關于致病疫霉從環境中攝取dsRNA,Kalyandurg等[42]的研究結果與Qiao等[44]的結論完全相反。Kalyandurg等[42]首先將GFP基因轉入致病疫霉,然后用以青色素3-UTP標記的dsRNAGFP(Cy3-dsRNAGFP)和根據MEGAscript試劑盒中對照模板合成的dsRNA(Cy3-dsRNACt)處理轉化的菌株孢子囊,24 h后Cy3-dsRNAGFP處理的致病疫霉孢子囊中GFP熒光減弱,而對照組無變化;將20 ng/μL的Cy3-dsRNACt噴施在馬鈴薯離體葉片表面,24 h后接種轉化GFP標記的致病疫霉孢子懸浮液,5 d后病部致病疫霉的菌絲和孢子囊中GFP和Cy3-dsRNACt呈共定位,說明外源的Cy3-dsRNACt可以通過噴施在馬鈴薯葉片表面而被致病疫霉吸收。兩者研究結果的不同是因為選用了不同的菌株,還是由于其他原因,還有待進一步研究。

3.2 不同dsRNA片段的沉默效應

SIGS防控植物病害的基本原理是通過吸收環境中的dsRNA或sRNAs,沉默病菌生長發育或致病相關基因,從而減輕病害的發生。dsRNA可通過2種途徑進入病菌體內:一是外源dsRNA先進入植物細胞,然后由植物細胞轉運至病菌體內,并被植物或病菌體內的DCL(dicer-like)蛋白剪切成sRNAs;另一種是dsRNA直接進入病菌體內,并由病菌DCL蛋白切割,形成sRNAs[23,39,44]。無論哪種途徑,最終起作用的均為sRNAs,而sRNAs對mRNA的結合部位堿基有偏好性,GC含量較低的mRNA被沉默效果較好,而且靶RNA的剪切位點主要是由gRNA的5′端序列決定的,因此源自不同dsRNA片段的sRNAs引起的沉默效應是不同的[45-47]。將亞洲鐮孢F.asiaticum肌球蛋白5基因Myo5不同區段的cDNA序列構建至干涉載體,雖然多數陽性轉化子呈現生長速率變慢、對滲透壓更敏感、分生孢子分隔變少、液泡數量增加、細胞壁幾丁質含量降低、無性和有性繁殖體數量變少、致病能力變弱等變化,但部分轉化子的所有性狀與野生型菌株相比并無顯著差異[48]。

禾谷鐮孢CYP51基因簇包含3個基因,分別為FgCYP51A、FgCYP51B和FgCYP51C,將分別靶向單基因、雙基因和三基因的dsRNA CYP-A、CYP-B、CYP-C、CYP-AB、CYP-AC、CYP-BC和CYP3RNA噴施于大麥葉片表面,發現靶向3個基因的CYP3RNA可減少病部面積達93%,效果遠好于靶向單個和2個基因的dsRNA[49]。即使靶向單個基因,250 bp的dsRNA的沉默效果均在60%以下,而800 bp的dsRNA沉默效果在80%以上[50]。而一般認為,RNAi片段的長度在98～853 bp之間都是可行的,不會對沉默效率產生影響[51]。因此,在進行SIGS防治植物病害過程中,可以在允許范圍內,以多個致病相關基因為靶標,合成靶向多個基因的dsRNA,以取得更好的防病效果。Qiao等[44]分別以多種真菌的液泡分揀蛋白51基因VPS51、動力蛋白激活蛋白基因DCTN1和肌動蛋白抑制子基因SAC1為靶標,經重疊PCR并構建至T7啟動子進行體外轉錄得到靶向多基因的dsRNA,噴施到植物葉片表面或進行蘸根處理,除不能攝取環境中dsRNA的膠孢炭疽菌與致病疫霉外,其他幾種病菌的致病性均受到顯著抑制。

3.3 dsRNA的穩定性及對病害控制的持效性

SIGS是通過外源噴施dsRNA誘導與病菌生長發育和致病相關的基因沉默,從而降低病菌致病性。dsRNA雖不像單鏈RNA(single-stranded,ssRNA)那樣極易被降解,但由于病原菌體內外環境中存在大量RNA酶,可能使dsRNA失去活性。特別是在田間條件下,紫外線照射、雨水沖刷和微生物降解等,更是其降解和失活的主要原因[58-59]。有研究表明,具有殺蟲活性的DvSnf7 dsRNA在土壤中被降解50%的時間小于30 h,被降解95%的時間小于35 h,而且其降解動力學不受初始施用濃度的影響[60]。盡管在無菌水中dsRNA相對穩定,但在自然水系中,dsRNA極不穩定,水系中有或無沉淀物其被降解50%的時間均小于6 d[61]。關于dsRNA施用于植物表面防控植物病害,目前的報道表明, 在dsRNA處理后的幾個小時內接種相應的病原菌,可明顯減輕病害嚴重度,若dsRNA處理與接種病菌的間隔時間延長,則病害防控效率降低[39-44]。Mitter等[24]研究發現,利用裸露的CMV2b-dsRNA處理豇豆和煙草葉片,5 d后接種CMV,其對病害防效顯著,若20 d后接種,則完全失去作用;但用納米黏土片作載體,因納米黏土片可很好地保護dsRNA不被降解,20 d后接種,其防病效果依然可達68%。Song等[48]也發現,如果不能持續的供應dsRNA,沉默效應僅僅只能持續9 h;但若噴施于植物表面的dsRNA被植物細胞吸收,則其持續效應較長。

至于為何dsRNA處理葉片要比直接處理病菌沉默效果持續時間更長,Song等[48]進一步研究發現,靶向真菌致病基因的dsRNA被植物細胞吸收后,可以在植物體內被轉運,并在植物體內被切割成18～27 bp的sRNAs,轉移進病菌細胞;同時植物還可利用自身的依賴RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRP)以dsRNA核酸鏈為模板進行擴增,產生大量二次擴增的dsRNA產物,并轉移至病菌細胞內,從而維持較長時間的基因沉默效應。

除上述因素外,由于不同基因對病菌致病力影響不同,因此針對不同靶基因設計的dsRNA噴施后對病害的防控效果亦會有顯著差異。而對病菌如何攝取外源dsRNA和dsRNA在寄主-病原菌間如何相互轉運并產生作用的分子機制不明,成熟地應用外源dsRNA防控植物病害的技術還未研發,這些均影響到SIGS在田間的應用及其防效。

4 有關SIGS應用的未來研究方向

如前所述,不同病原菌對外源dsRNA的攝取能力是不同的,但至目前為止,有關病原真菌如何攝取外源dsRNA還未有報道。Koch等[52]研究發現,在HIGS過程中植物細胞的囊泡系統起到關鍵作用,在植物的胞外囊泡和非原質體液中均能檢測到靶基因dsRNA源的小分子干擾RNA(small interfering RNA,siRNA);轉化所需的核內體分選復合物Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport Ⅲ,ESCRT-Ⅲ)突變后HIGS效應受損,進一步說明了內源囊泡運輸支持轉基因來源的siRNA在植物細胞和病原真菌細胞間的轉移。但植物體外囊泡和非原質體液中的dsRNA,以及直接用dsRNA處理真菌菌絲、孢子時,dsRNA是如何進入真菌細胞的還完全未知,明確真菌攝入dsRNA機制及真菌攝取dsRNA能力差異的原因,是未來研究的方向之一。

由于存在紫外線、化學物質和RNA酶等,裸露的dsRNA在自然環境中并不穩定,為了提高SIGS的應用效果,必須延緩用于SIGS的dsRNA在自然界中的降解速度。對于化學農藥來說,一些表面活性劑、助劑、無機鹽和長效緩釋添加劑等均有增加農藥在植物表面的滯留量、延長滯留時間和提高對作物表面穿透的能力。而對于dsRNA,已有研究表明,選用納米黏土片層作為載體可以有效延長dsRNA的SIGS效應[24]。但是否有其他方法或加入某些助劑可有效保護dsRNA的穩定性、延長SIGS的效應,還未見報道。

RNAi的沉默效應與起始dsRNA的濃度有關,雖然起始dsRNA的濃度在1.5～100 nmol/L間產生的沉默效果相似,但當起始dsRNA濃度低至0.05 nmol/L時,沉默效應完全消失[53]。在進行SIGS技術應用時,真菌攝取dsRNA的能力、植物中dsRNA向真菌中轉移的能力、初始dsRNA的施用濃度,均會影響基因沉默效應,也終將影響SIGS技術對病害的控制效果。Qiao等[44]在研究SIGS控制植物病害時,分別使用20、40 ng/μL和100 ng/μL dsRNA處理果實與花瓣、馬鈴薯葉片和番茄葉片以達到較好的防病效果。此外,由于病菌對化學農藥的抗藥性越來越嚴重,導致許多花費了巨大人力、物力、財力研發的藥劑已失去或即將失去應用效果,是否可以將這些藥劑與dsRNA進行復配從而提高病害的防控效果,延緩病菌抗藥性的產生？甚至靶向病原菌的抗藥性基因,使抗藥菌株失去抗藥性,從而使失去病害防控效果的舊的藥劑能重新在田間加以應用。

尋找廣譜性化學農藥和對病原菌高效、特異的控制靶點一直是人們追求的目標,人們希望使用一種農藥就可以防治多種有害生物。但大量廣譜性化學農藥的使用,造成了嚴重的生態災難,如有益微生物、天敵的無差別殺滅,生態環境中非靶標生物的種群數量的改變和多次使用單一藥劑導致的靶標對象的高抗藥性等。因此,應用SIGS技術控制植物病害時,同樣要考慮dsRNA的廣譜性和脫靶效應。如靶向FgCYP51B基因的dsRNA CYP-B噴施于大麥葉片表面,同樣可以沉默非靶標的FgCYP51A和FgCYP51C基因,而CYP-AC、CYP-AB和CYPBC同樣可以靶向非靶標基因FgCYP51B、FgCYP51C和FgCYP51A[49]。這樣的脫靶效應如果對其他生物起作用,則會出現與化學農藥同樣的環境破壞效果。而且,由于外源dsRNA在植物體內可以進行二次擴增,即使噴施的dsRNA并未與非靶標生物直接接觸,也會因為后期非靶標生物與寄主植物的接觸而引起脫靶效應。因此,借助生物信息學工具,精心設計和精準預測需要合成與使用的dsRNA是非常必要的,以免對相關或非相關生物產生非靶標效應[54]。

盡管施用外源dsRNA不是直接對生物體遺傳物質進行修飾,但仍可能存在一定風險。如Heinemann[56]所述:1)dsRNA并非如人們想象的那樣,只在細胞質中起作用,它可以與一些蛋白(如Dicer和NRDE-3)協同一起進入細胞核,從而對DNA和組織蛋白進行修飾;2)生物體的基因并不全部存在于細胞核中,如線粒體、葉綠體也都有自己的基因組,外源dsRNA有可能會對這些基因進行修飾;3)外源施用的dsRNA有可能會被逆轉錄,形成的DNA則可能會被整合到宿主基因組中,從而改變宿主的遺傳信息;4)dsRNA可以通過對基因進行敲除、改變拷貝數、影響染色質壓實程度及調控序列對轉錄因子的接受程度等,影響宿主遺傳物質組成及其表達;5)外源dsRNA可以在宿主細胞中遺傳,從而改變了生物體的遺傳信息等。當然,這些報道均基于通過轉基因手段獲得的外源dsRNA,直接外源噴施影響施用植物安全或食品安全的例子還未有報道。但Song等[48]發現,外源施用的dsRNA進入植物體內,植物可以利用自身的RdRP以dsRNA核酸鏈為模板進行擴增,產生大量二次擴增的dsRNA產物。至于這些二次擴增的產物是否在植物體內有其他效應,或者能否對植物體遺傳物質進行修飾,甚至直接遺傳給后代,均還有待于進一步研究。

5 展望

隨著現代生物技術的發展及寄主-病原物互作分子機制研究的深入,基于遺傳物質的病害防控技術因其專一性、高效性和環境友好性而廣受青睞。但在多數國家對轉基因農產品接受程度普遍較低的情況下,多種通過轉基因控制病害的技術措施在大多數作物上被限制應用。SIGS因為不需要轉基因,解決了許多植物不能進行遺傳操作的難題,而且dsRNA來源于病原菌本身,不會在土壤和環境中留下有毒殘留物而對環境造成污染,從而具有更廣闊的應用前景。雖然目前世界各國對dsRNA產品的應用與管理還未有共識,但包括歐洲科學界在內的各國科學家和相關組織已經開始評估此類產品的監管框架[55-56]。西方國家中,美國暫未有相關要求,但歐盟對噴施或外源施用的dsRNA農藥管理則參照生物化學農藥執行,其技術級材料和產品均需進行哺乳動物或非靶標生物毒性測定;如特定的產品配方阻礙或促進了dsRNA的吸收,還必須提供這些特定配方的非靶標生物毒理學數據,以更好的確認其潛在危害[62]。此外,如利用工程菌株生產dsRNA,工程菌作為中間體必須受有毒物質控制法案監管,在生產前提交微生物商業活動通知函[62-63]。在我國,目前還未有dsRNA農藥相關登記管理規定。但作為新興的植物病害防控措施,基于dsRNA的農藥在不久的將來肯定會在生產上廣泛應用,這也要求監管部門要立即對這一類農藥進行風險評估,以滿足生產與社會需求。