血管性癡呆動物模型研究概述

孫旭，王蕾，趙婧，韓雪

（1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250014；2.山東中醫藥大學第二附屬醫院，山東 濟南 250014）

血管性癡呆（vascular dementia，VD）是一種由腦血管因素引起的以高級皮層功能減退為主要表現的癡呆綜合征，是最常見的癡呆類型之一[1-2]。血管性癡呆以腦血流量（cerebral blood flow，CBF）明顯減少為典型特征。研究表明，亞洲地區65歲以上人群中癡呆的患病率約為5%，而血管性癡呆占癡呆患者的20%左右[3]。目前，有關血管性癡呆的發病機制尚未明確，而有關其臨床科研設計方面的動物模型亦無統一標準[1]。開展臨床研究的條件要求較多，而動物實驗的可控性較好。選擇合適的動物模型是進行醫學研究的前提。目前，動物模型仍為研究血管性癡呆發病機制、病理學改變、認知功能損害特點和防治措施等的有效工具。以下對近年來血管性癡呆動物模型的實驗動物選擇及各類血管性癡呆動物模型制備方法進行綜述。

1 血管性癡呆動物模型的實驗動物選擇

血管性癡呆研究的實驗動物主要以大鼠、小鼠、沙鼠作為研究對象。近年來有對靈長類動物開展的模型研究，但數量相對較少。目前，血管性癡呆模型的復制采用大鼠為主，因大鼠具有與人類相似度較高的血管分布。同時，大鼠來源經濟易得，且易存活，便于進行動物智能測試及電生理檢查。因而大鼠是建立腦缺血模型最理想的動物。此外，C57BL/6品系小鼠的應用也較廣泛。C57BL/6品系小鼠具有發育不良的Willis環，更容易誘導低灌注模型。

2 血管性癡呆動物模型及其制備方法

根據模型復制的病理機制，血管性癡呆動物模型主要分為慢性腦低灌注動物模型、慢性腦低灌注混合模型、局灶性腦缺血動物模型、缺血再灌注動物模型。

2.1 慢性腦低灌注動物模型及其制備方法慢性腦低灌注動物模型的復制通常采用雙側頸動脈閉塞法（bilateral carotid artery occlusion，BCAO），主要用于模擬皮層下血管性認知障礙（vascular cognitive impairment，VCI）的發病機制[4]。但BCAO只能揭示VCI單一的發病機制。Tomimoto H等[5]提出慢性腦低灌注通過激活Caspase通路而導致腦白質最先受累，可做為血管性癡呆和腦血管白質病變的模型。研究[6]表明，低灌注可導致內穩態的破壞，包括氧化應激、神經炎癥、神經遞質系統的功能失調、線粒體功能障礙、脂質代謝障礙和生長因子改變等。雙側頸動脈閉塞可通過兩血管阻斷法（2-VO）、兩血管狹窄法等實現。

2.1.1 兩血管阻斷法（two-vessel occlusion，2-VO）及其改良永久性結扎雙側頸總動脈（common carotid arteries，CCA）造成慢性腦低灌注狀態是目前2-VO的經典模型。最初Wakita H等[7]將2-VO作為可導致繼發性白質損傷的腦缺氧模型的建立方法。現2-VO經典模型已被用于研究白質損傷的生理病理學，并被用于探索血管性癡呆的治療干預措施[8]。Washida K等[9]用“0”號絲線結扎大鼠雙側頸總動脈，使腦皮質和胼胝體的腦血流量（cerebral blood flow，CBF）在術后1~3 d下降到原水平的30%~50%，3 d后腦血流量開始恢復，術后8周至3個月，則基本恢復。Xu C等[10]研究發現，大鼠在BCAO術后14 d，其腦血流量急劇下降，術后21 d恢復正常水平；BCAO術后大鼠出現明顯的學習記憶功能障礙，無明顯感覺運動功能障礙[11]，這些術后表現有助于血管性癡呆行為學的測試。在慢性腦低灌注狀態所致的血管性癡呆動物模型中，各種行為學測試（如Morris水迷宮實驗、八臂徑向迷宮實驗、T型迷宮實驗和新型物體識別測試）均表現出認知記憶受損，相比急性期，慢性期的認知損害更嚴重[9]。組織學研究[12]結果顯示，2-VO術后大鼠的海馬CA1區神經元固縮，細胞表面積減小，核仁缺失，14 d后出現白質脫髓鞘改變。需要注意的是，由于2-VO術后大鼠的視神經嚴重損傷，行為學評估應當謹慎。

結扎雙側頸總動脈可造成大鼠嚴重腦損傷及應激反應，從而導致大鼠死亡率升高。針對此問題，近年來學者不斷對2-VO進行改良，以使之更好地適用于臨床科研。其中，Sarti C等[13]改良的動物模型具體操作如下：用氟烷麻醉大鼠后，取頸部正中切口，避開甲狀腺分離皮下脂肪組織，切斷肩胛舌骨肌，在光學顯微鏡下暴露頸總動脈，用絲線結扎一側頸總動脈，1周后（鄭敏等[14]提出將分次結扎間隔時間設定為3 d）行相同的手術結扎對側頸總動脈。與傳統方法相比，改良后的2-VO阻斷法大大降低了大鼠的死亡率，且可造成與傳統2-VO法造模所致的大鼠海馬區神經元相似的明顯變性、壞死和凋亡[15]。在Morris水迷宮的定位航行實驗、空間搜索實驗中的結果也證實了分次結扎頸總動脈法對動物行為學的影響與傳統造模方法比較無顯著性差異[16]。

Kitamura A等[17]通過逐漸狹窄的雙側頸總動脈閉塞法（two-vessel gradual occlusion，2VGO）復制出與人類慢性腦灌注不足更相似的動物模型，從而避免了2-VO大鼠急性腦血流量減少和出現急性炎癥反應的缺陷。2VGO模型可誘導選擇性白質損傷，而神經血管偶聯仍相對保留。該模型在術后28 d表現出與2-VO大鼠相似的空間記憶損傷。Tukacs V等[18]發現2VGO適用于長期慢性缺血的模型，且在降低腦血流量方面比雙側頸動脈狹窄法（bilateral carotid artery stenosis，BCAS）效果明顯，可應用于觀察低灌注對視網膜和視皮層功能的影響。2VGO模型可出現脫髓鞘改變，伴有炎癥和神經膠質反應，但無明顯的梗死病變或灰質的代謝紊亂。因此，與2-VO比較，該模型更能準確模擬人類缺血性白質改變后的工作記憶損傷。

2.1.2 兩血管狹窄法雙側頸動脈狹窄法（BCAS）是通過在頸動脈周圍放置部分阻塞的微線圈引起的，線圈的直徑可影響阻塞的嚴重程度。Poh L等[19]認為，0.18 mm線圈在術后2 h內可引起腦血流量減少（與基線水平相比），1~3個月后，腦血流量可恢復到基線水平的80%~85%，而血壓未受到影響。Poh L等[20]的另一研究采用專門為小鼠設計的微膠囊（日本Sawane Spring有限公司生產）誘導慢性低灌注模型，發現小鼠術后15、30 d的腦血流量明顯減少，證實了小腦凋亡參與慢性低灌注血管性癡呆小鼠的代謝過程，且BCAS誘導的腦血流量下降水平優于大鼠雙側頸動脈閉塞（BCAO）模型。BCAS可誘發腦白質病變，其嚴重程度與腦灌注不足程度密切相關[21]，因此，BCAS模型主要以空間工作記憶障礙為主。在Morris水迷宮實驗、八臂徑向迷宮實驗中可觀察到BCAS模型動物在術后1個月，其空間工作記憶能力下降，在5~6個月后，仍可觀察到其廣泛的記憶受損。組織學研究[19]顯示，BCAS后有廣泛的神經元缺失，即在海馬CA1、CA2、CA3區可見神經元明顯受損；7 d后，CA2、CA3區神經元出現更明顯的損傷；8個月后可觀察到明顯的海馬萎縮；甲酚紫和MAP2染色結果顯示海馬神經元丟失。

2.2 慢性腦低灌注混合模型Torre J C等[22]發現BCAO可使大腦海馬區供血減少22%~30%，4周后血流維持穩定。鑒于結扎雙側頸總動脈后Willis環的代償作用，腦血流下降是短暫的，通過動物腹腔注射硝普鈉（sodium nitroprusside，SNP）、尾動脈放血、頸動脈加壓等方法可降低全身血壓，減弱Willis環的代償作用，從而增加造模的成功率和模型的可靠性。

2.2.1 2-VO+腹腔注射硝普鈉（SNP）模型王蕊等[23]通過先采用腹腔注射硝普鈉（2.5 mg/kg），后采用無創動脈夾結扎雙側頸總動脈的方法創建腦低灌注的動物模型。此法采用腹腔注射硝普鈉能降低大鼠血壓，減少腦灌注，可抑制Willis環的調節、代償作用，30 min后大鼠血壓恢復到給藥前水平。Wei B Y等[24]發現，2-VO+腹腔注射硝普鈉模型大鼠的空間學習能力和參考記憶均受損，且空間學習能力受損程度較2-VO大鼠嚴重。2-VO+硝普鈉（2.5 mg/kg）組大鼠認知功能障礙較2-VO+硝普鈉（2.0 mg/kg）組大鼠更為穩定，前者可引起更全面的認知障礙。此混合模型主要以學習記憶能力低下為主要特點，無明顯運動行為學損傷。術后第7天左右，通過Morris水迷宮實驗和跳臺實驗可觀察到學習和記憶功能受損。該模型形態學的變化表現為大鼠海馬CA1區細胞線模糊，錐體細胞缺失，細胞數量明顯減少；尼氏體染色可見其胞質內尼氏體減少，尤以CA1區最明顯。

2.2.2 2-VO+尾動脈放血此方法主要用于復制小鼠VD模型。雙側頸動脈閉塞法加上尾動脈放血可有效復制腦缺血模型，表現為腦低灌注顯著，術后小鼠有明顯的學習記憶障礙。此外，該法復制的模型可降低實驗動物應激所致的高血壓。為保證動物的存活，放血量應控制在10%以內，術畢應腹腔注入生理鹽水以補充血容量。但此法可增加感染率，同時對動物水迷宮實驗會造成一定的影響[25]。

2.2.3 2-VO+Aβ1-42腦室內注射Dai S J等[26]發現雙側頸動脈閉塞法聯合腦室內注射β淀粉樣蛋白1-42（Aβ1-42）可 促 進 大 鼠 阿 爾 茲 海 默 癥（Alzheimer’s disease，AD）的發展。Aβ1-42可加速大鼠認知功能的損害，雙側頸動脈閉塞法引起的腦缺血可促進海馬CA1區Aβ的產生和錐體細胞的死亡，促進AD的發展。此法為AD伴腦缺血提供了一種耗時更少的模型，故認為，此法可為混合型癡呆提供一種合適的動物模型。

2.2.4 2-VO+雙腎雙夾（2K2C）法及其改良Lin J等[27]先通過雙腎雙夾（2K2C）法復制自發性高血壓（RHRSP）大鼠模型，在12周后通過尾端血壓計測量模型大鼠的收縮壓，在此基礎上進行雙側頸總動脈閉塞手術（2-VO）；改良后的2-VO則是在結扎一側頸總動脈1周后進行另一側結扎。此法可導致廣泛的腦白質病變，與RHRSP大鼠相比，RHRSP+改良2-VO大鼠在術后12周均表現出更高的穩定性和更廣泛的白質損傷，但死亡率無明顯增加。Morris水迷宮實驗發現RHRSP+2-VO組及RHRSP+2-VO改良組存在空間認知障礙，且RHRSP+2-VO改良組逃避潛伏期明顯高于RHRSP+2-VO組。組織學研究結果顯示，RHRSP+改良2-VO組和RHRSP組術后8周和12周均出現明顯脫髓鞘、空泡形成、神經纖維消失等表現。Flores G等[28]認為此模型所表現的長程和短程連通性不足可能是導致其認知障礙的重要原因。該模型可以更精確地模擬小血管的病理變化。但這個模型有一個固有的局限性，即不能忽視的遺傳因素在RHRSP模型中發揮的作用。

2.3 局灶性腦缺血模型局灶性腦缺血模型模擬了人類永久性腦梗死的病理生理過程，梗死灶固定，重復性好，可模擬關鍵部位梗死導致的血管性癡呆。其缺點是該模型在梗死部位、梗死體積和病變嚴重程度等方面均與人類腦卒中存在差異，且動物術后可能出現嚴重偏癱癥狀，從而影響其行為學的檢測。

2.3.1 大腦中動脈梗死法趙玲、尹軍祥等[29-30]采用大鼠麻醉后開顱暴露大腦中動脈（MCA），將蘸有氯化鐵溶液的濾紙敷在MCA上，待MCA變黑，取下濾紙，縫合傷口；蔡晶等[31]采用電凝器熱凝固MCA主干；尹軍祥等[30]將尼龍線從頸內動脈插入后實現大腦中動脈阻塞導致腦缺血，2 h后向外提拉線頭使大腦中動脈再灌注，復制大腦中動脈梗死線栓模型。大腦中動脈梗死法所致的腦缺血效果可靠，MCA供血區有典型的神經細胞缺血、梗死灶，模型動物有明顯的學習記憶障礙，缺血灶明確、可重復性強，但本法操作技巧性要求高，對大鼠造成的創傷較大，死亡率較高。

2.3.2 多發性腦梗死栓塞法趙小貞等[32]通過顱外安置小磁鐵吸附經大鼠尾靜脈注射的四氧化三鐵法實施多發性腦梗死栓塞法，術后大鼠活動能力低下，自發運動減少，多數于24 min后恢復正常。與雙側頸動脈閉塞法相比，此法導致了更嚴重的學習記憶障礙，組織形態學顯示海馬CA1區錐體細胞數量減少甚至脫失。此法操作簡單，創傷少，重復性好，模型時間周期短，在大腦皮層及海馬區域可見相應梗死、軟化灶，能較好地模擬人類多發性腦梗死。此外，國內還有其他實施血管內栓塞導致血管性癡呆的造模方法，如左心室注射液體石蠟模型、舌下靜脈注入鐵粉模型線栓法等。

2.4 缺血再灌注動物模型缺血再灌注動物模型主要用于模擬臨床血管再通性損傷及短暫性腦缺血發作等研究。缺血再灌注損傷機制包括自由基的生成、興奮性氨基酸毒性、鈣離子超載等多種因素。該模型的再灌注損傷明顯，腦血流量可見明顯下降，可較好地模擬人類再灌注損傷，但該模型的穩定性有待進一步研究。

Liu H等[33]用尼龍線通過頸內動脈進入大腦中動脈，阻斷90 min后緩慢抽出，使缺血腦組織再灌注，并按照Poh L等[20]的方法對實驗前后大鼠的神經功能進行評定，通過水迷宮實驗及跳臺實驗評價大鼠的認知功能。Chen C Y等[34]通過阻斷右側大腦中動脈和右頸總動脈血流，缺血一段時間后恢復血流，建立雙血管閉塞小鼠腦缺血再灌注模型。Khan S等[35]用微細絲阻斷血管，間隔不同時間后予以再通，發現缺血時間短于10 min很難產生缺血性腦損傷，即使在7 d之后也如此。大腦中動脈閉塞（MCAO）再灌注模型可誘發穩定大小的梗死，產生高度可重復性的皮層梗死和行為缺損，與雙血管閉塞引起的梗死體積無顯著性差異；在降壓實驗、Morris水迷宮實驗中，該模型大鼠可表現出明顯的學習記憶障礙；Nissl染色后，可觀察到MCAO再灌注大鼠海馬皮層及海馬CA1區出現明顯的神經元缺失，突觸表達相關蛋白含量也明顯降低。

各類血管性癡呆動物模型的造模方法、特點及臨床應用比較見表1。

表1 各類血管性癡呆動物模型的比較Table 1 Comparison of the vascular dementia models estalished by various methods

3 結語

綜上所述，血管性癡呆動物模型制備方法近年來已得到較大發展。血管性癡呆動物模型因制備方法的不同，其病理組織學改變和認知功能損害程度也有所不同，存在各自的優缺點，研究者需針對血管性癡呆的亞型和研究目標做出相應的選擇。目前，中醫藥干預血管性癡呆仍普遍采用西醫模型的制作方法，評價指標大部分也未涉及中醫證候評定。在今后構建中醫復合模型方面，可通過手術、藥物、高齡等造成腎精虧虛；通過過勞或攝入不足造成氣虛模型；通過高脂飲食構建痰濁阻竅型模型；通過2-VO聯合高血壓病或自發性高血壓病大鼠構建肝陽上亢型模型。但中醫體質的形成是多種因素長期作用下的結果，臨床實驗動物造模時間普遍較短，大部分動物模型與中醫證候的吻合程度較低，例如腰膝酸軟、頭暈耳鳴、舌脈、二便等證候指標難以定量，亦缺乏一定的量化指標，在一定程度上限制了中醫復合模型的發展。因此，深入量化動物模型的中醫考核指標，結合爪甲、飲食、行為學觀察，建立一種指標穩定、模型重復率高的可量化模型是中醫復合模型未來發展的重點。