水酶法提取南板藍根葉中靛藍色素

劉卉琳 ，黃染林 ，曲 超 ，劉 紹

（1. 湖南農業大學食品科學技術學院，湖南 長沙 410128；2. 湖南匯湘軒生物科技股份有限公司，湖南 長沙 410323）

藍色是三原色之一，在食品、印染等行業有著重要的用途。自然界中并不缺少藍色素，然而目前用于食品加工的藍色素多為合成藍色素[1]，完全符合工業需求的天然藍色素卻很少見。隨著人們對食品質量和商品安全性的要求不斷提高，天然色素的提取和應用逐漸成為研究熱點[2-4]。例如：陳林[5]從板藍根中提取靛藍色素對牛仔布紗線進行染色試驗，結果表明，天然靛藍具有良好的染色深度和染色牢度，可替代化學靛藍用于牛仔布的染色，特別是用于貼身穿著的襯衣和牛仔褲的中淺色染色，對人體無毒無害。

南板藍根別稱馬藍、大青葉，是爵床科多年生草本植物，根莖葉均具有一定藥用價值[6]。研究發現，該藥材除了具有生物堿、黃酮、萜類、木脂素類等多種活性成分外[7-11]，其靛藍色素的含量也較高，且在特定光波長下其吸光度與靛藍濃度（100～150 mg/mL）有較好的線性關系[12-13]。

常見的靛藍提取方法主要有微生物發酵和有機溶劑提取2 種[14-19]。其中，有機溶劑提取法成本較高，提取率低，且化學物質殘留較多，有些還具有一定毒性，對靛藍后續應用產生不利影響，對環境也不友好。而微生物發酵一般是將含靛藍的植物置于室溫發酵池內浸泡7 d，待發酵池滋生大量微生物，散發出腐爛腥臭味后撈出，再往發酵池中加入一定比例的生石灰，用力攪拌1 h，直到有藍色泡沫浮起為止。該提取方法耗時較長，產生的工業廢水多，環保壓力大。因此，如何縮短提取時間、提高提取效率，并盡量降低污染是目前天然靛藍色素提取急需解決的關鍵問題。筆者以南板藍根為原料，首次探索了水酶法提取南板藍根中靛藍色素的工藝流程，并通過單因素試驗和正交試驗優化了工藝參數，該方法大大縮短了靛藍提取時間，提高了效率，且提取過程符合綠色環保要求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試原料為南板藍根干葉，于2021 年5—6 月在貴州采摘干燥。主要試劑有復合酶制劑（食品級，湖南尤特爾生物科技有限公司）、靛藍標準品（上海染料研究所）。主要儀器設備有電子天平（上海菁海儀器有限公司）、分析天平（湘儀天平儀器設備有限公司）、恒溫水浴鍋（北京國華醫療器械廠）、紫外可見分光光度計（天津冠澤科技有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 南板藍根中靛藍色素提取的工藝流程稱取南板藍根干葉，以蒸餾水為溶劑按一定比例混合，加入一定量的復合酶，調整pH 值后在水浴鍋中進行恒溫提取，提取結束后用紫外可見分光光度計測定提取液吸光度，測定3 次，取平均值。

1.2.2 檢測波長的確定采用紫光分光光度計進行吸光度測定。配制濃度為0.05 mg/mL 的靛藍標準溶液，置于312～812 nm 波長[20]范圍內進行吸光度的比較，確定靛藍色素最大的吸收波長為檢測波長。

1.2.3 樣品中色素提取率的計算精確稱取0.000 2 g（精確至0.000 1 g）純度為95%的靛藍標準品，轉移至1 000 mL 容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，配制成0.2 mg/L 靛藍標準溶液備用。從中分別取1、2、3、4和5 mL 定容至100 mL 容量瓶中，配制成濃度為0.002、0.004、0.006、0.008 和0.010 mg/L 的靛藍標準溶液，以蒸餾水作為參照，以濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，得到標準曲線。然后測定水酶法提取液在最大吸收波長處的吸光度值，代入標準曲線獲得提取液中的色素濃度，再根據公式（1）計算靛藍提取率。

式中，c為粗提靛藍濃度（mg/L），10 為稀釋10 倍，V為提取液體積（L），m為南板藍根質量（g）。

1.2.4 單因素試驗（1）提取溫度。在料液比為1 ∶20（g/mL）、加酶量為6 g/L、pH 值為5、提取時間為3 h 的條件下，將提取溫度設置為30、40、50、60 和70℃，研究提取溫度對靛藍色素提取率的影響。（2）提取時間。在料液比為1 ∶20、加酶量為6 g/L、pH值為5、提取溫度為50℃的條件下，分別提取1.5、2.0、2.5、3.0 和3.5 h，研究提取時間對靛藍色素提取率的影響。（3）加酶量。在料液比為1 ∶20、pH 值為5、提取溫度為50℃、提取時間為3 h 的條件下，分別添加4、5、6、7 和8 g/L 的復合酶，研究加酶量對靛藍色素提取率的影響。（4）pH 值。在料液比為1 ∶20、加酶量為6 g/L、提取溫度為50℃、提取時間為3 h 的條件下，調整pH 值為3、4、5、6 和7，研究pH 值對靛藍色素提取率的影響。（5） 料液比。在加酶量為6 g/L、pH 值為5、提取溫度為50℃、提取時間為3 h的條件下，分別配置1 ∶10、1 ∶20、1 ∶30、1 ∶40 和1 ∶50的料液比，研究料液比對靛藍色素提取率的影響。

1.2.5 正交試驗根據單因素試驗結果，選取對靛藍色素提取率影響較大的3 個因素進行正交試驗，以靛藍色素提取率為考察指標，確定最優工藝參數。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的確定

由圖1 可知，靛藍標準溶液在612 nm 處呈現最高峰，因此將靛藍色素的檢測波長確定為612 nm。

圖1 標準靛藍溶液吸收光譜曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 提取溫度由圖2 可看出，隨著提取溫度的增加，靛藍的提取率先升高后降低；當提取溫度為30～70℃時，提取率從0.105%升到0.207%后又降至0.075%，變化差異顯著（P＜0.05），說明提取溫度對靛藍提取的影響較大，當提取溫度為50℃時提取率達到最大值。這是因為50℃為復合酶的最適作用溫度，若溫度繼續升高，酶的構象發生改變，酶活性大大降低，導致提取率下降。因此，后續試驗選定50℃為南板藍根中靛藍提取的最佳溫度。

圖2 不同提取溫度下的靛藍提取率

2.2.2 提取時間由圖3 顯示，隨著提取時間的增加，靛藍提取率先升高后降低，提取時間從1.5 h 增至3.5 h，靛藍提取率從0.173%升高至0.196%再降至0.183%，最大值與最小值之間差異達顯著水平（P＜0.05），但提取率居中的3 個處理間差異不顯著（P＞0.05），說明提取時間對靛藍提取的影響較小。當提取時間為3.0 h 時，靛藍提取率達到最大值，3.0 h 后提取率呈現細微下降趨勢。這說明提取時間達到3.0 h，酶與南板藍根已充分接觸和反應，靛藍溶出已達到極限。超過一定時間，部分靛藍色素分解。因此，在該試驗條件下南板藍根中靛藍提取的最佳時間應為3.0 h。

圖3 不同提取時間下的靛藍提取率

2.2.3 加酶量由圖4 可看出，當加酶量為4～8 g/L 范圍內，靛藍提取率隨著加酶量的增加呈先升高后稍降低并趨于平緩的趨勢；以加酶量為6 g/L 的處理提取率最大，為0.189%；以加酶量為4 g/L 的處理提取率最低，為0.170%；二者差異達顯著水平（P＜0.05），但其他3 個加酶量處理間的差異不顯著（P＞0.05），說明加酶量對靛藍色素提取的影響較小。在加酶量為6 g/L 時靛藍提取率達到最高，表明提高加酶量可以增加分子之間的碰撞，加快反應速度，顯著催化靛藍的生成，但當南板藍根與復合酶充分結合后，繼續增加酶用量對靛藍生成沒有明顯作用。因此，在該試驗條件下南板藍根中靛藍提取的最適加酶量應為6 g/L。

圖4 不同加酶量下的靛藍提取率

2.2.4 pH值 由圖5 可得，依次調整pH 值為3～7，靛藍提取率從0.106%升高至0.202%再降至0.125%，靛藍提取率變化顯著（P＜0.05），說明酶活力受pH值影響較大。這一變化的原因在于該試驗用的復合酶以纖維素酶為主，其最適pH 值為5，高于或低于最適pH 值酶活性均受到影響，導致底物無法與酶有效結合，故靛藍提取率降低。因此，后續試驗應將pH值控制在5 左右。

圖5 不同pH 值下的靛藍提取率

2.2.5 料液比由圖6 可得，靛藍提取率在料液比為1 ∶20 時達到最大值，為0.187%，提高或降低料液比均會使靛藍提取率下降；料液比為1∶50時提取率最低，與最大值差異顯著（P＜0.05），說明料液比對靛藍提取的影響較大。當溶劑過少時，南板藍根無法充分溶解在溶劑中，產生的靛藍較少；而溶劑過多時，南板藍根與溶劑已反應完全，靛藍無法繼續溶出，與此同時，繼續加入溶劑會帶來新的雜質，稀釋靛藍的濃度，使提取液中靛藍的相對濃度降低。因此，在該試驗條件下南板藍根中靛藍提取的最佳料液比應為1 ∶20。

圖6 不同料液比的靛藍提取率

2.3 正交試驗結果

單因素試驗表明，提取時間和加酶量對靛藍提取率的影響較小，因此選用提取溫度（A）、料液比（B）、pH 值（C）進行3 因素3 水平正交試驗（表1）。由表1 的極差（R）值可知，各因素對靛藍提取率影響程度最大的是提取溫度，其次是pH 值，最后是料液比；最優工藝條件組合為A2B2C2，即提取溫度50℃、pH值為5、料液比1 ∶20。由于該條件不在正交試驗設計的9 個處理中，故需進一步進行驗證試驗。驗證結果顯示，在最優條件下測得提取率為0.218%，比正交試驗9 個處理中最佳組合（A2B1C2）的提取率（0.214%）稍高，說明A2B2C2具有可行性，是該研究獲取的南板藍根中靛藍提取最優工藝參數。

表1 正交試驗設計及結果

由表2 可知，3 個因素對靛藍色素提取效果的影響程度不同。其中提取溫度對靛藍吸光度影響極顯著（P＜0.01），pH 值對靛藍吸光度的影響顯著（P＜0.05），料液比對靛藍吸光度影響不顯著（P＞0.05）。由F值大小可知，不同因素對吸光度影響的主次水平為A ＞C ＞B，提取溫度對吸光度的影響最大，料液比對吸光度的影響最小。

表2 正交試驗方差分析結果

4 結論與討論

研究采用了水酶法對南板藍根中的靛藍色素進行提取，以提取率為考察指標，分析提取時間、提取溫度、加酶量、pH 值和料液比對靛藍色素提取效果的影響，優化了水酶法提取靛藍色素工藝，結果表明，在料液比1 ∶20、加酶量6 g/L、pH 值5、提取溫度50℃和提取時間3 h 的條件下，靛藍提取率最高，為0.218%。該方法大大縮短了提取時間，提高了提取效率，且產生的污染較少，達到了綠色環保要求。所提取的靛藍色素可廣泛應用于食品、日化、印染等領域。